用外源性CD5信号肽的PCG2表达载体克隆了hKU1-A尖峰蛋白（GenBank：ADN03399.1）编码过域（残基12–1266）的序列。在3'末端，用GCN4三聚化图案（Ikrmkqiedkieeieskqkkieneiarikkik）35,36在框架中连接编码序列，这是一个凝血方裂解位点（lvprgsle），一个8-链球菌的长链球tag-trep-tag-tag（wshpqfek）和一个poton。将S1/S2连接处的FURIN裂解位点从RRKRR到GGSG突变，以避免峰值蛋白的裂解（补充图17）。所得构建体用于HEK293T细胞中的瞬时表达，并如前所述纯化37。简而言之，在细胞孵育5天后，使用链霉亲素珠（IBA）从清除的细胞培养上清液中纯化峰值糖蛋白，并在20 mM Tris -HCl，pH 8.0，150 mm NaCl中洗脱，150 mm NaCl，1 mm EDTA，1 mm EDTA，2.5 mm -mm -biotin。如先前所述，产生了W89a突变蛋白17。

　　对于APO复合物，将3 µl的4.3 µm HKU1尖峰三聚体应用于量子R1.2/1.3网格，该网格在20 mW电源的Gloqube（Quorum）上在Gloqube（Quorum）上发光30 s。在Vitrobot Mark IV（Thermo Scientific）内，在4°C和95％的相对湿度下应用样品。然后将网格用+2的印迹力印迹7 s，并在液体乙烷中陷入困境。对于Holo复合物和W89A阴性对照，将7 µL的4.3μM野生型或突变体HKU1尖峰三聚体与3 µL 1 mm糖合并，导致最终的尖峰蛋白浓度为3μm，糖浓度为300μm。然后将样品在室温下在玻璃化之前孵育约10分钟，如APO样品所述进行。

　　使用EPU 2采集软件，将APO和HOLO HKU1尖峰样品成像配备了K3 Direct Electron检测器（GATAN）的Thermo Scientific Krios G4冷冻TEM和Biocontinuum Energy Filter（Gatan）。将阶段预先倾斜至30°，以改善颗粒的方向分布。总共有4,207个Apo Spike视频和4,065个Holo Spike视频，以每个像素的超分辨率像素大小为0.415Å，每个视频分数为40个，总剂量为46个电子。散焦目标从-1.5循环至-2.5μm。

　　使用EPU 2采集软件，配备了配备Falcon 4 Direct Electron检测器的Thermo Scientific Glacios Cryo-TEM仪器，在Thermo Scientific Glacios Cryo-TEM仪器上成像，与Disialoside孵育的W89A突变体HKU1 SPIKE成像。将阶段预先倾斜至30°，以改善颗粒的方向分布。总共以每个像素为0.92Å的总共收集了896个视频，每个视频分数为40个，总剂量为42个电子。散焦目标从-1.5循环至-2.5μm。补充表2中显示了所有数据收集参数的摘要。

　　对于APO复合物，使用0.5的输出F-CROP系数进行贴片运动校正，并在CryoSparc Live38中进行了斑块CTF估计。丢弃了CTF估计分辨率较差的显微照片，丢弃了4,202张图像以进行进一步处理。然后使用斑点拾取器工具选择9,144,772个颗粒，然后将其提取在100像素盒中（傅立叶BINNED 4×4），然后导出到CryoSparc进行进一步处理。进行了一轮二维（2D）分类，此后保留了183,886个颗粒。从头开始重建产生了一个定义明确的HKU1尖峰蛋白的重建。然后将属于此类的粒子重新提取在300像素盒中。在提取过程中，粒子是通过非全能值进行傅立叶归纳的，最终像素大小为1.1067Å。随后，在带有C3对称性的提取的颗粒上进行了不均匀的细化39，产生了3.3Å的全局分辨率的重建。随后，通过使用对称的扩展作业分配了与C3对称性重建的每个粒子分配了与其对称相关视图相对应的三个方向。在UCSF Chimera40中制作了一个软面膜，其中包含一个S1A结构域，并用于局部对扩展的粒子的细化，得出的地图产生了3.8Å的全局分辨率。

　　对于Holo复合物，使用输出F-CROP系数为0.5，贴片运动校正，在CryoSparc Live38中进行了斑块CTF估计。丢弃了CTF估计分辨率较差的显微照片，丢弃了4,045张图像以进行进一步处理。然后使用斑点拾取器工具选择956,697个颗粒，然后将其提取在100像素盒中（傅立叶binned 4×4），然后导出到CryoSparc进行进一步处理。进行了四个平行的2D分类，使用1、2、4或6的初始分类不确定性值。随后，从每次2D运行和组合中选择了定义明确的Spike类。然后除去重复的颗粒，然后保留169,728个颗粒。从头算重建产生了与封闭和3-UP Spike Trimer相对应的两个类。这两个类别的颗粒被用作第二轮AB的重建的输入，该输入产生了与3-UP和1-Up Spike Trimer相对应的两个类别，尽管后者似乎是1-UP和封闭粒子的卷积。然后将这两个体积用作一轮异质细化的初始模型。为了避免在最初严格选择2D类中可能已去除的尖峰颗粒，在较大的895,888颗粒的较大粒子堆栈上进行了异质细化，仅从初始堆栈中除去了碳等级。异质性改进产生了两个定义明确的3-UP和1-UP构象的重建。对应于3-UP类的颗粒进行单回合2D分类，并选择了明确定义的尖峰蛋白类。然后将它们重新提取到300像素盒中。在提取过程中，粒子是通过非全能值进行傅立叶归纳的，最终像素大小为1.1067Å。随后， 用C3对称性施加的颗粒在提取的颗粒上进行了不均匀的细化39，从而产生了3.7Å的全局分辨率的重建。由于在1-UP样品中明显的异质性，在895,888个粒子堆栈上进行了额外的异质性完善，使用了更高质量的初始模型，即完全完善的3-UP图，并从第二轮AB Initio重建的第二轮获得的1-UP图获得。异质性改进产生了3-UP和1-UP构象的明确定义的重建。对应于这两个类别的粒子单独进行单回合2D分类，并选择了明确定义的尖峰类。然后将它们单独地在300像素盒中重新提取。在提取过程中，粒子是通过非全能值进行傅立叶归纳的，最终像素大小为1.1067Å。随后，对施加的C3或C1对称性的提取颗粒进行了不均匀的细化，分别对3.56和4.13Å进行重建，分别用于3.56和4.13Å，分别为3-UP和1-UP构象。在全球改进之后，在UCSF Chimera中制作了一个柔软的面膜，其中包含一个3-UP样品的一个S1A结构域。然后在3-UP颗粒上进行局部细化，得出全局分辨率为4.19Å的地图。属于1-UP重建的颗粒进行了另一轮异质细化，这产生了两种封闭和1-UP尖峰蛋白的清晰重建。对施加的C3或C1对称性的两组颗粒进行了不均匀的细化，对封闭和1 UP构象的全局分辨率分别产生了3.68和4.68Å的重建。对于封闭的尖峰蛋白， 通过使用对称的扩展作业，分配了与C3对称性重建的每个粒子，分配了与其对称相关的视图相对应的三个方向。在UCSF Chimera40中制作了一个软面膜，其中包含一个S1A结构域，并对对称性膨胀的颗粒进行掩盖的3D变异性分析41。然后，对属于最佳分辨率群集的颗粒进行局部细化，产生的地图为4.13Å。

　　对于与Disialoside孵育的W89A突变体HKU1 SPIKE，在MotionCor2中进行了斑块运动校正（参考文献42），该版本3.1.1（参考文献43）实现。然后将经过运动校正的显微照片导入CryoSparc，以进行贴片CTF估计和进一步的处理步骤38。斑点拾取器工具用于选择215,843个颗粒，然后在100像素盒中提取（傅立叶binned 4×4）。进行了一轮2D分类，此后保留了38,838个颗粒。从头开始重建产生了一个定义明确的HKU1尖峰蛋白的重建。然后将属于此类的粒子重新提取在300像素盒中。在提取过程中，粒子是由非全能值缩进的，最终像素大小为1.2267Å。随后，随后在带有C3对称性的提取的颗粒上进行了不均匀的细化39，产生的重建具有5.1Å的全局分辨率。随后，通过使用对称的扩展作业分配了与C3对称性重建的每个粒子分配了与其对称相关视图相对应的三个方向。然后在UCSF Chimera40中制作了一个包含一个S1A结构域的软面膜，并用于局部对扩展的颗粒的细化，产生的地图为5.4Å。

　　使用“金标准”傅里叶壳相关（FSC）标准（FSC = 0.143）来计算所有分辨率估计，并在CryoSparc44中生成3D-FSC图。为了促进模型构建，使用DeepeMhancer（0.13）45（在COSMIC246中实现）或通过CryoSparc中的本地分辨率过滤，对全球精制的地图进行了锐化。

　　最初，Phyre 2（参考文献47）与Embecovirus OC43 Spike结构（蛋白质数据库（PDB）6NZK）24作为模板生成了HKU1-A-A峰值蛋白的同源模型。HKU1-A尖峰同源模型使用UCSF CHIMERA40工具拟合在地图中。由于明显错误的同源性建模，使用HKU1-A S1B（PDB 5KWB;Ref。24）的晶体结构替换同源模型中的等效S1B结构域。通过使用COOT48和使用phenix49进行真实空间改进的手动模型构建的迭代循环来完善模型。COOT碳水化合物模块50用于构建N连接的聚糖，该聚糖经过手动检查和校正。由于其最高分辨率，首先对Apo状态进行了建模。随后，使用先前的模型作为起点，以该顺序对封闭的Holo，Holo 3-Up和Holo 1-UP进行建模。对于最初的Holo（封闭）S1A模型，使用NAMDINATOR51在封闭的Holo S1A的本地精制和未共享的地图中进行柔性拟合。使用Molprobity和Private 52,53,54进行模型验证。

　　Elbow55 was used to generate ligand restraints for the 9-O-acetylated terminal sialic acid based on the ‘MJJ’ ligand in the OC43 spike cryo-EM structure (PDB 6NZK)16, after which atom names were manually modified to be consistent with the earlier standard MJJ model and general sialic acid atom numbering, and the O2-attached methyl linker atoms of the original MJJ配体被修剪。由于目前使用的软件包中定义了标准的MJJ – SIAα2,8链接，因此我们使用基于分子动力学的约束（请参阅下文）来建模Disialoside的这种糖苷链接。基于最常见的溶液构象异构体：键距离C2-O8的1.38Å（σof0.01Å），使用以下限制物用于末端9-O-乙酰化的唾液酸（配体密码MJJ）和倒数第二个唾液酸（配体密码SIA）之间的糖苷连接。O8 -C2 – O6和O8 – C2 – C3的键角为109.5°，O8 -C2 – C1（全σ为2.0°）为114.5°；C1 – C2 – O8 – C8的二面角为295.0°，C2 – O8 – C8 – C7（5.0°的σ的）为122°。

　　分子系统的起始结构是基于使用Yasara56的图形界面的HKU1（此工作）的冷冻EM结构构建的。N-聚糖是根据HKU1 Spike Protein31的定量位点特异性N-连接分析的数据附着在蛋白质上的。基于S1A的Holo和Apo版本（残基14-299），建立了具有α-Neu5,9Ac-（2-8）-neu5ac-ome的复合物的模型。配体被手动定位在由PDB条目6NZK（HCOV-OC43）中的相互作用引导的结合位点中。HKU1 N1序列取自GenBank条目NC_006577.2。

　　每个系统都位于周期性的矩形长方体模拟框中（溶质周围的10Å缓冲液），并选择了Amber14力场，该框使用FF14SB（参考文献57）和GlyCAM06J（参考文献58）参数（包括混合1-4个尺度）。Yasara为系统设置提供了几种自动化工作流（称为实验）。使用“中和实验”来调节氨基酸的质子化状态（pH 7.4）59，并将系统溶解在0.9％NaCl溶液中（0.15 m）。使用“最小化实验”（最小陡峭的下降最小化，然后模拟退火最小化，直到达到收敛）来消除系统中的构象应力。使用周期性边界条件和粒子网埃瓦尔德算法60在310 K下进行仿真以处理远程静电相互作用。使用调谐的Berendsen Thermostat61重新缩放温度。将盒子尺寸动态重新缩放，以保持水密度为0.996 g ml -1（压力耦合的“齿状”方法）62。在平衡阶段至少3 ns的位置约束（在所有蛋白质重原子上，然后仅在骨架原子上）。为了防止配体的解离，应用距离约束以维持临界H键以结合（原子K80：O和SIA_______________：k80：nz和sia_2：o1a; t82：og1; og1和sia_2：o1b）。使用Yasara在“快速模式”（混合的多个时步算法达到5 fs的混合算法）上，在配备的“标准计算箱”上使用Yasara进行了加速度（混合的多个时步算法），例如，一个12核I9 CPU和NVIDIA GEFORCE GTX GTX 1080 TI。谐波位置约束（拉伸力常数= 1 n m -1） 将其应用于S1A系统的48-65和264-299残基的蛋白质骨干原子，以防止在Cuboid盒中进行系统旋转并处理残基299处的“人为松动末端”。对蛋白质Cα原子的平均均方根均方根偏移进行了监测以检查模拟的整体稳定性。

　　为了可视化封闭的尖峰蛋白的聚糖覆盖范围，模拟了完全糖基化的外生域系统（590,814个原子），在残基1080–1110的骨架原子上使用位置约束，为250 ns的骨干原子，每天的性能约为4 ns。Molecular systems based on S1A alone were smaller (approximately 32,500–56,200 atoms, depending on the size of the N-glycans attached) and were sampled for an accumulated timescale of approximately 20 µs for the Caen1 sequence (apo + disialoside ligand, 5 µs, 6 simulations; holo, 15 µs, 27 simulations) and 52 µs for the N1 sequence（Apo，12 µs，13个模拟； Apo+Disialoside配体，23 µs，34个模拟； Holo，17 µs，22个模拟），单个模拟达到1.6 µs。每天的性能约为100-200 ns。图5b所示的距离是根据以下原子之间的示例轨迹（扩展数据）计算的：L28：O和S86：OG；p33：CG和F94：CA；T30：O和W89：NE1;S36：N和F74：O;R34：O和-D76：n。此外，使用Yasara（如上所述使用的通用分子动力学参数）在无蛋白的情况下模拟溶剂化杀菌剂配体，在三次盒子中使用GlyCAM06J参数，在37 k的侧面长度为37Å，在310 K下为10 µs。这些仿真数据用于识别灾性配体的低能构象体，这些构剂配体用于支持还原端的NEU5AC残基对局部低分辨率冷冻em密度的建模。

　　构象分析工具（http://www.md-simulations.de/cat/）用于分析轨迹数据，一般数据处理和科学图的产生。VMD63用于生成分子图形。

　　使用PDBEPISA64计算尖峰界面区域。使用Consurf65进行HKU1-A-A峰值蛋白的表面着色，并在UCSF Chimerax66中进行了可视化。使用默认设置，使用UCSF Chimera Matchmaker工具来获得均方根偏差值。用CCP4（参考文献67）Superpose68计算域旋转。使用UCSF Chimerax66和Biorender.com生成数字。该项目中使用的结构生物学应用由SBGRID69编译和配置。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。