如https://weissman.mit.mit.mit.edu/resources/sgrnacloningprotocol.pdf（补充表4），将CRISPRI SGRNA克隆到PU6-SGRNA EF1ALPHA EF1ALPHA-PURO-T2A-BFP（ADDGENE，60955）13中。吉布森（Gibson）组装基因片段，没有扭曲生物科学和pu6-pegrna-ggceptor质粒（addgene，132777）4挖出Ndei bsaai/bsai/bsai-bsai-ai，bsai/bsai-bfv2（addeg22222）R0531，R3733S）（补充表4）。通过BSTXI和XHOI（新英格兰Biolabs，R0113S和R0113S和R0146S）（补充）4（补充）4（补充）4（补充）4（补充）4（补充）4（补充）4（补充）（新英格兰bs）（补充）（新英格兰BSTXI）（补充）4（补充）4。FACS和MCS记者质粒由Gibson组装克隆，由Pald-lentiegfp-A（Aldevron）作为骨干，从Plenti-dsred_ires_egfp（Addgene，92194）41和PJT039（Addgene，AddGene，Addgene，161927）15。AAVS1 PEMAX敲入质粒是通过限制克隆而产生的，该克隆用PAAVS1-NST-MCS（Addgene，80487）20，PCMV-Pemax（Addgene，174820）5和plenti-dsredi-dsredi-dsred-dsred__eres_ires_egfp的paavs1-nst-mcs（Addgene，80487）20，PEMAX编辑器生成质质质粒。Plasmids of PEmax fused to La or the La N-terminal domain (Supplementary Table 5), including pCMV-PE7 (Addgene, 214812), were generated by restriction cloning using pCMV-PEmax as the backbone (linker A, SGGS×2-XTEN16-SGGS×2; linker B, SGGS×2-bpNLSSV40-SGGS×2;linker C，SGGS）。PCMV-PE7-P2A-HMLH1DN由Gibson组装与PCMV-PE7克隆为骨架，并从PCMV-PEMAX-PEMAX-P2A-HMLH1DN（Addgene，174828）5中插入了插入片段PCR。PCMV-PE7突变剂（Q20A，Y23A，Y24F和F35A）由Gibson组装以PCMV-PE7的形式克隆为骨架和含突变的基因片段，而没有扭曲生物科学的辅助基因片段。PE7 mRNA的体外转录（IVT）的质粒，IVT的PT7-PE7（Addgene，214813）， 用Gibson组装与PT7-Pe​​max一起克隆用于IVT的PT7-Pe​​max（Addgene，178113）5作为主链和从PCMV-PE7扩增的插入片段PCR。Lentiviral transfer plasmids expressing PEmax (pWY005/pWY004) or PE7 (pWY008/pWY007) with IRES2-driven eGFP or eGFP-T2A-NeoR as the selectable marker were cloned by Gibson Assembly with pU6-sgRNA EF1Alpha-puro-T2A-BFP as the backbone, UCOE and SFFV promoter来自PMH0001（Addgene，85969）42，来自plenti-dsred_ires_egfp的IRES2和来自paavs1-nst-Mcs的T2A-Neor。使用Platinum SuperFI II PCR Master Mix进行分子克隆的所有DNA扩增（Invitrogen，12368010）。使用Nucleospin质粒，迷你试剂盒（Macherey-Nagel，740588.250），Zymopure II质粒MIDIPREP试剂盒（Zymo Research，d4201）或无内侧无质粒Maxi试剂盒（Qiagen，12362）提取所有质粒。从集成的DNA技术订购了引物（补充表6）。

　　使用BD FACSDIVA（8.0.1），ATTUNE细胞仪软件（5.2.0）或FlowCytometrytools（0.5.1; https：//github.com/eyurtsev/flofloflycyterytools)43分析流式细胞仪数据。来自流式细胞仪分析和FACS的数据可以在图1和图2中找到。1C和2F，扩展数据图。1d – f，h – j，2a – c，f，3a，f，g，4a和10b，c，补充无花果。1-7和补充表7。

　　如前所述44，主要编辑mRNA在体外转录。带有Pemax或PE7编码序列的质粒，侧面是被灭活的T7启动子，5'未翻译区域（UTR）（UTR）和上游中的Kozak序列以及下游中的3'UTR，从Addgene（IVT）或CloneD（pt7-pemax fors for Ivt）购买了下游（IVT）或cloned（pt7-pemax fort for Ivt）或clonefe for in for ivt）（pt7-pemax for Ivt）（pt7-pemax fors for Ivt）（pt7-pemax fors for Ivt）（pt7-pemax fors for ivt）（pt7-pemax fors for Ivt）。通过PCR生成体外转录模板以纠正T7启动子并安装3'UTR下游的119-核苷酸聚（A）尾巴。通过DNA Clean＆Comentator-5（Zymo Research，d4003）和Spriselect（Beckman Coulter，B23317）纯化PCR产物，分别用于细胞系和T细胞实验，并在-20°C下存储直至进一步使用。使用Hiscribe T7 mRNA试剂盒与Cleancap Reagent AG（新英格兰Biolabs，E2080S）进行细胞系实验，并在RNase抑制剂（New England Biolabs，M0314L）的情况下（新英格兰Biolabs，E2040S，E2040S）进行T7高产量RNA合成KIT（New England Biolabs，E2040S）用于T细胞实验的Biolabs，M2403L）。所有mRNA均由UTP完全代替，被N1-甲基甲基氨基氨酸-5'-三磷酸（Trilink Biotechnologies，n-1081）和Cleancap Reagent AG（Trilink Biotechnologies，N-7113）共同封闭。通过2.5 M氯化锂（Invitrogen，AM9480）沉淀，恢复在无核酸酶的水（Invitrogen，AM9939）中，通过纳米旋转一个UV-VIS光谱仪（Thermo Scientific）进行定量，并归一化为1μgμgμgμl-1且已存储为−8000000000000000。通过Agilent 4200 Tapsestation对T细胞实验进行T细胞实验的mRNA。如“ HSPC隔离，培养和主要编辑”部分所述，用于HSPC实验的主要编辑mRNA在体外转录。

　　Lenti-X 293T购自Takara（632180）。K562（CCL-243），HELA（CCL-2）和U2OS（HTB-96）购自美国类型文化收藏集。K562 CRISPRI细胞系组成型表达DCAS9-BFP-KRAB（PHR-SFFV-DCAS9-BFP-KRAB，ADDGENE，46911）12是J. Weissman的礼物。培养Lenti-X 293T，HELA和U2OS细胞在Dulbecco修改的Eagle培养基（DMEM）（Corning，10-013-CV），DMEM（Corning，10-013-CV）和McCoy's 5a（Modified）培养基（Gibco，16600082）补充10％（VIBS）（VBS）（VIBS）（VIBS）（VBS）（VBS）（VBS）（VBS）（v）（VBS）（VBS）（VIBS）（VIS）（VIBS）（v）（VBS）（corning，10-013-CV）（corning，10-013-CV）（v）（V）（VBS）（VBS）（VIBS）（VIBS）（VIBS），1×青霉素 - 链霉素（康宁，30-002-CI）。为了进行脂触和核反射，未补充1×青霉素 - 链霉素。培养K562和K562 CRISPRI细胞，并在RPMI 1640培养基（Gibco，22400089）中进行了培养，并补充了10％（v/v）FBS（corning，35-010-CV）和1×青霉素 - 链霉菌素 - 链霉素 - glutamine – Gibco（Gibco，Gibco，103788016）。为了进行核能，以292μgml-1的终浓度（Corning，25-005-CI），1×青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺被1× - 谷氨酰胺取代。所有细胞类型均与5％CO2在37°C下孵育，维持和培养。通过短串联重复分析对细胞系​​进行身份验证，并对支原体测试阴性。

　　要包装慢病毒，在6孔板（Greiner Bio-One，657165）中以每孔9×105细胞的形式将Lenti-X 293T细胞播种，并以70％的汇合度转染。为了转染，将6μlTransit-LT1（Mirus，miR 2300）混合并与250μlOpti-Mem I在室温下减少血清培养基（Gibco，31985070）15分钟，然后与100 ng Pald-rev-a（Aldevron）混合，然后将其混合。（Aldevron）和1,500 ng在室温下转移质粒再转移15分钟，并滴入Lenti-X 293T细胞中，然后轻轻旋转以进行适当的混合。转染后10小时，以1×最终浓度添加病毒启动试剂（Alstem，VB100）。转染后48小时，收集含病毒的上清液，通过0.45 µm纤维素乙酸纤维滤器（VWR，76479-040）过滤，并存储在-80°C下。在145毫米板中（Greiner Bio-One，639160）中，将CRISPRI筛查的慢病毒与HCRISPRI-V2库（Addgene，83969）14一起包装。为了转导K562细胞，将细胞重悬于补充的新鲜培养基中，该培养基补充了8 µg ML-1聚甲烯（Santa Cruz Biotechnology，SC-134220），并与含慢病毒上网的含有慢病毒的上网剂混合，并在室温下以1,000克的速度离心2小时。为了转导U2OS和HeLa细胞，补充了8 µg ML-1聚甲烯和含慢病毒的上清液的细胞培养物。转导后72小时，通过ATTUENXT流式细胞仪确定转导（荧光蛋白标记阳性）的百分比（阳性）。为了产生稳定的转导细胞系，通过转导后48小时，通过3μgml-1紫霉素（Goldbio，P-600-100）选择细胞，直到95％的活细胞为标志物为阳性。

　　为了构建我们的FACS记者细胞系，K562 CRISPRI细胞被FACS记者的慢病毒转导，感染的0.17多重性（M.O.I。; 15.3％感染）。使用BD FACSARIA融合流式细胞仪分离转导的（MCHERRY+）种群，并作为FACS报告细胞系扩展。对于基于FACS的基因组尺度CRISPRI屏幕，两次重复进行了一天的独立执行。对于每个重复，将2.4×108 FACS报告基细胞用H​​CRISPRI-V2慢病毒转导为0.29 M.O.I.（25％感染），转导后48小时用3μgml -1紫杉素选择。根据制造商的协议，转导后七天，使用SE细胞系4D-核型X试剂盒L（Lonza，V4XC-1024）和脉冲代码FF120核定核法。每个核能由1×107个细胞，7,500 ng PCMV-SAPE2（Addgene，174817）5，2,500 ng +7 gg +7 gg-to-to-to-ca pegrna质粒和833 ng +50 Nicking sgrna质粒。核反理三天后，使用BD Facsaria融合流式细胞仪对1.5×108个细胞进行分选。具体而言，首先在MCHERRY+和BFP+上门控，其中EGFP+和EGFP - 种群被收集。使用Nucleospin Blood XL Maxi试剂盒中提取GDNA（Macherey-Nagel，740950.50）。来自两个人群的全部GDNA用于综合HCRISPRI-V2 SGRNA的PCR扩增。每种100μlPCR反应均用10μg的GDNA，1μm向小鼠U6启动子退火的1μm正向底漆，1μm的反向底漆，将退火向SGRNA常数区域退火，50μlNebnext Ultra Ultra Ultra II Q5 Q5 Q5 Master Master（New England Biolabs，M0544X）cycy cyscling cyscling cycly cyscling.98（98°C 10 s，65°C持续75 s），然后为65°C持续5分钟。使用Spriselect（Beckman Coulter，B23318）纯化PCR产品，具有双尺寸选择（0.65×右侧和1.35×左侧），使用Qubit 1×DSDNA高灵敏度套件进行定量 （Invitrogen，Q33231）和高敏性DNA芯片（Agilent Technologies，5067-4626）在Agilent 2100生物分析仪上进行，并使用100个循环的Novaseq 6000 SP Reagent Kit（v.1.5）进行了测序（Illumina，20028401），并使用8个cycles prience prience prience prience prience primins sequers sequers sequere prience and cycers precors and cycles precters sequers and cyc prience prience priences and cycles。i7索引阅读。

　　为了构建我们的MCS报告细胞系，将K562 CRISPRI细胞用MCS报告基因慢病毒转导为0.09 M.O.I.（感染8.5％）。使用BD FACSARIA融合流式细胞仪分离转导的（EGFP+）群体，并作为MCS报告细胞系扩展。基于MCS的基因组尺度CRISPRI筛选，具有+7 GG至CA PE3+50，PE4和PE5+50编辑，并并联进行两个重复。总共2.1×108 MCS报告剂细胞用HCRISPRI-V2慢病毒转导为0.16 M.O.I.（感染15％）在所有筛查条件下，并在转导后48小时被3μgml -1紫霉素选择。根据制造商的协议，转导后7天，使用SE细胞系4D-核对象X Kit L（Lonza，V4XC-1024）和脉冲代码FF120，为每种编辑的每个复制核定1×108。每个核能由1×107个细胞和编码质量编辑组件的质粒组成。具体而言，对于PE2和PE3，7,500 ng PCMV-SAPE2，2,500 ng +7 gg-to-to-ca pegrna质粒，使用每个核反射，使用833 ng +50 Nicking sgrna质粒（PE3）。对于PE4和PE5，使用了6,000 ng PCMV-SAPE2，3,000 ng PEF1A-HMLH1DN（Addgene，174823）5，2,000 ng +7 gg +7 gg-to-to-ca pegrna质粒和667 ng +50 ng +50 Nicking sgrNA质粒（PE5）。核反理四天后，每个复制和条件的细胞被磁分离为珠子结合和未结合的分数，如前所述15。如上所述，进行了GDNA提取，PCR，NGS文库质量控制和测序。我们注意到，MCS报告基因在细胞分离方面的效率低于FACS报告基因（扩展数据图1F，G），这可能是由于未能从珠子结合或未结合的分数中去除死细胞，碎屑或Doublets。

　　如前所述的14（https://github.com/mhorlbeck/mhorlbeck/screenprocessing），使用自定义python（2.7.18）脚本对准测序读数（每个基因五个sgrnas）（每个基因五个SGRNA）。SGRNA级表型的计算是计算为标记阳性细胞（GFP+或珠子结合）在样品中的总数和相对于非靶向对照中位数的总数和相对于非靶向对照中的中位数的总数归一数（SGRNA计数）的log2富集（SGRNA计数），与标记不关的细胞相比（GFP-或BEAD-bond）（GFP-或Bead-unnboundary bod-undaryboundary boundary）（补充）（补充）（补充）（补充）（补充）（）（在计算之前，每个样品中的每个sgrna都施加了至少50个读数。然后，通过按绝对值平均最强的3个SGRNA的表型来计算每个带注释的转录起始位点的基因级表型。阴性对照假基因是通过随机抽样产生的，为每个假元分配了五个不靶向的SGRNA。SGRNA级表型用作默认参数下的Crisphiermix（V.0.1.0）16的输入，以正式评估每个基因对主要编辑效率的影响（补充表2和3）。使用R（4.2.2）和GGPLOT2（3.4.1）绘制屏幕结果。

　　为我们的基因组规模CRISPRI屏幕设计的记者测定法案是两个主要考虑因素：尺度和表型。

　　我们开发了记者系统来执行具有成本效益的高通量质编辑屏幕。尽管易于实现和尺度，但记者屏幕始终受到识别具有微妙表型基因的能力，因为它们依赖于低分辨率读数，尤其是与分子读数执行的屏幕相比（例如，Repair-seq5）。因此，我们的主要编辑记者测定法应被视为确定强质质编辑调节器的可扩展方法。此外，由于来自基于FACS的屏幕的数据中观察到的技术变异性较低，因此，该屏幕的命中应比基于MCS的屏幕的命中率更高。

　　我们的基于FACS的屏幕确定了36个命中基因（35个负调节剂和1个正调节剂FDR≤0.01）。尽管这种识别率低于旨在询问细胞过程的基因组尺度筛选中通常观察到的，但素数是一种合成系统，因此，虽然存在和重要的细胞调节剂，但因此并不丰富。实际上，先前执行的修复式屏幕仅鉴定出10个SGRNA针对4个基因，在类似实现的基于PE3的编辑中（在476个DNA修复相关基因中）中的4个基因5倍。因此，预计在我们的屏幕上，预计这一> 2倍阈值的命中率很少，但结合了我们屏幕旨在仅识别强烈调节器的事实，屏幕复制之间的相关性预计会很低。重复SGRNA级表型的Pearson相关系数为0.053（FACS，PE3），0.042（MCS，PE3），0.058（MCS，PE4）和0.054（MCS，PE5）。对于重复基因级表型，相关系数为0.125（FACS，PE3），0.071（MCS，PE3），0.090（MCS，PE4）和0.073（MCS，PE5）。

　　在验证我们的主要编辑报道构造时，我们观察到了仅包含预期编辑的结果，并通过预期的编辑来丰富结果，并在标记阳性细胞中伴随indels（即GFP+ FACS Reporter Reporter细胞通过流动细胞仪或MCS Reporter细胞分离为蛋白质GEADS）（扩展的数据）（扩展数据）（GESTERIAN GERTERTER细胞）（扩展数据）。我们标记阳性种群中两种结果的积累都反映了设计选择。具体而言，我们在记者中设计了目标位点，以使PE3诱导的indels通常属于主要和互补的链接nicks5之间，不会经常破坏报告基因的开放式阅读框架，因此不会防止由同时安装的预期编辑引起的标记表达（图1B）。因此，来自该报告者系统的表型代表了使用预期编辑的整体编辑结果的总体频率，但不能在标记阳性人群中编辑结果的同质性。

　　对于siRNA反向转染在Lenti-X 293T中的LA敲低，120 PMOLE在TargetPlus人类SSB siRNA（Horizo​​n，LQ-006877-01-0005）或targetplus in-Targetplus non-Targeting Controging池（Horizo​​n，horizo​​n，horizo​​n，d-001810-10-10-55）与500°I rediuum Opti（D-001810-10-05）混合（31985070）和4μL脂肪系蛋白Rnaimax转染试剂（Invitrogen，13778150）在6孔板的每个孔中（Greiner Bio-One，657165）在室温下孵育15分钟，然后在4×105 lenti-105 lenti-105 lenti-X 293T培养基中2.5 ml PensiccIlliccin中添加。反向转染的细胞用于相应方法部分中所述的RT – QPCR或下游序列编辑实验。

　　为了通过质粒转染在Lenti-X 293T细胞中进行素数，将18,000个细胞在96孔板中的每孔中的100μl青霉素 - 链霉素培养基中播种（NUNC，167008）。播种后18小时，10μl的200 ng PCMV-PE2（Addgene，132775）4，66 ng Pegrna，22 ng Nicking sgrna，0.5μl脂肪切开胺2000转染试剂（Invitrogen，Invitrogen，11668027）和Opti-Mem i Room i Incub i Incubed Serum Med Medim（Incub i Incubed Serum Med Mid），Incco i Incco，Incco i Incco，Incco i Incco，Incco i Incco，Incco，319815分钟，并添加到每个井中。转染后72小时，去除培养基，用DPB洗涤细胞（Gibco，14190144），并通过在每个井中添加40μl新鲜准备的裂解缓冲液来提取GDNA。裂解缓冲液由10 mM Tris pH 8.0（Gibco，AM9855G），0.05％SDS（Invitrogen，15553027），25μgml-1蛋白酶K（Invitrogen，AM2546）和无核酸酶（IntiTrose）（Invitrogen，AM99939）组成。将GDNA提取物在37°C孵育90分钟，然后转移到PCR条（USA Scientific，1402-4700）中，在Bread T100热循环蛋白中将蛋白酶K灭活30分钟。

　　对于Lenti-X 293T中的素数，通过质粒核反射，750 ng Prime Editor质粒，250 ng Pegrna质粒和83 ng Nicking Sgrna质粒（PE3和PE5），HELA和U2OS细胞被核构成了核代核。For each sample, 2 × 105 LentiX-293T cells, 1 × 105 HeLa cells or 1 × 105 U2OS cells were nucleofected using SF (Lonza, V4XC-2032), SE (Lonza, V4XC-1032) and SE Cell Line 4D-Nucleofector X kit S with program CM-130, CN-114 and DN-100, respectively, according to the manufacturer’s协议。使用PCMV-PEMAX-P2A-HMLH1DN和PCMV-PE7-P2A-HMLH1DN编辑器质粒进行U2OS细胞中的PE4和PE5实验。核反理后，将细胞培养在24孔板（Greiner Bio-One，662165）中，并在核反射后72小时去除培养基。用DPB（Gibco，14190144）洗涤细胞，并通过在每个孔中添加110μl新鲜制备的裂解缓冲液（上述）来提取GDNA。将GDNA提取物在37°C下孵育90分钟，并转移到PCR条（美国科学，1402-4700）中，在Bread T100热循环蛋白中将蛋白酶K灭活40分钟。

　　对于K562细胞中的核触摸（除了CRISPRI筛选，AAVS1敲入，LA敲除，小RNA测序和RNA测序），使用指定量的质粒或合成指南RNA使用SE SE SE SE Line Line 4D-Nucleofector X KIT X KIT SE（LONZ KIT and lonz，v4cc，v4cc，v4cc10322），用指定量的质粒或合成指南RNA核对1×106个细胞核定核。制造商的协议。用于测试FACS-REPORTER和MCS-REPORTER以及记者细胞系中LA表型的验证，900 ng PCMV-SAPE2，300 ng PEGRNA质粒，100 ng Nicking SgrNA质粒（PE3和PE5）（PE3和PE5）和450 ng PEF1A-PEF1A-HMLH1DN（PE4和PE5）（PE4 and PE5）。为了验证K562 Pemax父母和LA基因敲除克隆中LA表型的验证，将500 ng Pegrna质粒核成核。为了进行救援实验，将500 ng PEGRNA质粒和编码LA突变体或MRFP对照的1,000 ng质粒核定。对于在MCS报告基细胞中切割的SACAS9，将800 ng PX600（Addgene，61592）和400 ng +7 Gg-to-Ca pegrna质粒构成核构成。对于使用K562 PEMAX父母和LA-KO4细胞中的PE4方法进行SAPE2编辑，核构成了800 ng PCMV-SAPE2，400 ng PEGRNA质粒和400 ng PEF1A-HMLH1DN。对于SACAS9，SABE4和SAABE8E在K562 Pemax父母和LA-KO4细胞中编辑，400 ng PEGRNA或SGRNA质粒以及800 ng PX600，SABE4-GAM，SABE4-GAM（Addgene，100809）23或Saabe8e（Addgene，1385500）24岁。从集成的DNA技术中订购了具有指定序列和化学修饰的合成PEGRNA和具有指定序列和化学修饰的划痕SGRNA（补充表8）。根据K562 Pemax父母细胞中DNMT1 +5 G-TO NO-POLYU合成Pegrna的增量滴定，预期的编辑效率已经在100 pmole输入下饱和（扩展数据图5B）。因此，除非另有说明，否则将100 pmole合成PEGRNA和50 pmole nicking sgrna（PE3）用于核能。在核反射后72 h时，将1×106–2×106细胞收集在1.5 mL管中（Eppendorf，0030123611）， 用1 ml DPB（Gibco，14190144）洗涤，并重悬于上述100μl新鲜制备的裂解缓冲液中。将GDNA提取物在37°C下孵育120分钟，并转移到PCR条（USA Scientific，1402-4700）中，在Bread T100热循环蛋白中将蛋白酶K的80°C失活40分钟。

　　对于使用编辑器mRNA和合成PEGRNA在K562和U2OS细胞中的质量编辑，使用1 µg编辑器mRNA和50 pmole Synthetic Pegrna核定1×106 K562和1×105 U2OS细胞，并使用SE SE细胞系4D-Nucleofector X KIT X KIT S（LONZA，v4xc-132220），fffff FFFFN制造商的协议。核反面后，将细胞培养72小时，并用于GDNA提取物。

　　为了通过慢性病毒递送pegrnas或epegrnas以及编辑器质粒或mRNA的核反理在HELA和U2OS细胞中进行质量编辑，用表达PEGRNA或epegrnas或Epegrnas（20–40％感染）的慢病毒转导细胞，并被3μgMl -1 Puromycin选择。根据制造商的协议，使用SE细胞系4D-Nucleofector X KIT S（Lonza，V4XC-1032），用750 ng的编辑器质粒或1 µg编辑器mRNA核定1×105，用750 ng的编辑器质粒或1 µg编辑器mRNA核定核法。核反面后，将细胞培养72小时，并用于GDNA提取物。

　　为了通过慢病毒递送Prime编辑器和PegrNA或Epegrnas在K562细胞中进行素数，K562细胞用表达Pemax或PE7的慢病毒转导（以IRES2驱动的EGFP或EGFP-T2A-NEOR为可选标记）。转导后9天使用BD Facsaria融合流式细胞仪分离过转导的种群（EGFP+，20–30％），在转导后9天，用表达粘膜或epegrnas的慢病毒（约50％感染）进一步转导，在3μgml -1呼吸菌素和第二次转移后完全选择，并在3μgml -1 persects transctuct中完全选择。

　　通过两轮PCR反应（PCR1和PCR2）扩增含有靶位点的GDNA序列。在PCR1中，含有前向和反向适配器进行光明测序的底漆对感兴趣的基因组区域进行扩增。每种20μlPCR1反应由1-2μlGDNA提取物，每个前进和反向引物的0.5 µm，10μlPhusionU绿色多重PCR主混合（Thermo Scientific，F564L）和无核酸酶的水（Invitrogen，Am9939），并与以下旋转条件一起进行：98°C（98°C），并进行了2分钟的速度。61°C持续20 s，72°C 30 s），然后为72°C 2分钟。通过1％琼脂糖（Goldbio，A-201-100）凝胶电泳证实了成功的PCR1扩增，然后继续进行PCR2以唯一地索引每个样品。每种14 µL PCR2反应由1 µl未纯的PCR1产物，每种前进和反向照明条形码底漆，7μLPHUSIONU绿色多重PCR Master Mix（Thermo Scientific，F564L）和无核酸酶（Nuclease nuclease with）（Invitrogen，AM9939）和9888888的条件。98888888，（98°C 10 s，61°C持续20 s，72°C持续30 s），然后为72°C 2分钟。成功的PCR2扩增通过1％琼脂糖凝胶电泳证实，在通过常见扩增子汇总反应之前。A total of 30 µl pooled PCR2 reactions of each common amplicon was purified by 1% agarose gel electrophoresis with a manual size selection of 200–600 bp according to a 100 bp DNA ladder (Goldbio, D001-500), extracted using the Zymoclean Gel DNA Recovery kit (Zymo Research, D4001) and eluted in 30 µl buffer EB (Qiagen,19086）。使用1×dsDNA高灵敏度KIT（Invitrogen，Q33231）和高敏感性DNA芯片（Agilent Technologies，5067-4626）在敏捷性的2100生物纳学仪上使用MISEQ MISEQ MICER INILLAM MASS-3 CYC-3 CYC-3 CYC-3 CYC-3 CYC-3 CYC-3 CYC-3 CYC-3 CYC-3 CYC-3 CYC-3 CYC（imm MS）测序，使用量子1×dsDNA高灵敏度Kit（Invitrogen，Q33231）和高敏感性DNA芯片（Agilent Technologies，5067-4626）对凝胶纯化的PCR2产物进行定量。Nano Kit V2 300周期（Illumina， MS-103-1001）具有300个循环，用于R1读取，i7索引读取8个周期，i5索引读取8个周期。测序读取通过HTSEQ（普林斯顿大学高通量测序数据库，https://htseq.princeton.edu/）取消，并使用castadapt（4.1）46修剪测序适配器。

　　为了量化主要的编辑结果，将扩增子测序读取与Crispresso2（2.2.11）47在HDR批处理模式下的相应参考序列（补充表9）对齐（补充表9）。-3”）。补充表74,5,18中指定了定量窗口大小（“ -w”）。未经indels的预期编辑频率如下：（未录制的HDR读数的数量）/（与所有扩增子一致的读数数）。使用Indels进行预期编辑的频率如下：（丢弃的HDR对准读数的数量）/（将所有扩增子对齐的读数数）。计算总预期编辑（带有或不带有indels）的频率为（HDR对准读数的数量）/（与所有扩增子一致的读数数）。计算总数的频率如下：（废弃读取的数量）/（将所有扩增子对齐的读数数）。计算没有预期编辑的Indels的频率为（被丢弃的参考分配读数的数量）/（将所有扩增子对齐的读数数）。在整个过程中，我们将“预期的编辑”效率称为没有Indels和“ Indel”效率的预期编辑的频率，除非本研究中的总Indels的频率（有或没有预期的编辑），除非另有说明。在图2中。2b，c，3b，d，4c，f和5a，c，d，f，h和扩展数据无花果。3b，h，5c – e，9a，b，10a和11a，d，f，g，与相应预期的编辑效率相邻的每个样品中都包括indel频率。

　　为了量化脱靶素数编辑，每个目标基因座的两到四个最常见的cas9脱靶位点是从实验确定的32个位点，从用编码Pemax或PE7和PEGRNA和PEGRNAS靶向HEK3，HEK3，HEK4，FANCF和FANCF和EMX1 loci的U2OS细胞的GDNA提取物中得到扩增。如前所述，对脱靶编辑进行了量化的量子量，以较小的修改为4,5,18。具体而言，在标准批处理模式下，使用Crispresso2（2.2.11）将读取与具有参数为“ -Q 30”，“ -W 10”和“ -discard_indel_indel_reads”的标准批处理模式下的脱靶参考序列对应。将每个脱离目标扩增子序列与由Cas9刻入核苷酸3'开始的PEGRNA延伸所编码的3'DNA瓣序列进行比较，直到到达与3'DNA plap不同的脱离目标扩展子上的第一个核苷酸。使用该核苷酸转换为3'DNA瓣上的任何读取的任何读数都被视为靶向读数，并且可以在输出文件“ nucleotide_frequency_summary_around_sgrna”中找到此类读取的数量。计算出脱离目标编辑效率为（靶向读数的数量+含indel的读取的数量）/（与所有扩增子保持一致的读数数）。

　　为了量化CAS9切割结果，Crispresso2（2.2.11）以标准批处理模式运行，参数为“ -Q 30”和“ -discard_indel_reads”。预定的编辑效率提到的是Indels的频率，该频率计算出：（丢弃的参考分配读数的数量）/（与所有扩增子一致的读数数）。如前所述23,24，使用crispresso2（2.2.11）对基础编辑结果进行了量化。

　　为了量化MCS报告基细胞中La靶向CRISPRI SGRNA的敲低效率或Lenti-X 293T细胞中La SiRNA的敲低效率，使用Quick-RNA MiniPREP KIT（Zymo Research，r1054）通过DNase I治疗和1 µG总RNA与CDNA合成Cynters（Zymo Research，R1054）提取总RNA。18091050）根据制造商的协议。每种20 µl RT – QPCR反应由2 µl cDNA，0.3 µm的每个正向和反向引物，10μlSybr绿色PCR主混合（Applied Biosystems，4309155）和无核酸酶的水（Invitrogen，AM9939）组成（AM9939），并在VIIA 7实时（在VIIIA 7实时）中进行（cy）。50°C持续2分钟，95°C 10分钟，40个周期为（95°C 15 s，60°C，持续1分钟）。与非靶向的SGRNA或非靶向控制siRNA池相比，使用ACTB（管家基因）的方法48计算相对LA表达水平。

　　总共91.5 PMOLE ALT-R S.P.CAS9核酸酶V3（综合DNA技术，1081058）和150 pmole定制的Alt-R GRNA靶向AAVS120（综合DNA技术）（补充表8）在室温下络合20分钟，并在室温下核定核能，并使用2,000 ng AAVS1 Pemax ng avs-ng ocking-nock-Inkinter-nd celly to hyuc se See 7.5 k5622 k5622 k5622 k5622 k5622 k5622 k5622 k5622根据制造商的协议，X套件（Lonza，V4XC-1032）和程序FF-1220。核反理四天后，使用400μgml-1遗传素（Gibco，10131027）选择细胞2周，然后使用BD FACSARIA融合流式细胞仪分类为96孔板以每孔1细胞和150μl条件培养基。将单个细胞生长并扩展2-3周到克隆线，从中，通过Attuenxt流式细胞仪分析从中最高和最同质的EGFP表达的一个细胞被选为K562 PEMAX PEMAX PEMAX PARNETIRE细胞系。

　　总共122 PMOLE ALT-R S.P.Cas9 Nuclease V3 (Integrated DNA Technologies, 1081058) and 200 pmole Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNA targeting La (Integrated DNA Technologies, Hs.Cas9.SSB.1.AA) (Supplementary Table 8) were complexed for 20 min at room temperature and were nucleofected into 5 × 105 K562 PEmax parental cells using the SE Cell Line 4D-Nucleofector X kit（Lonza，V4XC-1032）和计划FF-1220，根据制造商的协议。核反理五天后，使用BD Facsaria融合流式细胞仪对细胞进行分类，以每孔1细胞使用150μl条件培养基，以1个细胞为96孔板。将单个细胞生长并扩展2-3周到克隆线。根据ATTUENXT流式细胞仪分析，选择具有高EGFP+细胞％的克隆，以通过基因组LA（SSB）基因座和Crispresso2（2.2.11）分析的靶向测序进行进一步表征。对于涉及K562 Pemax亲本细胞和衍生的LA基因敲除细胞的每个实验，通过转染前通过流式细胞仪来量化每个细胞系的EGFP+细胞百分比（补充表7）。

　　用DPB（Gibco，14190144）洗涤细胞，在2×Western裂解缓冲液中裂解，在95°C下煮沸5分钟，并在使用前储存在-80°C下。对于SDS-PAGE，将样品在95°C下重新加热5分钟，彻底混合，加载至10％凝胶，在150 V时运行1.5 h。使用Trans-blot SD半干细胞（Bio-Rad），将蛋白质转移到硝酸纤维素膜（VWR，10120-060）中。将抗体在5％的印迹中稀释（在TBST中为5％的非脂肪干牛奶），并在室温下与膜孵育1小时。同一膜与以下主要抗体进行依次免疫印迹：抗LA小鼠单克隆抗体（1：5,000; ABCAM，AB75927），抗GAPDH兔兔单克隆抗体抗体632607）。使用了以下二抗：HRP偶联的绵羊抗小鼠多克隆抗体（1：2,000; VWR，95017-332）和HRP偶联的驴抗兔多克隆抗体（1：2,000; 1：2,000; VWR，95017-556）。与二抗孵育后，将膜用TBST洗涤，并浸入Lumi-Lightplus Western印迹底物（Sigma，12015196001）3分钟内在暴露前的黑暗中持续3分钟。用膜（未用这种技术成像的SPCAS9和/或用Azure Biosystems 600拍摄的SPCAS9）开发了印迹结果。恢复蛋白质印迹剥离缓冲液（Thermo Scientific，21059）在重新播放之前剥离膜。蛋白质印迹分析的裁剪部分如图2A和扩展数据图3d所示。图8中提供了未编写的图像和成像细节。

　　为了量化LA敲除对细胞生长的影响，使用Attuenxt流式细胞仪监测K562 PEMAX父母，LA-KO4和LA-KO5细胞，每个细胞系三个单独的重复，每种单独的复制，并在100 mM细胞培养皿中复制（Greiner Bio-bio-one，6644160）。每天，通过流式细胞仪来量化每种复制的活细胞密度（平均三个重复测量），并通过流式细胞仪进行量化，稀释至每毫升约5×105个细胞，并在稀释后立即再次定量和24小时。计算细胞的倍增为稀释后24小时的活细胞密度与log2尺度稀释后立即测量的活细胞密度之比。

　　一式三份进行小的RNA测序，用靶向PEGRNA和Epegrnas进行小型RNA测序，对于每种重复，5×106 K562 PEMAX父母或LA-KO4细胞用2,500 ng核包装2,500 ng，使用两个Pegrna和Epegrna质粒中的一个和Epegrna质粒中的一个（使用SET 1和SET 2）使用SE Cell Line Line Line Line Line Line 4D-ND-ND-ND-ND-ND-ND-ND-ND-ND-ND-ND-ND-ND-ND-ND-ND-ND-ND-KIT lucecotor根据制造商的协议，V4XC-1024）和脉冲代码FF120。集合1由编码FANCF +5 G-TE-T PEGRNA的质粒，HEK3 +1 T-TO-A PEGRNA，DNMT1 +5 G-TO-TEPEGRNA，RUNX1 +5 G-TO G-TO EPEGRNA（EVOPREQ1），VEGFA +5 G-TE-TEGRNA和EMX1 +5 G-TEPEGRNA和EMX1 +5 G-to g-to g-to g-to g-to g-to g-to g-to g-to g-to g-to emx1 +5 g-to g-to gtecegrna（mpknot）。集2由编码RNF2 +1 C-TO-A PEGRNA，HEK3 +1 T-TO-A EPEGRNA（MPKNOT），DNMT1 +5 G-TO G-TEPEGRNA（EVOPREQ1），RUNX1 +5 G-TO T PEGRNA，VEGGFA +5 +5 G-TE-TPEGRNA和EMX1 +5 G-TPEGRNA组成。VEGFA +5 G-T-TEPEGRNA质粒均通过两组共享，并作为潜在跨集归一化的内部控制。FANCF +5 G-TO-T PEGRNA质粒和RNF2 +1 C-TO-A PEGRNA分别特定于集1和2。对于HEK3，DNMT1，RUNX1和EMX1基因组基因座，一组具有Pegrna质粒，而另一组具有编码相同质量编辑的epegrna质粒。每组仅具有一个Evopreq1 epegrna质粒和一个MPKNOT Epegrna质粒。制定了这些集合，以便基于初步实验中的观察结果，从该组中的每个Pegrna或Epegrna转录物都可以独特地与该集合中的相应的Pegrna或Epegrna对齐，以至于很少有几个片段被完全映射到由不同的Pegrnas和Epgrnas和Epegrnas共享的SGRNA caffold。

　　用非靶向Mus DNMT1（MDNMT1）+6 G-TO-C PEGRNA或Epegrna（TevopReq1）进行小的RNA测序，在四倍上进行，对于每种复制，5×106 K562 K562使用5,000 nuc Pegrna segref line nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc nuc pegrna均应使用5,000 nucnuc nuc nuc nuc nuc nucnucne x根据制造商的协议，套件L（Lonza，V4XC-1024）和脉冲代码FF120。

　　在这两个实验中，核反理后24和48 h收集了来自每个核反射的一半细胞，并使用用苯酚（Invitrogen，AM1560）使用miRVANA miRNA分离试剂盒提取总RNA，并使用Nanodrop One One UV-VIS光谱仪（热科学）进行定量。对于每个样品，使用NEBNEXT多重RNA小RNA库准备的Illumina（1）（New England Biolabs，E7300S）和Nebnext Multigles oligos用于Illumina Index Primers 3（New England Biolabs，E7710S，E7710S）（新英格兰）（新英格兰Biolumina），使用NEBNEXT多重RNA库准备组成的小RNA库作为输入作为输入。制造商的协议。将所有样品的等效库汇总，使用Spriselect（Beckman Coulter，B23318）进行纯化，具有双尺寸选择（右侧0.5倍和1.35×左侧），使用QUBIT 1×DSDNA高灵敏度（Invitrogen，InvitRogen，Q33231）和高sensolitive dna chip（高sensitivity dna chip（Q33231），量化了QUBIT 1×DSDNA高敏感性（5067-4626）在Agilent 2100生物分析仪上，并使用Novaseq 6000 SP试剂试剂盒对1.1.5 100循环（Illumina，20028401）进行了40个循环的R1读数，R2读取的I7 Index读取8个循环，R2读取90个循环。

　　为了用非靶向MDNMT1 +6 G-TO-C PEGRNA或EPEGRNA验证LA表型，用含有MDNMT1的靶位点的慢跑病毒转导K562 PEMAX PEMAX父母和LA-KO4细胞。总体而言，使用SE细胞系4D-核对象X KIT S（Lonza，V4XC-1032）和程序FFF-1220，用500或1,000 ng Pegrna或Epegrna质粒核定每个转导的细胞。在核反理后1、2、3和4天收集了每个核反切的细胞数量的四分之一，并通过Amplicon测序和crispresso2（2.2.11）分析对编辑结果进行了量化。

　　测序读取通过HTSEQ（普林斯顿大学高通量测序数据库（https://htseq.princeton.edu/））进行了反复。使用snakemake（7.32.4）Workflow49和r（4.3.2）修剪，对齐和处理读数（在Zenodo上可用的脚本（https://doi.org/10.5281/zenodo.10553303）或Githubub（https://github.com/princeton-lsi-researchcomputing/pe-small-rna-seq-analysis）51）。

　　使用cutadapt（4.1）-a agatcggaagagcacgtctgaactgaactccagtcac -a gatcgtcggtcggtagaactgaactctgaacgtgtgtgtgtgtggtcggtggtggcgccgcgcgtatatcatt对适配器进行修剪。然后使用带有默认对齐选项的Bowtie2（2.5.0）52将修剪的读取与适当的参考序列（Pegrnas或Epegrnas）对齐。然后，使用bowtie2（2.5.0）和默认对齐参数对齐与适当参考（或参考）不符（或参考）（或参考）的读数（或引用）。对所使用的比对的下游分析仅以适当的对映射映射，以确保正确映射了测序片段的两端。每个读取都定义了一个源自RNA分子的RNA片段，该RNA分子由该分子通过比对确定。

　　人类小RNA的量化，包括将片段分配给人类转录本，基因和生物型（Gencode Gene注释释放43）54以及计数，以及使用Zenodo或Github Repository中可用的自定义Python（3.11）脚本（3.11）脚本（上面提供的链接）对正确配对的对准进行了计数。为了区分重叠的注释，将每个对齐的片段分配给注释，该注释与片段的起点和终点最为匹配。通过使用rsamtools（2.16.0）55和plyranges和plyranges（1.20.0）56，将每个样品分配给每个样品的PEGRNA和Epegrnas对每个样品进行了定量的PEGRNA和Epegrnas。使用DESEQ2（1.38.3）33计算差异表达，其设计由两个协变量组成：Pegrna和Epegrna质粒集核成核（集合1或2）和细胞系（K562 Pemax Partent fartent fentent Pentrent Pentrent oteral或La-KO4）。默认参数用于估计库大小因子，基因分散和负二项式GLM的拟合，以确定log2折叠变化值。使用APEGLM算法（1.22.1）57进行对数折叠变化的收缩。默认的双面WALD测试用于确定P值，并将Bonferroni Holm方法用于多个测试校正。使用GGPLOT2（3.4.4）在使用ReadR（2.1.4），Dplyr（1.1.3），Tidyr（1.3.0）和Stringr（1.5.0）软件包的数据上生成覆盖图58。

　　为了用靶向PEGRNA和Epegrnas对小的RNA测序数据进行初始质量控制，计算了以下三个指标：（1）任何样品的Pegrna或Epegrna映射配对末端读取的最小百分比是正确对齐并定义为“片段”的最小百分比（98.9％）；（2）唯一映射到任何样品中的11个Pegrnas和Epegrnas中的任何一个（94.7％）的Pegrna或Epegrna片段的最小百分比；（3）对于任何样品（96.9％），将唯一映射的Pegrna或Epegrna片段的最小百分比映射到Pegrna或epegrna的感觉链。最后的度量标准证实了RNA的测序，而不是任何潜在的DNA污染物。

　　RNA测序的每种条件均以四倍倍化进行，对于每种复制，用750 ng Pemax，PE7或PE7突变质粒和250 ng Pegrna质粒和编码HEK3 +1 T-TO-TO-TO-A或PRNP +6 G-A或PRNP +6 g-t lonz lonz lonz kit k的250 ng Pegrna质粒和250 ng Pegrna质粒核定核核成核成核。根据制造商的协议，V4XC-1032）具有程序FF-1220。将细胞培养在每孔2.5 mL培养基的6孔板中。在核反射后24、48和72 h时，通过Attuenxt流式细胞仪分析了每种复制和条件的150 µL细胞培养，以量化细胞活力和活细胞密度。核反射后72小时，收集了从每种复制和条件中的1 ml细胞培养物中的GDNA提取物，以量化HEK3或PRNP基因座的主要编辑结果。将剩余的1 mL细胞培养物固定并用DPB（Gibco，14190144）洗涤，用于使用Rneasy Plus Mini Kit（Qiagen，74134）进行总RNA提取，并进行ON DNase I处理。在Agilent 2100生物分析仪上，使用纳米旋转一台UV-VIS分光光度计（Thermo Scientific）和RNA 6000 PICO芯片（Agilent Technologies，5067-1513）对总RNA进行定量。根据制造商的协议，使用Total RNA作为Apollo NGS图书馆准备系统（Takara）的输入来制备3'mRNA智能seq库。合并测序文库，使用1×dsDNA高灵敏度KIT（Invitrogen，Q33231）和高敏感性DNA芯片（Agilent Technologies，5067-4626）进行汇总，在敏捷2100生物纳学仪上使用Novaseq 6000 Spegent sperge kit Kit Kit Kit Kit Kit Kit Kit Kit Kit Kit Kit kity（5067-4626）进行定量。R1的112个循环读取，索引读取10个周期。

　　测序读取通过HTSEQ（普林斯顿大学高通量测序数据库（https://htseq.princeton.edu/））进行了反复。使用snakemake（7.32.3）工作流和R（4.3.1）进行对齐，定量和差分表达式（在Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.105553340）上，可用（https://github.com/princeton-lsi-researchcomputing/pe-mrna-seq-diffexp)60）。使用Star（2.7）61与默认比对参数从Ensembl释放10053的GRCH38基因组对齐。定量在对齐过程中通过恒星进行。每个Pegrna分别执行编辑器之间的差异表达。执行了标准的DESEQ2（1.38）程序，以确定每个Pegrna样品集中每个编辑器之间的差分表达式。使用ASHR软件包（2.2_54）62的自适应收缩估计器缩小了低表达基因的倍数变化。使用R（4.3.1）包GGPLOT2（3.4.3）和GGPUBR（0.6.0）58生成图。差异表达分析结果可在补充表10中获得。

　　富含外周血单核细胞富含的人外周血白细胞来自Stemcell（Stemcell Technologies，200-0092），并具有批准的Stemcell机构审查委员会（IRB）。关于性别，种族或种族，没有偏爱。使用去识别的细胞的使用被认为是豁免人类受试者的研究，并由UCSF IRB批准。根据制造商的说明，使用EasySep人类T细胞分离试剂盒（Stemcell Technologies，100-0695）分离T细胞。分离后，立即将T细胞直接用于体外实验。所有T细胞均在完整的X-Vivo 15中培养，由X-Vivo 15（Lonza Bioscience，04-418Q）组成，并补充了5％FBS（R＆D Systems），4 mM N-乙酰基甲烷（RPI，A10040）和55μm2-甲基2-甲醇（RPI，A10040）（RPI，A10040）（RPI，A10040）（RPI）和21985023。在500 IU ML-1 IL-2的存在下，用抗CD3/抗CD28 dynabeads（Gibco，40203d）激活PAN CD3+ T细胞。刺激两天后，T细胞被磁取代，并在每毫升37.5×106个细胞的P3缓冲液中占用P3缓冲液（Lonza Bioscience，V4SP-3096）。接下来，每20 µL细胞加入1.5μgPemax或PE7 mRNA与50 pmole合成Pegrna（集成的DNA技术；补充表8），不超过每个反应的总体积25 µl。随后，使用具有DS-137的LonZA 4D核对器对细胞进行电穿孔。电穿孔后立即将80 µL温暖的X-VIVO15添加到每个电穿孔孔中，并将细胞在37°C下的5％CO2孵化器中孵育30分钟，然后将每个电穿孔反应分布到96孔圆形圆底板的3孔中。每个井都被带到200 µL完整的X-Vivo 15和200 IU ML – 1 IL-2。通过每2-3天添加新鲜的培养基和IL-2，对细胞进行亚培养和扩展。电穿孔四天后，大约5×105个细胞以500克向下旋转5分钟， 使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen，69506）根据制造商的说明提取GDNA，并用100 µL洗脱体积。为了评估编辑效率，在100 µl PCR与Kapa Hifi Hotstart Readymix（Roche，09420398001）的100 µL PCR反应中，用25 µL洗脱的GDNA进行PCR，并在以下循环条件下进行：95°C的条件：95°C，3分钟，28个循环（98°C），供20 s，63 s，63 s s，63 s s，63°C，in 72°C。72°C持续2分钟。PCR产物通过Spriselect（Beckman Coulter，B23317）纯化，并使用2 µL洗脱产物用于8个额外的PCR，并带有Kapa Hifi Hotstart Readymix，以添加Illumina测序适配器和指数。最终的PCR产物通过Spriselect纯化，使用1×DSDNA高灵敏度测定试剂盒（Invitrogen，Q33230）进行定量，并使用MiSeq试剂盒V2 300循环（Illumina，MS-102-2002）进行等分合并并测序，用于300 cycles and i 5 Cycles，i7 cyc read cyc read cyc read cyc read cyc read，索引阅读。使用baseSPACE对测序数据进行了反复的反复，并使用crispresso2（2.2.11）进行了分析。

　　通过将pemax和pe7克隆到先前描述的vector63中，构建用于HSPC实验的体外转录模板的mRNA质粒。使用Hiscribe T7高产量RNA合成试剂盒（新英格兰Biolabs，E2040S）和BBSI线性化质粒作为具有UTP的模板，由N1-甲基甲基丙氨酸5'-5'-Triphosphate（Trilink Biotechnologies，n-1081 coppappational Coppappational Coppapping Coppaption Coppaption Coppaption Coppaption Coppaption Coppaption Coppaption Coppaption Coppaption Coppaption Coppaption Coppaption coppaption），生成了mRNA。生物技术，N-7113）。IVT之后，使用君主RNA清理试剂盒（500 µg）（NEB，T2050S）纯化mRNA，在IDTE pH 7.5（Integrated DNA Technologies，11-05-01-15）中洗脱，并使用Qubit RNA高灵敏度分析套件（Invitrogen，Q32852）进行了定量。从集成的DNA技术（补充表8）中订购了合成PEGRNA和Epegrna作为自定义Alt-R GRNA，并在IDTE pH 7.5中重悬于200 µm。从弗雷德·哈钦森癌症研究中心（华盛顿州西雅图）获得了来自动员的健康供体的动员外周血中的冷冻保存的人CD34+ HSPC。本研究中使用的CD34+ HSPC已被取消识别，并且先前已经获得了研究使用同意。由于未针对本研究收集了识别的人类标本，我们的研究团队无法访问与标本或数据相关的任何主题标识符，因此波士顿儿童医院IRB确定这不被视为与人有关的研究。将CD34+ HSPC用X-Vivo-15培养基培养，并补充有100 ng ML-1人类干细胞生长因子，100 ng ml-1人类血栓蛋白和100 ng ml-1重组人FMS样酪氨酸激酶3配体。CD34+ HSPC在核反射前的细胞因子存在下解冻并培养24小时。总体而言，根据制造商的建议，使用P3初级细胞X试剂盒（Lonza Bioscience，V4SP-3096），根据制造商的建议，使用P3初级细胞X试剂盒（Lonza Bioscience，V4SP-3096）进行电穿孔。使用脉冲代码DS-130，000 ng pemax或pe7 mRNA和200 pmole合成pegrna或epegrna。根据制造商的建议，使用Quickextract DNA提取溶液（LGC BioSearch Technologies，QE09050）在核反射后3天收集GDNA。如上所述，通过扩增子测序和crispresso2（2.2.11）分析来量化主要编辑结果。

　　CRISPRI屏幕以独立的生物学副本进行。在适当的主或扩展数据图中定义了所有其他实验和分析的样本量（n），并如下所述进行了实验，并进行了实验。图2A中的结果（和扩展的数据图3D）来自一条指定的细胞系一次。图2F中的结果描述了代表性流式细胞仪图（n = 3个独立的生物学重复）。对于所有n≤10的实例，在补充表1-3和7中提供了单独绘制的数据点（在相关或相关的图面板中）和/或数据，或者已公开可用数据，除了我们的PE4和PE5基因组尺度CRISPRI筛选外，已公开可用的数据点，从中尚未识别出大量的基因组基因组ciscale cristri筛选。在编辑条件之间的选择比较在图1和图2中指示。1e，2b，c，3d，4b，c，f，5a，d，f和扩展数据图。3a，b，h，4a，b，5c – e，9a，b，d，10a和11d。这些比较的P值可以在相关的图面板或补充表7中找到。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。