这项研究中使用的细胞系来自ATCC（HEK293T，Vero和Vero E6），Thermofisher Scientific（Expicho-S细胞，自由泳293-F细胞和Expi293F细胞）或通过透介型病毒传递（Expicho-S和HEK293T表达ACE2 ACE2（HEK293T-EAS2-EAS2-acc2））。所使用的细胞系未经过身份验证。通常对细胞系进行支原体污染测试。

　　在症状发作后75天获得了从COVID-19（指定为捐赠者X（52岁的男子））中恢复过的人的样本，并获得了当地机构审查委员会批准的研究方案（瑞士Canton Ticino Ethics委员会）。根据瑞士广州蒂奇诺伦理委员会和米兰路易吉·萨科医院的伦理委员会批准的研究方案，获得了从COVID-19和9个接种疫苗的个人康复的其他9个人的样本。症状发作后14至75天之间收集了从COVID-19的个体中的样本；在第二剂剂量的基于mRNA的SARS-COV-2疫苗后13至20天之间收集了来自接种疫苗的个体的样品。所有捐助者均提供了使用血液和血液成分（例如外周血单核细胞（PBMC），血清或血浆）的书面知情同意。

　　通过用肝素预填充的管进行的管子从抽血中分离PBMC，然后进行Ficoll密度梯度离心。PBMC可以沿SARS-COV-2 S蛋白特异性内存B细胞分类新鲜使用，或储存在液氮中以供以后使用。血清是从使用含有凝块活化剂的管的血液中获得的，然后进行离心，并存储在-80°C下。

　　从新鲜分离的PBMC或在解冻细胞上开始，用CD19 PE-CY7染色并与抗PE珠一起孵育，然后使用LS柱进行阳性选择，从而富含B细胞。将富集的B细胞用抗IGM，抗IGD，抗CD14和抗IGA染色，均标记为PE，并用与链霉亲和蛋白酶Alexa-Fluor 647（Life Technologies）结合的生物素化AVI标签进行预输Sars-CoV-2 s。SARS-COV-2 S特异性IgG+记忆B细胞通过流式细胞仪通过门控进行分类，用于PE阴性和Alexa-Fluor 647阳性细胞。如前所述48，在CPG2006，IL-2，IL-6和IL-21的存在下，在每个孔的间充质基质细胞单层上，将384孔微滴定板种子在384孔微滴定板中播种，如前所述48。7天后，使用高通量VSV SARS-COV-2 S基基微中和化测定法筛选了与SARS-COV-2 RBD和预灌注S的结合以及中和活性。选择二次筛选抗体的抗体是基于对SARBECOVIRUS RBD的反应性以及中和活性的反应性。通过RT -PCR获得抗体VH和VL序列，mAb表示为重组人类Fab片段或IgG1（G1M3同种型）。如前所述22，用重链和轻链表达向量瞬时转染外cho细胞。

　　在Unicorn软件版本5.11版（构建407）上使用HITRAP蛋白A柱（Cytiva）在äktaXpress FPLC（Cytiva）上进行亲和力纯化，用于全长的人体和仓鼠mabs，并使用capturesElect Ch1-X-XL Minichrom柱（用于fabisher fab fab fab fab fab a fab a fab a fab a fab a fab sipers p bs mosile）。Buffer exchange to the appropriate formulation buffer was performed with a HiTrap Fast desalting column (Cytiva).通过过滤通过0.22-μm滤波器对最终产物进行灭菌，并在4°C下储存。

　　使用Mega X和CLC主工作台21.0.3（Qiagen）生成SARBECOVIRUS子属中菌株的比对和系统发育树。从Gisaid和NCBI中检索以下序列：A021（AAV97986.1）。病毒序列从Gisaid Epicov项目（https://www.gisaid.org/）获得。Analysis was performed on sequences submitted to GISAID up to 2 April 2021. The S protein sequences were either obtained directly from the protein dump provided by GISAID or, for the latest submitted sequences that were not yet incorporated in the protein dump on the day of data retrieval, from the genomic sequences with exonerate49 2 2.4.0–haf93ef1_3（https://quay.io/repository/biocontainers/exonerate?tab=tags）使用蛋白质与参数-m protein2dna -refine full -minintron 999999 -Percent 20和使用persent yp_009724390.1 and commita。使用MAFFT50 7.475 – H516909A_0（https://quay.io/repositority/repositority/biocontainers/mafft?tab = tags）使用MAFFT50 7.475 – H516909A_0进行多个序列对齐。丢弃了含有超过10％模棱两可的氨基酸或小于80％规范蛋白长度的S序列。总共使用923,686个序列进行分析。然后，与使用BioStrings 2.56.0的R 4.0.2（https://www.r-project.org/）相比，将变体提取。

　　在50 mL生物反应器中，将外cho-S细胞以每毫升的6×106细胞为6×106细胞。S-编码质粒HKU3（QND76020.1），rs3367（agz48818.1），YN2013（aia62330.1），rs4874（ato98205.1），rs4255（rs4255（ATO98132.1），ZXC21（AVP78042.1），ZC45（AVP78031.1），RP/SHAANXI2011（AGC74165.1），RM1/2004（ABD75332.1）（ABD75332.1），RF1-2004（RF1-2004（YP_003858584.1），RATG13（QHR63300.2），PC4-127（AAU933318.1），SARS-COV-2（YP_009724390.1），LYRA3（lyla3（AAP13441.1），AS6526（ATO98108.1），BTKY72（APO40579.1），RMYN02（EPI_ISL_412977），PANGOLIN_GUANGDONG-2019（EPI_ISL_410721），PANGOLIN_ISL_410721和PANGOLIN-GUANXI-2017（EPIE_410721）将HKU3-12（ADE34812.1）稀释在冷optipro SFM（Life Technologies，12309-050）中，与Expifoctamine Cho Reagent（Life Technologies，A29130）混合，并添加到细胞中。然后将转染的细胞与8％CO2在37°C下孵育，轨道振动速度为250 R.P.M.（轨道直径为25毫米）持续42小时。收集瞬时转染的外籍细胞，并在洗涤缓冲液中洗涤两次（PBS 2％FBS，2 mM EDTA）。对细胞进行计数并分布到圆底96孔板中（康宁，3799），并与S2X259 MAB连续稀释液从50μgml-1孵育。Alexa Fluor647标记的山羊抗人IgG二抗（Jackson Immunoresearch，109-606-098）以2μgml-1制备，并在两个洗涤步骤后添加到细胞中。然后将细胞洗涤两次，并重悬于WASH缓冲液中，以在ZE5细胞仪（Biorad）处进行数据采集。

　　野生型SARS-COV-2 RBD（具有N末端信号肽和“ ETGT”，C末端8×His TAG）在37°C的EXPI293F细胞中表达，在10μM链球菌的存在下，在37°C和8％CO2中表达。使用Expifectamine 293转染试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行转染。转染后四天收集细胞培养上清液，并补充10×PBS，最终浓度为2.5×PBS（342.5 mM NaCl，6.75 mM KCl和29.75 mM磷酸盐）。为了结晶，使用5 ml Histalon Superflow弹药筒（Takara Bio）纯化野生型SARS-COV-2 RBD，然后使用SuperDex 200增加10/300 GL POR-EQU-EQU-EQUILIGRAL，在20 mm Tris-HCl pH 7.5，150 mm NACL中使用SuperDex 200增加10/300 GL PROIMARGING。将RBD用EndoH脱脂，并与1.3倍摩尔过量的S2X259 Fab和S2H97 Fab混合。将复合物在超级螺旋200增加10/300 GL柱上纯化，并用20 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mm NaCl预取平衡。SARS-COV-2 S HEXAPRO蛋白用于冷冻电子显微镜（Cryo-EM）单粒子研究，如前所述21。

　　将九十六的一半面积良好（康宁，3690）在4°C下与25μl的sarbecovirus rbd蛋白WIV1（AGZ48831.1），Anlong-112（Ari44804.1），YN2013（YN2013（AIA62330.1），SC2018（QDFFF543）一起在4°C覆盖过夜。（AVP78031.1），RP/Shaanxi2011（AGC74165.1），BM48-31/BGR/2008（YP_003858584.1），Ratg13（QHR633300.2）BTKY72（APO40579.1），Pangolin_Guangdong-2019（EPI_ISL_410721）和SARS-COV-2 RBD突变体，在PBS pH 7.2中以5μgml-1制备。然后将板用PBS 1％BSA（Sigma-Aldrich，A3059）阻塞，然后在室温下与MAB系列稀释液一起孵育1小时。在使用PBS 0.05％Tween 20（PBS-T）（Sigma-Aldrich，93773），山羊抗人IgG二级抗体（Southern Biotech，2040-04）进行4次洗涤步骤之后，并在室温下孵育1小时。然后将板用PBS-T和4-硝基苯基磷酸盐（PNPP，Sigma-Aldrich，71768）底物洗涤四次。孵育30分钟后，通过板读取器（Biotek）测量405 nm处的吸光度，并使用Prism GraphPad 9.1.0绘制数据。

　　S2X259和S2H14 mAb被用EZ-link NHS-PEG固相生物素化试剂盒（Thermofisher Scientific）进行生物素化，并测试与RBD结合，以将使用Zeba Spin Desalting柱（Thermofisherscientic）脱盐后，将其设置为最佳浓度，以在测定中使用，以在测定中使用。将半区域的96孔板在4°C下与SARS-COV-2 RBD-MOUSE FC标签涂覆过夜，以PBS中的1μgml-1稀释。在与阻塞器酪蛋白（Thermofisher Scientific）进行阻塞步骤之后，在室温下30分钟将阻滞剂酪蛋白中的串行血浆稀释液孵育。在以浓度达到80％的最大结合的浓度下加入生物素化的S2X259或S2H14，并在室温下孵育30分钟。将碱性磷酸酶共轭链霉亲和素（Jackson Immunoresearch）以0.5μgml-1的稀释蛋白稀释，并在先前用PBS 0.05％tween 20洗涤4次的板上添加45分钟孵化后4次洗涤，在45分钟孵化后，将板和4-硝基苯基磷酸磷酸磷酸化的材料浸泡，以供摄入1 hore producation。测量在405 nm处的吸光度，并计算抑制百分比如下：（1-（光密度（OD）样品 - OD阴性对照）/（OD阳性对照-OD -OD阴性对照））×100。

　　为了产生SARS-COV-2 S MLV伪型病毒，将HEK293T细胞播种在补充10％FBS的DMEM中的10厘米菜肴中。第二天，使用X-Tremegene HP DNA转介剂（ROCHE）的说明，使用含有D19 C末端截断的SARS-COV-2 S糖蛋白编码质粒51，MLV GAG-POL包装构建体和记者PTG-LUC，并使用X-Tremegene HP DNA转介剂（ROCHE）使用。然后将细胞与5％CO2在37°C孵育72小时。通过离心400g收集上清液并从细胞碎屑中清除，并存储在-80°C下。

　　为了中和测定，将Vero E6细胞以每个孔的20,000个细胞为白色96孔板（Perkinelmer），并在37°C下用5％CO2在100μLDMEM中培养过夜，并补充了10％FBS和1％青霉素 - 链霉菌素。第二天，用10μgml-1 TPCK处理的胰蛋白酶（Worthington Biochem）激活MLV-SARS-COV-2假病毒在37°C下1 h。将各种浓度的重组抗体与活化的假病毒在37°C下孵育1小时。然后将VERO E6细胞用DMEM洗涤，并加入50μL假病毒 - 示例混合物，并在37°C下与5％CO2孵育2小时。孵育后，加入了50μl含有20％FB和2％青霉素 - 链霉素的DMEM，并将细胞在37°C下与5％CO2孵育48小时。在这48小时的感染之后，将培养基从细胞中除去培养基，每孔的Bio-Glo（Promega）50μl用带有Ca2+ Mg2+（Thermo Fisher）的PBS稀释的Bio-Glo（Promega）（Promega）将其添加到细胞中，并在黑暗中孵育15分钟，然后在Synergy H1 Hybrid Mybrid多模式读取器（生物毛发）上阅读，然后在读取上。进行了测量，以重复的方式进行，将相对光单位（RLU）值转换为中和百分比，并用拟合GraphPad Prism 9.1.0中的非线性回归曲线绘制。

　　SARS-COV-2 S（CAD0240757.1），RATG13 S（QHR63300.2），Pangolin-Guangdong S（QLR06867.1），Pangolin-Guanxi S（QIA48623.1）（QIA48623.1），SARS-COV S（SARS-COV S（SARS-COV S（YP 009825051.1），WIV1）WIV16 S (ALK02457.1), RsSHCO14 S (AGZ48806.1), the variant of concern B.1.429 S (QTC60823) and the variants of concern, N437K, Y453F, B.1.1.7 S, B.1.351 S and P.1 S with their corresponding mutations inserted in the SARS-CoV-2 S（CAD0240757.1）使用骨干来伪型VSV。使用293T细胞在10厘米菜肴中播种的293T细胞制备假病毒。简而言之，在制造商的指示下，使用质粒编码的质粒编码了相应的S糖蛋白（相应的S糖蛋白），用质粒编码质粒来转染1％青霉素 - 链霉素的DMEM中的细胞。转染后一天，将细胞用VSV感染（G*ΔG-荧光素酶），在2小时后，将感染的细胞用DMEM洗涤4次，然后再添加培养基补充抗VSV-G抗体（I1-小鼠杂交瘤超中午1至50，从CRL-2700，ATCC稀释1至50）。接种后18小时收集颗粒，通过以2,000g离心5分钟从细胞碎片中阐明，并使用30 kDA切断的膜浓缩10次，并用于中和实验，在-80°C下等分并冷冻，直到中和实验中使用。

　　为了中和，在补充10％FBS的DMEM中表达ACE252的稳定293T细胞，将1％的青霉素 - 链霉素以40,000个细胞接种，每孔以40,000个细胞播种到透明的底部白色壁壁96孔板中，并在37°C下培养过夜。在DMEM中制备了相应mAb的十二点三个连续稀释液，并在抗I1-小鼠杂交瘤上网抗抗-VSV-G抗体的情况下向每个mAb稀释剂中添加了1：1，将1：1加入1：1。在37°C下孵育45分钟后，将40μl的混合物添加到细胞中，感染后2小时，将40μLDMEM添加到细胞中。17–20 h后，将每孔的单GLO-EX底物（Promega）添加到细胞中，并在黑暗中孵育5-10分钟，然后在varioskan lux板读取器（Thermofisher）上读取。用两种独立的假性病毒的独立生产进行了测量，并将RLU值转换为中和百分比，并用拟合GraphPad Prism 9.1.0中的非线性回归曲线绘制。

　　如先前所述的53，复制缺陷的VSV伪病毒表达SARS-COV-2 S蛋白是通过一些修改而产生的。使用MultoSpep重叠扩展PCR方案5,7获得了编码与用于产生SARS-COV-2-VSV所关注的变体的SARS-COV-2 S糖蛋白相对应的质粒。简而言之，对各种关注谱系变体的突变进行了编码，用于扩大从PCDNA_SARS-COV-2_S D19质粒编码编码C-末端截断的S蛋白的SARS-COV-2 S的顺序，重叠的片段，这些片段的DNA序列已显示出更好的表达细胞30。在琼脂糖凝胶上分离放大的重叠片段，并使用Illarta GFX PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒（Merck KGAA）纯化。通过在不添加引物的情况下执行10个循环的PCR，然后使用一对携带与载体骨架同源的单个悬垂物的单个外部引物进行30个PCR循环连接，然后进行30个PCR周期。然后，使用Takara In-Rupusion HD克隆套件将最终的PCR产品克隆到PCDNA3载体中，按照制造商的说明。

　　根据制造商的说明，将Lenti-X 293T细胞（Takara，632180）以每CM2的密度为5×106细胞的密度为5×106细胞，并根据制造商的说明，用Transit-Lenti（Mirus，6600）用10μg的S表达质粒（Mirus，6600）转染。转染后一天，细胞被VSV-LUC（VSV-G）（Kerafast，EH1020-P.M。）感染1小时，用PBS冲洗了3次，然后在37°C的完整培养基中再孵育24小时。通过离心，过滤（0.45μm），将细胞上清液阐明，并在-80°C下冷冻。

　　对于VSV伪病毒中和测定，在补充10％FBS的DMEM中生长Vero-E6细胞，并以2×104个细胞的密度为2×104个细胞，并将其播种到培养板96，白色不透明的96孔微板岩（Perkinelmer）。第二天，将mAB在预热的完整培养基中连续稀释，以1：1的比率与假病毒混合，并在37°C下在圆底聚丙烯板中孵育1小时。吸出细胞中的培养基，并将50μl病毒-mab复合物添加到细胞中，然后在37°C下孵育1小时。然后将另外100μl预热的完整培养基添加在配合物的顶部，并孵育16-24小时。在重复的井中测试了条件。

　　然后从细胞和50μl的稳态Plus（Perkin Elmer）从Ca2+ Mg2+的PBS中稀释50μL的1：2稀释液从细胞中吸出病毒 - 型培养基。将板在室温下孵育10分钟，然后在协同H1混合多模式读取器（Biotek）上进行分析。在两个独立的实验中进行了测量，然后将RLU值转换为中和百分比，并用非线性回归曲线拟合，上限等于100，而较低的约束等于0（版本9.1.0）。跨生物重复的半最大抑制浓度（IC50）值表示为算术平均值±S.D。

　　将VERO E6细胞以每孔20,000细胞的形式将白色的96孔板（Perkinelmer）铺成，并在37°C下在100μl培养基（DMEM 10％FBS 1％青霉素 - 链霉菌素）中培养过夜。第二天，S2E12和S309抗体在感染培养基（DMEM 10％热灭活的FBS 1％1％青霉素 - 链霉素）中串行稀释，并以基质格式混合，然后再与SARS-COV-2 B.1.351 PSEUDOVIRUS（MOI）（MOI）0.1 co2 co2 co2 co2 covirus b.1.351 pseudovirus（MOI）0.1 co2 5％°C 5％。吸出细胞培养基，并在细胞上加入50μl的mAb -pepeudovirus混合物。在37°C 5％CO2孵育1小时后，将100μl感染培养基添加到细胞中，并在接下来的20小时内继续孵育。为了读出结果，除去培养基，并在室温下在黑暗中添加50μl每孔（Perkinelemer）1：2在PBS+ Ca2+和Mg2+中稀释15分钟。使用具有1秒积分时间的协同H1读取器（Biotek）测量发光信号。使用MacSynergy II分析了数据，并使用99.9％的置信度获得的协同图用GraphPad Prism 9.1.0使用图形阐述。

　　通过抑制入门抑制测定的真实SARS-COV-2使用SARS-COV-2-NLUC确定，SARS-COV-2-NLUC是SARS-COV-2的传染性克隆（基于2019-NCOV/USA_WA1/2020菌株），该克隆编码纳米酸酯酶代替病毒ORF7的纳米酸酯酶，并证明了可比较的生长动力学生长动力学与野生型Virus54。将VERO E6细胞播种成黑色壁，透明底板96孔板，每孔2×104细胞，并在37°C下过夜。第二天，在感染培养基（DMEM + 10％FBS）中制备了9点四倍的mAB连续稀释液。将SARS-COV-2-NLUC在每个细胞的最终MOI中以0.01斑块形成单位稀释在感染培养基中，添加到mAb稀释液中，并在37°C下孵育30分钟。从VERO E6细胞中除去培养基，加入mAb - 病毒复合物并在37°C下孵育24小时。从细胞中除去培养基，根据制造商的建议添加纳米-GLO荧光素酶底物（Promega），在室温下孵育10分钟，并在Victor Nivo板读取器（Perkin Elmer）上定量荧光素酶信号。

　　表面等离子体的共振结合测量是使用BIACORE T200仪器进行的，运行缓冲液为Cytiva HBS-EP+（pH 7.4），并在25°C下进行所有测量。对于Fab结合，将抗Avitag PAB（用于捕获S蛋白）或链霉素XT（用于捕获RBD）共价固定在CM5芯片上。S2X259 Fab浓度为11、33、100和300 nm，作为单周期动力学运行。使用BIACORE评估软件拟合了双重参考提取的数据与1：1结合模型，该软件可为S结合数据产生“明显的KD”（KD，APP），因为动力学也反映了S构象动力学。对于SARS-COV-2 S，解离速率太慢而无法拟合，因此KD据报道APP作为上限。高于1μm的KD是近似值，并根据理论上的RMAX设置为常数确定。

　　生物素化的RBD（野生型，N501Y，K417N-E484K-N501Y或K417T-E484K-N501Y）在未稀释的10倍动力学缓冲液（PALL）中以5ngμl-1的固定在5ngμl-1的情况下固定到SA传感器，直到SA传感器的负载水平为1.1 nm。在600 s解离之前，使用了600 s的关联，在10 nm的未稀释动力学缓冲液中进行1：3稀释率系列，以确定蛋白质 - 蛋白质亲和力。数据是基线提取的，并使用PallFortébio/Sartorius分析软件（版本12.0）安装了图。数据绘制在Prism 9.1.0中。

　　使用Biolayer干涉法用于使用八位骨red96（Fortebio）评估S2X259与S309和S2E12的竞争。所有试剂均以指定浓度在动力学缓冲液（PBS 0.01％BSA）中制备。以8μgml-1的形式制备了His标记的SARS-COV-2 RBD，并在预氢的抗Penta-His-His生物传感器（Sartorius）上加载2.5分钟。然后将生物传感器移至包含S2X259 mAb的溶液中，并记录了7分钟的关联。随后将第二个关联步骤用于S2X259（作为对照），S309和S2E12 MABS溶液以20μgml -1的形式进行，并记录7分钟。使用GraphPad Prism 9.1.0导出响应值并绘制。

　　将稳定表达野生型SARS-COV-2 S的CHO细胞重悬于WASH缓冲液（PBS 1％BSA，2 mM EDTA）中，并在37°C下用10μgml-1 TPCK-Trypsin（Worthington Biiochem）处理30分钟。然后将细胞洗涤并分布到圆形的96孔板中（每个孔90,000个细胞）。将S2X259在37°C下以15μgml -1的终浓度添加到180分钟的细胞中。在不同的时间点（5、30、60、120和180分钟）收集细胞，在4°C下用洗涤缓冲液洗涤，并与1.5μgml-1次级山羊抗人类IgG孵育20分钟。将细胞洗涤并重悬于洗涤缓冲液中，并用ZE5 FACS（Biorad）分析。

　　用生物发光的报告基因测定法进行了人FcγRIIIA的S2X259依赖性激活。瞬时表达全长野生型SARS-COV-2 S（靶细胞）或全长预融合稳定的SARS-COV-2 S，其中包含2P突变和S1/S2 FURIN裂解位点突变（RRARS先前描述的SGAG）与不同量的MABS孵育。15分钟孵化后，在效应比率与fcγRIIIA和5：1的效应比率为6：1时，在效应比率为6：1时添加了稳定表达FcγRIIIA受体（V158变体）或FcγRIIA受体（H131变体）和NFAT驱动的荧光素酶基因（效应细胞）的Jurkat细胞。通过NFAT途径激活产生的荧光素酶信号来量化信号传导。根据制造商的说明（Promega），使用Bio-Glo荧光素酶测定试剂在37°C下与5％CO2在37°C下孵育20小时后测量发光。

　　Ku Leuven研发已开发并验证了SARS-COV-2叙利亚仓鼠感染模型36,39。SARS-COV-2（Betacov/BETACOV/GHB-03021/2020-EPI ISL 109 407976 | 2020-02-03），与原型Wuhan-Hu-1 2019-ncov（GenBank登录号MN908947.3）应变最密切相关。1920/Rega-1920/2021;通过测序和系统发育分析证实了与原型Wuhan-Hu-1 2019 SARS-COV-2的密切相关性，并与B.1.351谱系相关。通过对Vero E6细胞的串行传播分离感染性病毒，并通过SARS-COV-2 WUHAN-HU-1传递6，并使用B.1.351病毒用于该研究。病毒库存的滴定是通过先前发表的Method55对Vero E6细胞终点稀释确定的。根据机构指南，这项工作是在Ku Leuven Rega Institute（3CAPS）的High Containment A3和BSL3+设施中进行的AMV AMV 30112018 SBB 219 2018 2018 0892和AMV 23102017 SBB 219 20170589 20170589根据机构指南。

　　叙利亚仓鼠是从Janvier实验室购买的，并在通风的隔离笼中每两个仓鼠（Isocage N Biocontainment System，tecniplast）购买，并随意使用食物，水和笼子富集（木块）。住房条件和实验程序得到了KU Leuven动物实验伦理委员会的批准（许可证P065-2020）。仓鼠是随机的，并根据该动物模型以前的经验选择样本量。为了评估6-10周大的女性仓鼠的预防疗效，通过在1、4、4、5和25 mg kg-1或S2X259和S2X259和S309和S309 MABS（1 mg kg-kg-kg-kg-kg-kg kg-kg-kg-kg-1）48 hasasal Intrection的1、4、5和25 mg kg-1中使用S2X259 MAB进行施用。μL接种物。在感染之前收集血液样本，并获得血清进行药代动力学分析。为了评估治疗疗效，用同型对照抗体（20 mg kg-1）或S2X259 MAB（在20、10或5 mg kg-1）用SARS-COV-2在SARS-COV-2感染后，用同种型对照抗体（20 mg kg-1）或S2X259 MAB（20、10或5 mg kg-1）通过腹膜内治疗6-8周大的叙利亚仓鼠。杀死仓鼠时收集血液样本，并获得血清进行药代动力学分析。监视仓鼠的外观，行为和重量。在感染后第4天，通过腹膜内注射500μLDolethal（200 mg ml -1五丁质钠，vétoquinolSA），对仓鼠安乐死。在350μlRLT缓冲液（rneasy mini kit，Qiagen）中收集肺，使用珠子破坏（先例）和离心（10,000 r.p.m.，5分钟，4°C）中均质化，以颗粒细胞碎片。根据制造商的说明，使用Nucleospin试剂盒（Macherey-Nagel）提取RNA。使用ITAQ通用探针一步RTQPCR试剂盒（Biorad）在LightCycler96平台（ROCHE）上进行RT-QPCR，并用N2引物和针对NucleocapsId36的探针进行。SARS-COV-2 cDNA（IDT）的标准 用于表达每毫克组织或每毫升血清的病毒基因组拷贝。为了量化感染性SARS-COV-2颗粒，对96孔板的汇合E6细胞进行了终点滴定。用于RNA定量和病毒负荷滴定的仓鼠衍生的样品是由对分析样品的治疗组视而不见的技术人员。病毒滴度通过先前发表的方法55计算，并表示为每毫克组织的TCID50。

　　先前描述的深度扫描方法56用于识别逃避S2X259结合的RBD突变。简而言之，几乎所有可能的氨基酸变化与ACE2结合和wuhan-hu-1 sars-cov-2 rbd序列中的RBD折叠兼容的重复文库在酵母29,56的表面上表达。文库在59 ng ml-1 S2X259抗体（90％与酵母菌脱落的SARS-COV-2 RBD结合的90％有效浓度）中，并在等源性驾驶结合实验中确定），并使用荧光激活的细胞分类（FACS）选择了先前描述的RBD+细胞，以前均表现出56.抗属性的抗属性抗体，以选择RBD+细胞。如前所述57，在选择前后对文库进行了测序，以确定每天的逃生部分。实验是通过独立生成的突变库进行了重复的，我们报告了重复项的平均突变体逃生部分。可在GitHub上获得原始逃生分数：https：//github.com/jbloomlab/sars-cov-2-rbd_map_map_vir_mabs/blob/main/main/results/supp_data/supp_data/s2x259_raw_data.csv。深度突变扫描选择的分析和代码的详细步骤可在github上获得：https：//github.com/jbloomlab/sars-cov-2-rbd_map_map_vir_mabs。

　　如前所述30,31，使用VSV-SARS-COV-2嵌合体选择SARS-COV-2 S耐药突变体的SARS-COV-2 S耐药突变体。简而言之，通过在覆盖层中指示的mAB上的vero细胞上分离斑块，恢复了耐能力性的突变体。通过在100的MOI下进行中和测定确定覆盖层中mAb的浓度。在MAB存在的情况下，在Vero细胞上将逃生克隆固定在Vero细胞上，并在MA104细胞上放大了琼脂糖插头中的斑块，并在MA104细胞上使用介质中的mab放大。在34°C下，在199个中含有2％FBS和20 mM HEPES pH 7.7（Millipore Sigma）的培养基的MOI上，在MA104细胞上放大病毒量。在广泛的细胞质效应时收集病毒上清液，并通过1,000g离心5分钟来阐明细胞碎屑。等分试样保持在-80°C。使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）从VSV-SARS-COV-2突变病毒中提取病毒RNA，并使用onESTEP RT-PCR试剂盒（Qiagen）扩增S。通过Sanger测序（Genewiz）鉴定突变。在存在或不存在抗体的情况下，通过随后的病毒感染来验证它们的耐药性。简而言之，将Vero细胞接种到12孔板中以进行过夜。使用DMEM连续稀释该病毒，并在37°C下感染细胞1小时。在34°C的存在或不存在MAB的情况下，用琼脂糖叠加层培养细胞2天。在生物分子成像仪上扫描板，并在感染后48小时显示EGFP的表达。

　　SARS-COV-2-RBD – S2X259 – S2H97 FAB复合物的晶体通过坐式滴蒸气扩散在20°C下获得。将5.7 mg ml-1的总共200 nL复合物与含有0.12 m单糖混合物，20％（v/v）乙二醇，10％（w/v）PEG 8000，0.1 m tris（base）/Bicine pH 8.5，0.5，0.02 m sodium cliride，0.01 mS pH 6和3％（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V/3％）（V）（V）（v/v）（V/3％），将5.12 m的含母液溶液混合在一起。晶体在液氮中闪烁。数据是在斯坦福同步辐射照明设施的梁线9-2上收集的。使用XDS软件包58处理数据，以在太空组P21中的最终数据集为2.65Å。RBD – S2X259 – S2H97 FAB复合结构是通过分子替换来解决的，使用phaser59的启动模型中的Phaser59（由SARS-COV-2 RBD（PDB代码7JX3）组成）和S2X259和S2X259和S2H97 Fabs使用Molecular Operative Groups（MOE）的S2H97 Fabs的同源模型（MOE）软件（MOE）软件（MOE）构建的同源模型（MOE）（https://www.chemcomp.com）。使用COOT60，ISOLDE61，REFMAC562和MOE（https://www.chemcomp.com）进行了几个随后的模型构建和改进，以达到三元建筑的最终模型。

　　重组表达和纯化的FAB S2X259和SARS-COV-2 S HEXAPRO在1 mg Ml-1的1 mg Ml-1中与1小时的1.2摩尔过量的FAB在1小时内孵育。Three microlitres of the complex mixture were loaded onto freshly glow discharged R 2/2 UltrAuFoil grids (200 mesh) or lacey grids covered with a thin layer of manually added carbon, before plunge-freezing using a vitrobot MarkIV (ThermoFisher Scientific) with a blot force of 0 and 7–7.5 s blot time (for the UltrAuFoil grids) or with a blot force of −1 and2.5 s的印迹时间（用于蕾丝薄碳网格）在100％湿度和21°C下。

　　在FEI Titan Krios透射电子显微镜下以300 kV运行并配备了Gatan K2 Summit直接检测器和Gatan量子GIF Energy滤波器，该数据以20 eV的速度宽度为20 eV。使用Leginon63以130,000×的标称放大倍数进行自动数据收集，超分辨率像素大小为0.525Å。剂量率调整为每秒钟的每像素8个计数，每件电影的分数在200毫秒的50帧中进行分级。从倾斜的30°和55°倾斜的超富侧带收集了两个数据集，以避免粒子优先取向。第三个数据集收集在覆盖有薄薄碳的蕾丝网格上。收集的三个数据集，总计为6,786个显微照片，其散焦范围在-0.8至-2μm之间。对于每个数据集，电影框架对齐，显微镜对比度转移函数参数的估计，使用warp64进行粒子拾取和提取。将粒子图像用800个像素2提取，并将其纳入400，产生1.05Å的像素大小。合并了三个数据集，并使用CryoSparc65进行了两轮无参考的2D分类。随后，使用Relion 66,67进行了使用PDB代码6VXX作为初始模型的50个迭代的3D分类，而无需施加对称性。使用非均匀的改进进行了三维修补68。从每个数据集中的粒子图像进行贝叶斯抛光69对其进行合并，然后将它们合并以在CryoSparc中进行另一轮不均匀的细化，然后进行每颗颗粒的Defocus细化和再次不均匀的细化。为了提高s – s2x259接口的密度， 粒子是对称膨胀的，并进行了依赖焦点3D分类，而无需使用包含RBD和S2X259变量域的软面膜来精炼角度和移动。选择了属于具有最佳局部密度的类别的颗粒，并使用CryoSparc进行局部细化。使用CryoSparc进行了局部分辨率估计，过滤和锐化。报告的分辨率基于0.143标准的金标准傅里叶壳相关性，并根据高分辨率噪声取代的软掩模校正了傅立叶壳相关曲线70。

　　UCSF CHIMERA71和COOT60用于将原子模型（PDB代码6vxx或6vyb）拟合到冷冻em地图中，并手动构建了FAB变量域。S2E12是在本地精制的地图中构建的，随后使用Fab Crystal结构进行了验证。使用Rosetta使用Rosetta使用锐化的MAPS72,73对模型进行完善和放松。验证使用Phenix74，Molprobity75和Private 76。使用UCSF Chimerax77生成数字。

　　可以根据要求提供本研究生成的材料，并且可能需要进行材料转移协议。SARS-COV-2 RBD突变库（编号1000000172）和未成熟的父母质粒（第166782号）

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。