所有动物实验均根据多伦多表（TCP）和辛辛那提儿童医院医疗中心批准的机构和国家准则进行。在受控条件下（不含病原体，12 h：12 h的光：黑暗循环，19–22°C，湿度为45–65％），将小鼠饲养，并随意获得食物和水。我们在所有笼子中以塑料隧道和嵌套材料的形式添加了环境富集。临床症状定义了动物的福利。其中包括可见的质量，任何程度的降低流动性/痛苦，体重减轻或出血证据。人道干预点是根据人道干预点指南和癌症模型 - 人类干预点指南的机构标准操作程序（SOP）设置的。简而言之，成年小鼠中超过1,700 mm3的肿瘤大小被认为是癌症模型的终点。没有小鼠超过我们动物袜中规定的人道终点。该研究都使用了雄性和雌性小鼠。

　　α-CRE小鼠（P. Grus，E14 – P400），B6.129P2（CG）-BraftM1MMCM/J（Jackson Laboratory，菌株，017837，通用名称：Brafca，年龄p0 – P42），B6.CG-GT（ROSA）26sortm14（Rosa）26sortm14（cag-tdttdtttdttdttdtdtdtdtdtdmato），（Jackson Laboratory，007914，年龄P0 – P91），B6.129-GT（ROSA）26SORTM1（CRE/ERT2）TYJ/J（Jackson Laboratory，008463菌株，008463，年龄p0 – P91），B6.129S4-KRASTM4TYJ/JERKRASTM4TYJ/JERGESSON LABORTAR EGRASTSSON LABOROTAL，EGRASSSSSSSSSSSSSSON LABOROTAL，WERMSSSS SONS SERTORATY – WERTOROTAL，PL0，PR0，PR0，0081717179，008171717171797179.Cdk1f/f (D. Santamaria and M. Barbacid, age P0–P400), Cdk2f/f (D. Santamaria and M. Barbacid, age P0–P400), p107−/− mice (M. Rudnicki, age P0–P400), p27CK−/CK− mice (A. Besson and J. Roberts, age P0–P400),P27T187A（A. Besson和J. Roberts，年龄P0 – P400），P53F/F小鼠（A. Berns，E18 – P56），RBF/F小鼠（A. Berns，A.Berns，E14 – P400），Skp2 - / - nakayama，akayama，agayama，年龄p0 – P0-pc400，skp2 - / - -E18 – P60），TETO-CRE（Whitsettage年龄E18 – P60）和Z/RED（Jackson Laboratory，005438，年龄E16年龄）小鼠的小鼠保持在混合背景上。在同一垃圾和至少四到六个垃圾中比较了不同的基因型。我们没有注意到单独的垃圾中的任何表型差异。根据杰克逊实验室指南，使用已建立的引物进行基因分型（补充表6）。

　　α-CRE小鼠与RBF/F小鼠63,64和P107 - / - 小鼠配对以产生α-CRE。rbf/f; p107 - / - （rb/p107 dko）小鼠，已建立的视网膜母细胞瘤小鼠Model16。将DKO小鼠与SKP2 - / - （参考文献66），CDK1F/F（参考文献32），CDK2F/F（参考文献67），P27CK-（参考文献68）和P27T187A（P27KI）（P27KI）69鼠标69小鼠，以阐明tumorigeNesiss的机制。使用已建立的引物通过PCR确定基因型（补充表6）。p107 - / - 窝窝用作对照。

　　SPC-RTTA转基因小鼠70和Tet-opr-trgenic小鼠46,47,71被与RBF/F小鼠配对63,64和P53F/F MICE72，以生成SPC-RTTA; TET-obre; TET-obre; rbf/f; rbf/f; p53f/f; p53f/f; p53f/f; p53f/f; p53f/f; p53f/f; p53f/f; p53f/f; p53f/f; p53f/f; p53f/f;通过使用已建立的引物为46,73的PCR分析确定基因型（补充表6）。通过指定的胚胎日（E）0.5分配妊娠年龄。在每种药物给药之前，新鲜制备了50×强力霉素溶液（50％乙醇中的50 mg ml -1），并在水中或PBS中稀释进行注射。通过腹膜内注射E0.5 – E1.5在0.5 mL PBS中用125μg强力霉素（Sigma，D9891）处理大坝，并以1.0 mg mL -1的最终浓度在饮用水中施用多西环素。由于强力霉素的光敏度，强力霉素水每周被替换3次。

　　将Rosa-Creert2和AI14（TDTOMATO）转基因小鼠与Rbf/f（参考文献63,64）和p53f/f小鼠配对，以生成Creert2; TDTomato; tdtomato; rbf/f; rbf/f; p53f/f小鼠，一种已建立的SCLC动物动物型Model47。通过使用已建立的引物为46,73的PCR分析确定基因型（补充表6）。Creert2; TDTOMATO同窝小鼠用作对照。两个creert2;tdtomato; rbf/f; p53f/f小鼠，对照小鼠在0.45 ml玉米油（Sigma，C8267）中用100 mg kg -kg -1体重的他莫昔芬（Sigma，t5468）通过p28的腹膜内注射，并在4周后摄入肺部。

　　Rosa-Creert2和AI14（TDTOMATO）转基因小鼠与RBF/F小鼠配对63,64，以生成Creert2; tdtomato; tdtomato; rbf/f/f小鼠。通过使用已建立的引物通过PCR分析确定基因型（补充表6）。tdtomato; rbf/f同窝仔的小鼠用作对照。Creert2; tdtomato; rbf/f小鼠和对照小鼠均在0.45 ml玉米油中用100 mg kg -1体重的他莫昔芬（Sigma，T5468）处理一次，一次通过腹膜内注射P28或P56和Pituit puituit puctuitary puctectary pripterare in Corn Oil（Sigma，c8267）。

　　将Rosa-Creert2和AI14（TDTOMATO）转基因小鼠与LSL-Krasg12d小鼠配对，以生成Creert2; tdtomato; krasg12d小鼠。KRASG12D小鼠是建立良好的NSCLC小鼠Model48。通过使用已建立的引物通过PCR分析确定基因型（补充表6）。Creert2; TDTOMATO同窝小鼠用作对照。为了优化他莫昔芬治疗以获得多种细胞类型的异位分裂，我们用7剂（0.1、1、2.5、25、50、100、100、250 mg kg -1体重）处理了这些小鼠。对于0.1–25 mg kg -1剂量，TDTOMATO+细胞的总百分比与剂量相关，但在较高水平的情况下达到了平稳性。但是，尽管0.1-50 mg kg -1剂量诱导了SPC+ AT2细胞的异位分裂，但它并未诱导CGRP+神经内分泌细胞和CCSP+俱乐部细胞的异位细胞分裂，而是100和250 mg kg -1剂量诱导的异位细胞诱导的异位细胞分裂所有三种细胞类型。在这项研究中，我们使用了100 mg kg -1剂量。两个creert2; tdtomato;Krasg12d小鼠和对照小鼠用100 mg kg -1体重的他莫昔芬（Sigma，T5468）在指示的年龄在0.45 ml玉米油中（Sigma，T5468）处理，并在2-4周后通过指示的年龄在指定的年龄进行2-4周。

　　将Rosa-Creert2和AI14（TDTOMATO）转基因小鼠与Brafca小鼠配对，以生成Creert2; tdtomato; brafca小鼠。通过使用已建立的引物通过PCR分析确定基因型（补充表6）。Creert2; TDTOMATO同窝小鼠用作对照。Creert2; tdtomato; Brafca小鼠和对照小鼠均在0.45 ml玉米油（Sigma，C8267）中用100 mg kg -kg -1体重的他莫昔芬（Sigma，t5468）在4周时内注射，并在2周后2周收集肺。

　　对于细胞周期持续时间分析，将动物皮下注入一次EDU（Sigma，900584。900584。30µg每克体重），以标记所有细胞（在P8时DKO视网膜，Rb - / - 位垂体为4或6周，年龄在4或6周龄；7、8和13周龄，6周龄时Brafca肺）。2.5 h后，皮下注射了一次BRDU（Sigma，B5002。每克体重100 µg）。BRDU注射后0.5小时收集组织，将4％多聚甲醛固定1小时（眼睛）或2小时（垂体，肺），并在30％蔗糖中脱水24小时。

　　将所有收集的小鼠组织嵌入OCT中（Tissuetek 4583），冷冻在干冰上，并在超冻土幻灯片上切成12-14 µm的切片。对于S相标记，使用大鼠抗BRDU抗体（ABCAM，AB6326，1：500）或小鼠单克隆抗体（DSHB，G3G4，1：1,000）检测BRDU+细胞。使用Click-It Edu Alexa Fluor 555 Imaging Kit（Life Technologies，C10338）检测到EDU+细胞。Other antibodies were active caspase-3 (Cell Signaling Technology, 9661,1:500), AP2A (Santa Cruz, SC-8975, 1:500), aPKCι (BD Transduction lab, 610176, 1:500), ARR3 (Millipore, AB15282, 1:500), BRN3 (Santa Cruz, SC-6062, 1:500),calretinin (Santa Cruz, SC-11644,1:500), CCSP (Seven Hills Bioreagent, WRAB-3950, 1:1,000), CGRP (Sigma, C8198, 1:1,000), CRX (C. Y. Gregory-Evans, 1:500), cyclin A2 (Abcam, Ab181591, 1:500), cyclin B1 (Cell信号技术，4138s，1：500），Galectin 3（Santa Cruz，SC-19283，1：500），KI67（BD Science Pharmingen，550609，1：500; Thermofisher Scientific，Thermofisher Scientific，14-5698-82，1：500）SC-791，1：500），N-辅助蛋白（Santa Cruz，SC7939，1：500），OC2（R＆D Systems，AB6294，1：500），P21CIP1（ABCAM，ABCAM，AB188224，1：500）(ThermoFisher, 44-968 G, 1:500), phospho-histone H3 (Santa Cruz, SC-8656, 1:500), PKCα (Sigma, P5704, 1:500), PTF1A (Pierre Cordelier, INSERM, France, 1:200), rhodopsin (Santa Cruz, SC-57433, 1:500) and SOX9（EMD Millipore，MAB5535，1：500），SPC（ABCAM，AB40879，1：1,000）。

　　在制造商的网站或参考引用中提供了主要抗体的验证：如描述的19中，通过在柠檬酸（H-3300，矢量实验室）或靶检索溶液（S1699，敏捷）中进行抗原检索。Primary antibodies or labelled cells were visualized using donkey anti-mouse, donkey anti-rabbit, donkey anti-rat and donkey anti-goat antibodies conjugated with Alexa-488, Alexa-568 or Alexa-647 (1:1,000; Molecular Probes), or donkey anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 405) (Abcam,AB175658），Dylight 405 Affinipure Donkey Anti-Rat IgG（H+L）（Jackson Immunoresearch，712-475-153）。F-肌动蛋白由Alexa Fluor 488腓骨（Thermofisher Scientific，A12379）或Alexa Fluor 568 phalloidin（Thermofisher Scientific，A12380）标记。核用4个，6-二氨基-2-苯二烯吲哚（DAPI; Sigma）对染色。

　　将标记的细胞可视化，并用尼康蚀Eclipse Ti或Ti2激光扫描共聚焦显微镜捕获图像。使用尼康NIS元素AR 3.10软件进行视网膜厚度测量。定量使用的水平视网膜切片包含视神经和肺/垂体切片，并用ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/）分析。计数每个样品至少3个部分和4-6个样品。

　　对于整个视网膜染色，将眼球凝结并在4％多聚甲醛中孵育30分钟。将视网膜与FITC偶联的IB4（Sigma L2895）和DAPI在PBS中孵育1-2天。在用PBS进行短暂洗涤后，进行了径向切割，将视网膜分成4个象限以使视网膜扁平，并用Mowiol安装组织。对于血管血管分析，用Angiotool（https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/rob2/home）分析了代表性图像，以评估血管覆盖面积（％），平均血管长度和平均血管余量。简而言之，计算了每只眼睛至少三个200倍放大图像（每个视网膜的320×320μm视场）和来自不同垃圾的相同基因型的6眼。为了将DKO视网膜的血管密度与对照进行比较，我们使用了从GCL下方的类似深度拍摄的血管图像来表示DKO视网膜的IVP和DVP。

　　将E16或P0眼球凝结，并在PBS中的4％多聚甲醛中孵育30分钟。使用解剖显微镜，在边缘周围进行圆周切口，然后去除前部段，镜头和玻璃体。将视网膜与Alexa Fluor 488欺骗素（Thermofisher Scientific，A12379，1：500）或Alexa Fluor 568 phalloidin（Thermofisher Scientific，A12380，1：500）和PBS中的DAPI孵育。经过短暂的PBS洗涤后，进行了径向切割，将视网膜分成四个象限以使视网膜扁平，并用Mowiol安装平坦的视网膜。使用尼康蚀ti激光扫描共聚焦显微镜分析免疫荧光染色。通过显微镜程序测量整个视网膜区域和极性缺失区域。

　　根据制造商的指南，使用与衰老相关的β-半乳糖苷酶染色试剂盒（Cell Signaling，9860）对pH 6.0的β-半乳糖苷酶进行冷冻水平视网膜切片染色。简而言之，将120μl染色溶液添加到每张载玻片上，盖上覆盖，并用橡胶水泥密封。将滑块盒放在37°C的干孵化器（无CO2）中的密封的潮湿容器中，并孵育1-2天。用奥林巴斯BX61显微镜拍摄颜色图像。在Olympus BX61显微镜下计数阳性细胞/切片。对于每种基因型，至少分析了六个视网膜。对于每个视网膜，计数至少三个代表性部分。

　　P8 - / - ，α-CRE; rbf/f; p107 - / - 和α-cre; rbf/f; p107 - / - ; p107 - / - ; skp2 +/-小鼠的p8眼球均被凝结，并在新鲜的冷HBS中解剖外围视网膜。将解剖的外围视网膜转移到每个视网膜的200μl冷HBS中。加入等效量的木瓜溶液，并在37°C下孵育10分钟，每2分钟轻轻倒置一次。接下来，消化解决方案是通过移动而不会干扰视网膜的。通过用P1000移液器尖端缓慢10至15次，在600μL的神经质培养基中进行了视网膜的机械曲折。然后将样品在37°C下处理5分钟。使用在200克的摇摆式转子离心5分钟，将细胞悬浮液离心。将上清液仔细地从细胞颗粒上吸出，并将沉淀悬浮在1-5 mL神经质培养基中，具有1％FBS。通过通过50μm细胞滤网（Pluriselect）过滤细胞去除细胞聚集体。通过通过40-μm网格磨碎P107 - / - 小鼠脾脏来收集脾细胞，然后通过在RBC裂解缓冲液中孵育10分钟（Sigma，11814389001），去除红细胞（RBC）。

　　为了染色以进行免疫标记，将解离的视网膜细胞或脾细胞在FACS缓冲液（PBS+1％FBS）中洗涤，然后用小鼠FC块（BD 553141，106个细胞1μg）在冰上封闭10分钟。After washing with FACS buffer, 4 × 105 cells in 200 μl FACS buffer were stained with phycoerythrin (PE) or allophycocyanin (APC)-conjugated anti-B220 (0.5 μg, 12-0452-81), anti-CD3 (0.75 μg, 17-0032-80), anti-CD335/NKp46（0.75μg，12-3351-80），抗CD45（0.1μg，12-0451-82），抗CD11b（0.25μg，17-0112-81）或适当的同种型对照抗体（全部来自Thermofisher）在冰上进行30分钟，然后在冰上洗30分钟。使用Gallios流式细胞仪和Kaluza分析软件（Beckman Coulter）分析样品。使用Fxcycle紫罗兰DNA染料（Thermofisher）排除死细胞。补充图8提供了门控策略。

　　与先前的方法39相似，动物受到交错的EDU/BRDU标记，并收集并固定组织（如上所述）。对于视网膜截面，首先使用Click-It Edu Alexa Fluor 647成像试剂盒检测到EDU，然后与针对BRDU（鼠标抗Brdu抗体，DSHB，G3G4），KI67，KI67（ki67），ki67（大鼠抗体，大鼠抗体，热门抗体科学，14-5698-82）的抗体共同标记。无大细胞（AP2A），无长糖前体（PTF1A），Müller胶质（SOX9），水平细胞（OC2）和主要是神经元视网膜前体（P21CIP1和MYCN）。与先前的Report74相匹配，仅受EDU标记的小鼠的视网膜切片染色，证实G3G4小鼠抗BrdU抗体与EDU不会交叉反应。

　　对于肺部和垂体切片，首先使用Click-It Edu Alexa Fluor 647成像套件专门检测EDU，然后进行EDU阻滞程序，以防止与大鼠抗Brdu抗体75（ABCAM，ABCAM，AB6326）进行交叉反应。简而言之，在使用Click-It Edu Alexa Fluor 647成像套件检测到EDU后，在Click-IT缓冲液中用2 mm Azidosulfide（Sigma，244546）处理载玻片30分钟。仅接受EDU标记的小鼠的染色切片证实，抗BRDU抗体与EDU没有反应。After the EdU-blocking procedure, slides were co-labelled with antibodies against BrdU (rat anti-BrdU antibody, Abcam, ab6326), Ki67 (mouse antibody, BD science Pharmingen 550609) to label all dividing cells, and cell-type-specific markers including lung neuroendocrine cells (CGRP, rabbit, Sigma,C8198), lung club cells (CCSP, rabbit, Seven Hills Bioreagents, WRAB-3950), lung alveolar type II cells (SPC, rabbit, Abcam, ab40879), and pituitary melanotropes in the intermediate lobe and corticotropes in the anterior lobe (MSHA, Fisher Scientific, AB508MI), and imaged by共聚焦显微镜。

　　ImageJ（斐济，1.54G版）用于使用ImageColorChannels工具在60倍图像中手动计数EDU/BRDU标记的单元格。对于细胞特异性的细胞周期数据，我们首先计算了感兴趣的细胞类型的数量（例如CGRP+神经内分泌细胞）。Next（或在不使用细胞类型特异性标记的情况下，我们首先添加了Ki67通道来计数分裂细胞（CGRP+; Ki67+），然后我们添加了EDU通道以计算多少个分裂细胞为EDU阳性（CGRP+; Ki67+; EDU+）。接下来，我们添加了BRDU通道来计算多少个分裂细胞为BRDU阳性（CGRP+; Ki67+; Brdu+）。之后，我们将EDU和BRDU数据与标记/Ki67结合在一起，以计数标记+Ki67+brdu -edu+细胞。对每个图像进行计数，以确保准确性。在补充图3中说明了用于计算TC和TS的功能。在补充表7中提供了TC中使用的所有原始计数。4–7。

　　EDU+; BRDU-细胞的数量形成了TC和TS计算的分母（补充图3），因此，如果其中一些细胞分裂该分母会增加，则可以人为地降低TC和TS。先前的出版物假定没有或很少的EDU标记的细胞分裂，并且仅EDU细胞已经达到G2/M，但没有超越。我们进行了其他测定法以检查这一假设。

　　首先，我们用EDU将P8 RB/P107 DKO小鼠标记1小时，1.5 h，2 H，3 H，4 H，4 H，5 h或6 h，然后在EDU，磷酸化H3（pH3）和DAPI（补充图9A）的视网膜切片中染色。H3磷酸化始于G2晚期，当时染色体凝结，但在早期中间M期最突出，H3去磷酸化开始于后期/早期末期76，因此PH3被广泛用作G2/M标记后期。如果G2/m是 <3 h, all cells in S phase at the time of EdU labelling would have reached M phase by then, and the EdU+ cells that were labelled in early-mid S phase would continue to enter G2/M at later times (S phase in DKO P8 retina is ~25 h, Fig. 4c), ensuring a long plateau of 100% EdU+;PH3+ double-labelled cells beyond 3 h. Conversely, if G2/M is >3小时，只有PH3+细胞的一部分也将是EDU+，它将随着时间的流逝而继续上升，最终达到100％的高原。如预期的那样，随着时间的推移，EDU+的PH3+细胞的分数也增加了，证实了先前的S相细胞通过G2的运动（补充图9B）。在1 h或1.5 h时未检测到双重标记的细胞，在2小时看到一小部分，在6 h时继续增加100％。在3小时，我们的TC测量研究中使用的时间点，只有23.9％的PH3+细胞为EDU+（补充图9B）。这些数据表明，P8 DKO视网膜中的EDU标记的细胞不足以分裂。

　　其次，我们还在RB垂体，RB/p53肺，KRAS肺和BRAF肺癌模型的RB垂体中进行了EDU/PH3/DAPI三重标记（补充图9C）。3小时后，EDU+的M相细胞的比例约为30–50％，与DKO视网膜相似，如果EDU+细胞可以在3 h内完成有丝分裂，则远低于100％预期（补充图9d）。因此，在这些癌症模型中，EDU标记的细胞分裂的3小时似乎也不足。

　　第三，作为视网膜的额外测试，P8 DKO小鼠在0小时暴露于EDU，然后将BRDU从2.5–3 h暴露于EDIN，而视网膜切片被染色为EDU。针对细胞周期蛋白A2，Cyclin B1和PH3标记S，所有G2和所有M相细胞的三种兔抗体的鸡尾酒（补充图9E）。任何遍及G1的仅EDU细胞都是EDU+，但对于所有其他标记物（Cyclin A2，中/晚期S期和G2; Cyclin B1，G2和早期M期； PH3，晚期G2和M期）。值得注意的是，所有与A2/B1/PH3抗体混合物共标记的EDU+细胞，并且没有细胞仅对EDU呈阳性（补充图9F）。该结果证实了Edu标记的细胞不会在3小时的窗口中分裂。

　　α-cre的P8眼球； rbf/f; p107 - / - （dko，易受肿瘤）和α-cre；rbf/f;p107 - / - ;SKP2 +/-（DKO-SKP2 +/-，抗肿瘤 - 抗性）小鼠被凝固，并在新鲜和冷HBS中解剖周围视网膜（α-CRE表达区域）。然后将解剖的外围视网膜转移到每个视网膜的200μl冷HBS。等效量的木瓜溶液（对于1 ml，700μl试剂级水，100μl新鲜准备的50 mm - 半胱氨酸（Sigma），100μm10 mm EDTA，10μm60 mm 60 mm 2 -MM 2- ercaptoetoethanol（Sigma），并添加到1 mg ml -1（worthingtonton）中，并添加了10米的帕克斯（Papain）孵育期间每2分钟轻轻倒置一次。在孵化步骤之后，通过移液丢弃消化溶液而不会干扰视网膜。通过用P1000移液器尖端缓慢10至15次，在600μL的神经质培养基中进行了视网膜的机械曲折。然后，将样品在37°C下进行5分钟。然后，使用在200克的秋千转子离心5分钟。将上清液仔细地从细胞颗粒上抽出，然后重悬于1-5 mL神经质培养基中，具有1％FBS。通过通过50μm细胞滤网（Pluriselect）过滤细胞去除细胞聚集体。

　　根据制造商的方案，使用单细胞3'试剂盒V2（10X基因组学）制备单细胞基因表达文库。使用HISEQ3000（Illumina）和10倍基因表达参数（读取1，28个周期，并读取2，100循环）对库进行测序。

　　通过Cellranger管道（10X基因组学，v2.2.0）处理原始数据。对于DKO和DKO-SKP2 +/-基因型的每一次运行，使用10X基因组学提供的小鼠参考指数（refdata-cellranger-mm10）和计数管道的默认参数将读取量化为UMI基因– Barscode矩阵，以过滤低量的细胞杆。该过程产生了3,621个估计细胞，平均读取为52,983个读取，DKO样品的平均每个细胞中位数为2,884个基因和5,196个估计的细胞，平均读取为31,520次读取，而DKO-SKP2 +//-样品的平均中位数为1,873个基因。然后，将单个运行的矩阵汇总成与Cellranger的Aggr Pipeline的单个基因 - barscode矩阵，以避免在比较两种基因型时测序深度的差异而引入的伪影。聚集保持了74.3％的读数，从DKO样品中读取，100％从DKO-SKP2 +/-样品中读取，并以8,817个估计的细胞结束，平均读取为34,749个读取，中位数为1,941个基因。

　　使用10倍基因组loupe浏览器查看了CellRanger产生的簇文件，并通过其过表达的基因和典型的视网膜，免疫和星形胶质细胞标记基因的表达来探索簇中的细胞。我们将簇定义为标记基因AIF1和LGALS9的出色表达以及标记基因AQP4的星形胶质细胞的免疫。比较了DKO和DKO-SKP2 +/-基因型之间总细胞中免疫细胞和星形胶质细胞的比例。为了进一步分析视网膜细胞，排除了这些非视网膜细胞。

　　删除非视网膜细胞后，主要通过Scanpy Python Toolkit（https://github.com/scverse/scanpy）和Seurat R Toolkit（https://github.com/satijalab/seurat）进一步处理和分析数据。为了下游分析，从每个单细胞数据集中进一步过滤了低表达基因和质量较差的细胞。过滤后，仅保留在> 3个细胞和表达> 500个基因的细胞中表达的基因，少于15％的线粒体基因保留了DKO中的3,501个细胞，而DKO-SKP2 +/-数据集中有3,501个细胞。保留的数据分别通过Scanpy的标准化术语和log1p进行标准化，并将对数转换。通过仅在上述过滤后仅保留细胞在每个样品中的细胞和总数> 10个计数的基因后，汇总数据被过滤。这导致了8,520个细胞，其中包括5,019个DKO-SKP2 +/-和3,501 DKO视网膜细胞和15,731个基因。然后按照与上述相同的方法对汇总数据进行标准化和对数转换。

　　为了鉴定循环细胞以及细胞周期异质性对数据的影响，使用Scanpy的函数得分_GENES_CELL_CYCLE分配了每个细胞的细胞周期分数和相位。细胞周期标记基因的列表，包括S和G2M相77的标记，用于计算给定细胞周期基因的平均表达差，以及来自BINNED基因库中随机选择的参考基因的平均表达，这些基因库与给定基因表达的分布相匹配。通过BiomArt软件包将人类名称转换为小鼠基因名称。根据其细胞周期评分，预计细胞为G2M，S或G1相。表达S和G2M基因的细胞可能不是循环（G0）或G1期。

　　要检测有问题的双重或多重组的人工制品将任何单元组合在一起，其中两个或多个单元格会接收相同的条形码并导致混合转录组，请使用Python“ Scrublet” 78 78来计算每个样品和可能的双倍分数，并预测Deffact Clusers 0的双倍分数，并预测Defflact Clusers 0的DOBLOALS DABLED率 -和DKO-SKP2 +/-，0.04，基于捕获的细胞数量。每个样本的原始数据矩阵用于此分析。将检测到的细胞的双重组的注释转移到聚合数据上。

　　为了最大程度地减少细胞周期异质性的影响并根据与细胞谱系相关的基因强调聚类，细胞周期从先前的归一化表达矩阵中回归。G2M和S相的两个分数都使用Scanpy的Revress_Out函数进行回归。缩放后，为主成分分析选择了前2,000个高度可变的基因，以降低数据的尺寸。用前50个主组件计算了细胞的邻域图，然后使用UMAP将图嵌入两个维度。通过Leiden图簇方法79鉴定细胞簇，该方法直接聚集了细胞的邻域图。

　　为了注释每个群集的视网膜细胞同一性，我们将簇与视网膜细胞类型相关联，基于已知的视网膜细胞类型特异性基因（扩展数据图4H）。使用Scanpy的Score_genes函数计算每个单元格的分数，该函数具有score_genes_cell_cycle的相同算法。将一个群集分配给平均得分最高的单元格类型，并且在集群中具有正分数检测到的细胞百分比。细胞类型的注释簇进一步完善并通过每个簇的高差分表达基因进行验证。使用wilcoxon rank-sum测试的rank_genes_group函数，使用rank_genes_group函数对每个群集确定了DEG。其中，每个群集的标记基因都通过默认参数进一步过滤。通过UMAP可视化比较小鼠正常视网膜发育和这些样品之间的前10个标记基因的表达。使用正常的小鼠视网膜开发SCRNA-SEQ DATA80作为参考，我们还以Scanpy的摄入功能确定了每个单独的细胞类型，该单元符合参考数据的模型，并将其用于使用单元格注释来投射新数据。使用每个样本的数据应用此映射，并将映射的单元格类型传输到汇总数据。在映射之前，将细胞周期效应从参考数据和基因型数据中回归。

　　区分特定细胞类型的顶级基因包括：ApoE，MüllerGlia簇（MU）；ROM1，感光器（PR）；EBF1，合氨酸前体（AMP）；PCSK1N，成熟的无大细胞（AMM）；FBXO5，罕见的剩余有丝分裂祖细胞（Progm）；ISL1，双极细胞（BIP）；OTX2，NeuroD1和NeuroD4，神经源（NEU）群集80,81,81,82,83,84,85,86（图3B，扩展数据图4G和补充表2）。

　　为了识别每个群集中两个基因型之间的DEG，将Seurat封装的函数查找标记用于桅杆测试进行两个条件比较。选择显着的DEG作为具有调整P值小于0.1的调整后的DEG，平均log2折叠的变化高于0.25，并且在大于0.1的群集内表达的细胞百分比（比例）（比例）。通过使用在线富集（https://maayanlab.cloud/enrichrichrichrichrichrichrichrichrichrichrichrichrichrichrichrichrich incts）鉴定出了与DEG中S和G2M相表达的CDK2相关基因37和细胞周期基因的富集。

　　将外围小鼠视网膜用30尺寸的针头在1×细胞裂解缓冲液（细胞信号9803）中用0.1 mM PMSF，1μgml-1-1-1 ml-1蛋白蛋白和1μgml-1亮肽素匀浆。通过SDS-PAGE分离蛋白质，转移至硝酸纤维素膜，并使用Odyssey红外成像系统（LI-COR）进行分析，其用抗活性CASPase-3的抗体（细胞信号技术9661，1：200），P27，P27（P27），P27（554069，BD Biosciences，BD Biosciences，1：200），Skp2（SCLASS SKP2）1：1,000）和β-肌动蛋白（A5441，Sigma，1：2,000）。

　　根据小鼠实验中的功率分析和共同实践选择样本量。样品量（n）通过公式n = [2（zα+z1 -β）2]/ses2估算。I型误差（α）设置为0.05，II型误差（β）设置为10–20％，是双面效应。SES（Cohen的D）是标准化的效应大小，等于ES（效应大小）除以合并的S.D.，因此是S.D.两组的均值之间的差异的幅度。单位88。对于动物实验，SES为1.1×，1.5×和2.0×S.D。建议分别代表小，中等和重要的反应88。根据上述公式，需要4-7只小鼠以80％的功率检测效果，并且需要6-10只小鼠以检测90％功率的效果。因此，每个实验通常使用4只或更多的6只小鼠，以检测80-90％功率的撞击。所有数据均表示为平均值±S.D.使用GraphPad Prism软件进行了Kaplan -Meier生存曲线和统计分析。一个未配对的学生的T检验用于比较两组。单向方差分析，然后进行Bonferroni校正进行多次比较。使用对数级（Mantel – Cox）测试计算Kaplan – Meier曲线的P值。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。