通过前瞻性招募的多中心克服Covid-19，并在美国进行Covid-19一起招募患者。所有符合临床标准的患者都纳入了研究中，因此没有使用统计方法来预先确定样本量，并且没有发生盲目或随机分组。该研究得到了波士顿中央儿童医院机构审查委员会（IRB）的批准，并由IRB审查了与CDC IRB Reliance的参与网站。在2020年6月1日至2021年9月1日之间，共有292名患者同意，并被招募到以下独立队列之一中：223名患者与MIS-C住院（199个在主要发现队列中，有24名患者，随后的验证队列中有24名患者，29名患者在Interigy Care或Stepd Down Covid cov中进行了coVID-19的患者（在Interdies covid covid中）（''45 covid）（'（在这项研究中称为“处于危险对照”）SARS-COV-2感染与轻度或无症状有关。人口统计数据和临床数据总结在扩展数据表1-3中。2020年美国CDC案例定义用于定义MIS-C51。所有MIS-C患者均通过逆转录酶定量PCR呈阳性SARS-COV-2血清学结果和/或SARS-COV-2阳性测试结果。所有患有严重COVID-19或门诊SARS-COV-2感染的患者均对SARS-COV-2进行阳性抗原测试或核酸扩增测试。对于门诊患者，在阳性测试后的36至190天（阳性测试后70天；四分位间范围为56-81天）收集样品。为了用作SARS-COV-2特异性PHIP-SEQ中的对照，从纽约血液中心获得了48个健康的，前CoVID-19的对照。这些样品是志愿捐助者献血时收集的保留管的一部分，他们提供了知情同意，以便将其样本用于研究。

　　DNA coding for the desided peptides for next inserted inserted inserted inserted inserted inserted with Controcts Controls (Twist Biosciences) as DNA Oligomers. PCR 5'- AAGCAGAGCTCGETCGETGAGETGAGETGAGETGAGETGAGETGAGE 3'''''''''和5英寸引物parare放大了构建体。

　　对于SNX8，寡聚物代码以下序列：

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　　考试和安辛和安辛和安辛

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　　Eadppaspqageths和Andings的eidppaspqagething

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　　对于SARS-COV-2核素蛋白，低聚物编码以下序列：

　　Aseglentpkdhings Annagenging Annogelutlinggginggfygingy和

　　thishiaasasasasasasasasasasasasadsingsingtlutlinggfyaginggfyaginggfyagings

　　以及和安辛的和安辛斯和斯廷斯和

　　任何和和和和安辛和因和阅读和阅读

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　　任何andhiging的手指和安德

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　　任何和安德的和安辛

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　　ategalntpkdhigingtling annagencally and andy

　　对于RLBA，利用了T7启动子的DNA表达质粒和所需蛋白的末端MYC -DDK标签。对于ERFL，从Twist Bioscience订购了自定义的质粒，其中将MYC-DDK标记的全长ERFL序列插入了T7启动子下的PTWIST KAN HIGH COPY VECTOR（Twist Bioscience）。Twist Bioscience通过在运输前的下一代测序来验证序列完美的克隆。收到后，通过原始实验室验证了质粒。对于SNX8，从Origene（RC205847）订购了包含T7启动子下的MYC – DDK标记的全长SNX8的质粒，并在收到后通过Primordium Labs验证了序列。对于KDELR1，从Origene（RC205880）订购了包含T7启动子下含有MYC – DDK标记的全长人KDELR1的质粒，并在收到后通过Primordium Labs验证了序列。对于IL1RN，从Origene（RC218518）中排序了含有MYC – DDK标记的全长人IL1RN的质粒，并在接收后通过Primordium Labs验证了序列。

　　为了获得整个SNX8蛋白的多肽，从JPT肽技术中排序了15-Mer多肽片段并合成。一起，其中130个这些多肽（称为“ SNX8池”）跨越了所有已知的翻译SNX8（全长465-氨基酸SNX8蛋白，以及SNX8同型3的独特区域3）。设计一个单独的池主要覆盖与高分辨率（称为“高分辨率表位池”）相似的SNX8区域。该池包含20个10分子的9-氨基酸与全长SNX8蛋白的44-72（IVQQVPAPSRMQMPQGNPLLLSHTLQELL）的氨基酸重叠。通过质谱法验证了这150个多肽中每一个的序列，并通过高性能液相色谱（HPLC）计算纯度。

　　为了用于加载四聚体，从基因合成中排序三个肽作为9-mers。LQLPQGTTL和LQLPQGITL对应于SARS-COV-2 Nucleocapsid蛋白的区域，该区域与祖先序列中的人SNX8相似，并且分别为较小的变体。通过质谱验证了该序列，并通过HPLC计算为96.61％的纯度。另一个序列MQMPQGNPL对应于与SARS-COV-2 Nucleocapsid蛋白相似的人SNX8蛋白区域。通过质谱验证了该序列，并通过HPLC计算纯度为95.83％。

　　遵循我们先前发表的基于真空的PHIP-SEQ协议12（https://www.protocols.io/view/scaled-high-high-though-wigh-wigh-wigh-putput-vacuum-phip-protocol-ewov1459kvr2/v1），进行了人蛋白质组pHIP-SEQ。

　　我们的人类肽组图书馆由一个定制设计的噬菌体文库组成，该图书馆由731,724个独特的T7噬菌体组成，每个噬菌体在其表面上呈现不同的49-氨基酸肽。总的来说，这些肽在整个人类蛋白质组中瓷砖，包括所有已知的同工型（截至2016年），并具有25个氨基酸重叠。在噬菌体文库中，将1 mL与1μl人血清在4°C孵育过夜，并用25μl的1：1混合蛋白A和蛋白G磁珠（10008D和10009D，Thermo Fisher）免疫沉淀。这些珠子比洗涤，其余的噬菌体 - 抗体复合物在1 ml大肠杆菌（BLT5403，EMD Millipore）中洗脱为0.5-0.7 OD，并通过在37°C的培养箱中生长。然后将这个新的噬菌体文库与来自同一个体的血清重新结合，并重复先前描述的方案。然后从最终的噬菌体库中提取DNA，barcoded，PCR扩增，并添加Illumina适配器。使用Illumina测序仪（Illumina）进行下一代测序，每个样品的读取深度约为100万。

　　所有人类肽组分析（除非另有说明）在基因水平上进行，其中所有肽映射到同一基因的所有读数都汇总到每个基因中，以允许在数学分析中包含零读数的基因。在每个样本中，通过转换为总读数百分比来归一化读取。为了使每个样品与背景非特异性结合进行归一化，通过将每个基因的样品读取百分比除以仅AG珠唯一的对照的同一基因的平均读取百分比来计算模拟IP的倍数变化。然后将此倍数变化信号用于样品和同类群之间的并排比较。与对照组相比，通过使用所有剩余对照组，倍数变化值也用于计算每个患者MIS-C和每个对照样本的Z分数。这些Z分数用于逻辑回归特征加权。在肽级分析的实例中，通过计算每100,000个读数的读数数量来标准化原始读取。

　　如前所述39进行SARS-COV-2蛋白质组PHIP-SEQ。简而言之，在SARS-COV-2，SARS-COV-1和其他7个COV的38个氨基酸片段上，在T7噬菌体上表达了具有19-氨基酸重叠的T7噬菌体。在噬菌体文库中，将1 mL与1μl人血清在4°C孵育过夜，并用25μl的1：1混合蛋白A和蛋白G磁珠（10008D和10009D，Thermo Fisher）免疫沉淀。使用P1000多通道移液器将珠子在磁盘上洗涤五次。将其余的噬菌体 - 抗体复合物在0.5-0.7 OD下洗脱1 ml大肠杆菌（BLT5403，EMD Millipore），并通过在37°C的孵化器中生长而放大。然后，将这个新的噬菌体文库与同一个体的血清重新结合，并重复先前描述的方案，总共进行三轮免疫沉淀。然后从最终的噬菌体库中提取DNA，barcoded，PCR扩增，并添加Illumina适配器。然后，使用Illumina测序仪（Illumina）进行下一代测序，每个样品的读取深度约为100万。

　　为了说明样本之间的读取深度不同，将每个肽片段的读数总数转换为每100,000（RPK）的读数。为了计算相对于CoVID-19的对照组（FC>前COVID-19）计算归一化的富集，将每个样品中每个肽片段的RPK除以所有肽片段的平均RPK在所有前旋转前19个对照中的平均RPK。这些FC> covid-19值用于文本和数字中所述的所有后续分析。

　　如先前所述的12,32。简而言之，通过Primordium Labs测序，对每个经过验证的抗原的T7启动子控制的DNA质粒进行了T7启动子的控制（请参阅上面的“ DNA质粒”）。使用[35S] -Methionine（neg709a，Perkinelmer），在体外转录/翻译试剂盒（L1170，Promega）中使用了各个DNA模板。各个蛋白在NAP-5色谱柱（17-0853-01，GE Healthcare）上纯化，并在4°C下用2.5μL血清或1μL抗Myc-P阳性对照抗体（1:10稀释剂; 2272s cigndy; 2272s nigds nignds nignds cyminds cyminds cyminds n office; 2272s procking; 2272 signding signding cromincy; 2272s，将等量等量的蛋白质（约35,000次计算）孵育过夜。Immunoprecipitation was then performed on 25 μl of Sephadex protein A/G beads (4:1 ratio; GE17-5280-02 and GE17-0618-05, Sigma-Aldrich) in 96-well polyvinylidene difluoride filtration plates (EK-680860, Corning).彻底洗涤后，使用96孔微甲基三级液体闪烁板读取器（Perkin Elmer）对免疫沉淀蛋白的每分钟计数进行定量。

　　如前所述52进行SLBA。可以在协议中获得详细的SLBA协议（https://doi.org/10.17504/protocols.io.4r3l27b9pg1y/v1）。

　　简而言之，使用上面列出的引物对通过PCR扩增上面列出的DNA低聚物（请参见“ SLBAS的DNA低聚物”）（请参阅“ SLBAS的DNA低聚物”）。未纯化的PCR产物用作T7 TNT在体外转录/翻译试剂盒中的输入（L1170，Promega），并使用纳米 - 基因HIBIT裂解检测系统（N3040，Promega）来测量Luminometre中翻译肽的相对荧光素酶单位。将相同量的蛋白质（在2×106–2×107相对荧光素酶单元的范围内）与2.5μl患者血清或1μl抗纤维阳性对照抗体（1:10稀释； CS2006A01，Promega）在4°C下孵育过夜。Immunoprecipitation was then performed on 25 µl of Sephadex protein A/G beads (1:1 ratio; GE17-5280-02 and GE17-0618-05, Sigma-Aldrich) in 96-well polyvinylidene difluoride filtration plates (EK-680860, Corning).彻底洗涤后，使用发光仪中的纳米 - 基因裂解检测系统（N3040，Promega）测量发光。

　　PBMC是从十名MIS-C患者和十个对照中获得的PBMC，用于激活诱导的标记分析。将PBMC解冻，洗涤，重悬于无血清RPMI培养基中，并在96孔圆底板中以每孔的浓度为1×106个细胞铺板。对于每个个体，在0.2％DMS​​O中以1 mg ml -1的终浓度或仅包含0.2％DMS​​O的媒介物对照，将PBMC刺激24小时（见上文）。对于四个对照组和两名MIS-C患者，使用SNX8高分辨率表位池（见上文），有足够的PBMC用于额外的刺激条件，同样在0.2％DMS​​O中以1 mg ml-1的浓度为1 mg ml-1。刺激后，用FACS缓冲液（Dulbecco的PBS无钙或镁的PBS，0.1％叠氮化钠，2 mM EDTA和1％FBS洗涤细胞），并用以下抗体面板在4°C下在20分钟的1：100稀释下进行染色，然后在4°C下进行20分钟，然后立即进行流式网状分析。

　　对于抗体面板：抗CD3 Alexa 647（克隆Okt3，317312，Biolegend），抗CD4 Alexa 488（克隆Okt4，317420，Biolegend），抗CD8 ALEXA 700(clone ACT35, 350020, BioLegend), anti-CD69 PE (clone FN-50, 310906, BioLegend), anti-CD137 (also known as 4-1BB) BV421 (clone 4B4-1, 309820, BioLegend), anti-CD14 PerCP-Cy5 (clone HCD14, 325622,Biolegend），抗CD16 PERCP-CY5（克隆B73.1，360712，Biolegend），抗CD19 PERCP-CY5（Clone Hib19，302230，Biolegend）和Live/dead dead dead dead efluor efluor efluor 506（65-08666-14，Invitrogen）。

　　使用FlowJo软件使用扩展数据中显示的门控策略进行了激活诱导的标记分析。所有门均在每个样品的每个条件中固定。活化的CD4 T细胞定义为对OX40和CD137共阳性的细胞。活化的CD8 T细胞被定义为CD69和CD137共阳性的细胞。用于激活的门控阈值是由车辆控制中信号的外部限制定义的，最多可容纳两个异常值。计算频率为总CD3+细胞（T细胞）的百分比。两个MIS-C样品的总事件不足，流式细胞仪捕获的总事件（分别为5,099和4,919个事件），因此从分析中删除。

　　有关初始四聚体测定，请参见图4A的扩展数据。PBMCs from two patients with MIS-C with HLA-A*02:01 (HLA typed from PAXgene RNAseq, one confirmed by serotyping), one patient with MIS-C with HLA-B*35:01 (HLA typed from PAXgene RNAseq) and three at-risk controls with HLA-A*02.01 (all three identified by serotyping, two of three confirmed bypaxgene rnaseq hla键入其他样品没有可用于基因分型的基因组DNA）解冻，洗涤并用含有培养基的培养基，其中含有重组的人IL-2在96孔板中的10 ng ml-1。然后将LQLPQGITL和MQMPQGNPL的肽片段（详细信息）添加到PBMC中，至最终浓度为每肽10 mg ml -1，并孵育（5％CO2时为37°C），持续7天。

　　孵育7天后，从UV-Photolabile生物素化的单体产生了总共八个PHLA I类四聚体，HLA-A*02：01和HLA-B*35：01（NIH Tetramer core）各有四个。通过UV肽交换加载肽。使用与荧光团PE和APC或BV421结合的链霉亲和素进行四聚化，然后用500 µM -Biotin淬灭，与我们先前发表的方法44,53相似。然后将四聚体合并在一起，如下所示：

　　对于HLA-A*02：01池，MADS（LQLPQGITL）负载的PE Tetramer，MADS（LQLPQGITL） - 负载APC Tetramer，SNX8（MQMPQGNPL）负载PE TETAMER和SNX8（MQMPQGNPL）wADPLPLPLPL）bload blaine blains-Load blaine blains-Load blains bved bv421 tetramerHLA-A*02：01限制。

　　对于HLA-B*35：01池，MADS（LQLPQGITL）负载的PE Tetramer，MADS（LQLPQGITL）负载的APC Tetramer，SNX8（MQMPQGNPL）负载PE TETAMER和SNX8（MQMPQGNPL）blaim blaimla bla bla bev wateb w w wath bv w wate bla：3限制。

　　然后将所有PBMC用100 nm dasatinib（Stemcell）在37°C下处理30分钟，然后用染色（无洗涤步骤），其相应的四聚体池对应于其HLA限制（最终浓度为2-3 µg ml -1）在25°C下30分钟。然后将细胞用以下细胞表面标记染色，每个细胞表面标记在1：100稀释20分钟内，然后立即对流式细胞仪进行分析。

　　对于表面标记：抗CD8 Alexa 700（克隆SK1，357404，Biolegend），抗CD4 PERCP-CY5（克隆SK1，300530，Biolegend），抗CD14 Percp-Cy5360712，Biolegend），抗CD19 PERCP-CY5（Clone Hib19，302230，Biolegend）和Live/Dead dead dye Efluor 506（65-0866-14，Invitrogen）。将链霉亲和素连接至PE（S866，Invitrogen），APC（S868，Invitrogen）和BV421（405225，Biolegend）。

　　在扩展数据中概述了门控策略图7b。使用严格的四聚进口策略来识别交叉反应性T细胞，其中CD8+ T细胞在PE，APC和BV421标签中必须为三重阳性（即，一个与PE-ConJUGAD LQLPQGITL和/或PE-ConJUGED MQMPQGNPL和APCCGITPC的单个CD8 T细胞绑定到PE-CONJUGATEBV421偶联的MQMPQGNPL）。

　　使用抗HLA-A2抗体（1：100稀释； FITC抗人HLA-A2抗体，克隆BB7.2，343303，Biolegend）进行血清分型，相关结果显示在扩展数据中。

　　对于HLA I类Phla Easymer单体和折叠测试的组装，请参见图4。在HLA-A*02：01和HLA-A*02：06的HLA-A*02：01和HLA-A*获得生物素化的Easymer单体（Immudex）。将SARS-COV-2 MADS（LQLPQGITL），SARS-COV-2 WUHAN（LQLPQGTTL）和人类SNX8（MQMPQGNPL）肽被商业合成（Genscript）（Genscript），在DDH2O或DMSO中稀释至1 mm，并加载到每个Easimerele等同类产品中，供应48年的指令。相对于负（无肽；卸载的单体）和阳性（CMV PP65 495-503（NLVPMVATV）对照组，使用“β2M倍数测试），对每个HLA进行了适当的PHLA单体形成和MAD和MAD和SNX8肽结合强度。简而言之，将浓度为500 nm的肽负载的单体串行稀释至9 nm，3 nm和1 nm的稀释缓冲液（1×PBS，含5％甘油； G5516； g5516，Sigma-Aldrich），并与链霉亲素链（6-8μm; svp-60-5，svp-60-5，svp-60-5）一起注入稳定复合物与珠的结合，然后用FACS缓冲液（1×PBS，0.5％BSA（A7030，Sigma-Aldrich）和2 mM EDTA（15575-038，Thermo Fisher Scientific）洗涤3次）。然后将样品用PE偶联的抗人β2M抗体（克隆BBM.1，SC-13565，Santa Cruz Biotech）在4°C下于30分钟进行染色，用FACS缓冲液洗涤30分钟，并用FACS缓冲液洗涤，并在5个Laser 16UV 16UV-16V-16V-14B-104B-100YG-8R AURORA spectect上进行了分析，并在5°C上进行了分析。PHLA结合强度与PHLA-β2M复合物的稳定性和浓度呈正相关。因此，与正对照和阴性对照相比，在该测定中，抗β2M染色的几何平均荧光强度报告了PHLA结合的强度。我们根据9 nm处无肽阴性对照的抗β2M几何平均荧光强度的折叠变化对每个HLA和肽组合分类。将强粘合剂定义为高10倍以上， 在3倍以上，弱粘合剂在1.5倍以上的弱粘合剂和非限制剂的变化量超过1.5倍，而不到1.5倍的变化。使用FlowJo版本10.7.2软件（BD Biosciences）分析流式细胞仪数据。

　　对于PHLA四聚体组装，请参见图4。从HLA-A*02：01和HLA-A*02：06 easymer单体（Immudex）组装的PHLA四聚体与SARS-COV-2 MADS（LQLPQGITL），WUHAN（LQMQM），SENX8（lqlpplplpplpplpplpplpplpplppt）（lqlpplplpplpplplppt）（lqlpplplpplplppt）（immudex）（immudex）（immudex）（immudex）（immudex）根据制造商的说明。简而言之，将荧光素偶联蛋白（0.2 mg ml-1，PE，405203，Biolegend; 0.2 mg ml-1，APC，405207，Biolegend； Biolegend； Bv421，405226，Biolegend，Biolegend）在8 ng PereS中加载到装载单体中，将其加入8 ng per per 1μlla（500 nm phla）。每次添加1/3体积后，将样品混合并在黑暗中在4°C下孵育15分钟。在黑暗中将组装的四聚体在4°C下存储直至使用。

　　对于增强的肽特异性T细胞膨胀，请参见图4。从MIS-C确认的PBMC hla-a*02：01或HLA-A*02：02：02：06根据已公开的方法54获得了肽特异性扩张，根据单细胞分类四型Tetramer阳性T细胞。在扩展第0天，将PBMC融化，计数并在200μl抗原呈现的细胞分化培养基（X-Vivo 15无血清的无血管造成血液的型细胞培养基中，每孔100,000个细胞以100,000个细胞为单位）（04-418Q，LONZA）补充了人类gm-csf（1,000,000-1,000，，1,000，yll，Miltenyi Biotec），人IL-4（500 IU ML-1; 204-IL-010，R＆D Systems）和Human Flt3-L（50 ng ML-1; 308-FKN-025，R＆D Systems）的最终浓度），并在37°C和5％CO2下孵育24 h。在第1天，用100μL辅助溶液代替100μl细胞上清液（X-Vivo 15，补充了R848（10μm; TLRL-R848-5，Invivogen），脂多糖，Salmonella sarmonella sinnesota（Minnesota; Minnesota; 100 ng Ml-1; tlr-smlps; tlr-smlps ingiv m m ly ing gogen and ing gogen and ing gogen and ing gogen and ing gogen and ing gogen and ing gogen）and im-1;201-LB-010，研发系统）最终浓度）和MAD（LQLPQGITL）和SNX8（MQMPQGNPL）肽的最终浓度为10μm。通过在H2O中添加DMSO的1：2稀释以匹配肽体积和稀释剂，为每个样品建立了无肽对照孔。将细胞在37°C和5％CO2下孵育24小时。在第2、4、7和第9天，100μl上清液被用100μlT细胞膨胀解决方案代替：RP-10（RPMI 1640（22400-089，GIBCO），10％热灭活的人血清AB（100-512）Fisher Scientific）和1×谷氨酸（35050-061，Gibco）补充了人IL-2（10 IU ML-1; 202-IL-050，R＆D Systems），人IL-7（10 ng ML-1; 207-IL-025，R＆D Systems），R＆D Systems），R＆D Systems和Humer IL-15（10 ng ml-1; 200 ng ml-1; 200-15-15-15-15，PEP; 200-15，PEP。在第10天，汇总了来自个体参与者的肽膨胀细胞；分别收集来自无肽对照的细胞。

　　在1×PBS中洗涤未表现的PBMC（直接离体）或肽膨胀的T细胞，并在1×PBS中用100 nm dasatinib（CDS023389，Sigma-Aldrich）在1×PBS中处理30分钟，在37°C和5％CO2（Ref 55）中进行30分钟。Cells were then pelleted and resuspended in 50 μl FACS buffer (1× PBS and 0.04% BSA) supplemented with human TruStain FcX blocking buffer (1:10 dilution; 422302, BioLegend), 500 μM -biotin (B20656, Thermo Fisher Scientific) and a unique tetramer cocktail containing MADS–tetramer–PE (1:10稀释），MADS – TETRAMER -APC（1:10稀释），SNX8 – Tetramer – Pe（1:10稀释）和SNX8 – Tetramer – Bv421（1:10稀释）基于参与者HLA类型（A*02：01和A*02：02：06）。将细胞在25°C的黑暗中孵育1小时，然后直接添加50μl（100μl总体积）的FACS，并补充了500μM-生物素和含有FITC偶联的抗人类CD3的抗体鸡尾酒（1:20稀释）（1:20稀释； Clone Okt3； Clone Okt3，Lot B3908080808，317306，317306，317306，317306，317306，conjecon，bbiolegegend）anti-human CD8 (1:20 dilution; clone SK1, lot B371925, 344742, BioLegend), BV510-conjugated anti-human CD4 (1:20 dilution; clone OKT4, lot B375526, 317444, BioLegend), BV510-conjugated anti-human CD14 (1:20 dilution; clone63D3, lot B390770, 367124, BioLegend), BV510-conjugated anti-human CD16 (1:20 dilution; clone 3G8, lot B372132, 302048, BioLegend), BV510-conjugated anti-human CD19 (1:20 dilution; clone HIB19, lot B390665,302242，Biolegend）和Ghost Dye Violet 510可行性染料（1：400稀释；批次D0870061322133，13-0870-T500，Tonbo Biosciences）在4°C的黑暗中30分钟。然后将细胞颗粒，用4 mL FACS缓冲液（含500μM -Biotin）洗涤两次，悬浮在500μlFACS中（含500μM -Biotin），并通过45μm的滤波器，然后通过对Sony Sy3200细胞的单细胞进行分类，然后进行单细胞分类。将单个活，BV510垃圾门（CD4，CD14，CD16和CD19） - CD3+CD8+T淋巴细胞盖上，以区分四聚体三阳性细胞（PE+APC+BV421+） 如扩展数据所述图7D，并将其分类为384孔板的单个井，该井中装有上标Vilo Master Mix（11754250，Thermo Fisher Scientific）。分类后，将板以500克离心，并在-80°C下储存直至处理。

　　如前所述56，单细胞配对的TCRα和TCRβ链文库的制备和测序在分类为384孔指数板上进行了测序。简而言之，在用上标Vilo Master Mix中分类细胞的逆转录后，cDNA使用人类V段特异性正向引物，人类TRAC和TRBC特定的反向引物进行了两轮嵌套的多重PCR扩增（有关引物详细信息，请参见补充表1）。在2×150 bp的读取长度上，在Illumina Miseq上对产生的TCRα和TCRβ扩增子进行了测序。

　　在加湿的孵化器中，将所有培养的细胞系保持在37°C和5％CO2。HEK 293T细胞（CRL-3216，American Type Coruture Coluennation）购自美国型培养物收藏品并商业验证。在DMEM（11965-092，GIBCO）中培养HEK 293T细胞，并补充了10％FBS（16140-071，GIBCO），2 mM-glutamine（25030-081，Gibco）和100 U ML-1 Pericillin-strypylin-stroplycin（15140-Stroptoptomcin）（15140-140-140-140-140-140-12，GIBCO）。2d3 Jurkat J76.7细胞57,58（TCR-NULL，CD8+）表达NFAT – EGFP报告基因由F. fujiki提供，并在RPMI 1640（22400-089，GIBCO，GIBCO）中培养，并补充了10％FBS，2 mm -Glutcin和100 u Ml-uniiccin-1 pen-1 mm-1 pen-1。在实验过程中，所有细胞系都证实为支原体阴性。

　　如前所述49,59，构建了TCR相似性网络。简而言之，为了测量TCRαβ克隆型之间的距离，我们使用了conga v0.1.2 Python Package 47的TCRDIST算法实现。使用R语言进行统计计算进行进一步的分析，并使用DPLYR V1.1.4软件包进行数据合并和子集。TCR相似性网络是使用StringDist V0.9.12和IGRAPH v2.0.3（参考文献60）r软件包构建的，并使用Gephi v0.9.7（参考文献61）软件进行了可视化。

　　使用Stitchr V1.0.0（参考文献62），从V/J基因使用情况和CDR3序列重建全长TCRαβ序列。将TCRα和TCRβ链序列修饰以使用鼠常数区域，并与Thosea asigna病毒（T2A）的2A元素连接。编码麦克利的序列还由猪teschovirus（P2A）的2A元素作为转导的荧光标记。编码TCRβ– T2A-TCRα– P2A-MCHERRY的全长基因片段被商业化并克隆到慢病毒载体PLVX-EF1α-ERES-PURO（631253，TAKARA）中。

　　为了产生引起单个感兴趣的个体TCR的跨颗粒（图4C），用PLVX慢病毒载体转导HEK 293T细胞，编码独特的TCRαβ -MCHERRY插入物，PSPAX2包装质粒（质粒＃12260，Addgene）和PMD22。GeNVELOPERPMD22259222222222594：3：1。转染后24小时和48小时，收集病毒上清液，通过0.45 µm SFCA滤波器（723-9945，Thermo Fisher Scientific），使用Lenti-X浓缩仪（631232，Takara）浓缩，并存储在-80°C作为单次使用时。为了生成表达TCR的Jurkat细胞系（Jurkat-TCR+），将2D3 Jurkat J76.7细胞（TCR-NULL，CD8+，NFAT – EGFP报告基因）播种在12孔组织培养的板中，在每孔的1×106个细胞中，在1×106个细胞中，在完整的RPMI（RPMI）中（RPMI 1640，10％FBS，2M）100 U ML -1青霉素 - 链霉素），并通过向每个孔中添加浓缩的慢病毒来转导。在横流后48-72小时，在1μgml-1中加入呼毒素，并培养1周以选择转导的细胞。使用靶向小鼠TCRβ恒定区域的单克隆抗体（APC/Fire750偶联；克隆H57-597，109246，Biolegend; Biolegend; Extended Data;扩展数据），使用流式细胞仪在细胞表面上正确折叠TCR的存在验证了Jurkat-TCR+细胞系。使用FACSDIVA软件（V8.0.1; Becton Dickinson）在定制的BD Fortessa上收集流式细胞仪数据，并使用Flowjo版本10.7.2软件（BD Biosciences）进行了分析。

　　通过使用与单细胞排序PBMC相同的试剂（上），通过四聚体染色来验证表达TCR的Jurkat T细胞系的特异性。简而言之，将1×106的Jurkat-TCR+细胞系或未转导的Jurkat J76.7（TCR-NULL；背景对照）在1×PBS中洗涤，并在50μl的FACS缓冲液（1×PBS和0.04％BSA）中重悬于含有MADS – TERAME-TERETER-TERAMERAMER-PERTAM-PERTER（1:10）中（1×PBS和0.04％BSA），（1:10稀释），基于限制HLA类型（A*02：01和A*02和A*02：02：06），SNX8 – Tetramer – PE（1:10稀释）和SNX8 – Tetramer – Bv421（1:10稀释）（1:10稀释）。还测试了四聚体，包括瓦汉肽序列（LQLPQGTTL），包括Wuhan -Tetramer -Pe（1:10稀释）和Wuhan -Tetramer – APC（1:10稀释）（1:10稀释）。建立了第二组井，其中每个四聚体用于染色细胞。将细胞在黑暗中在25°C的黑暗中孵育30分钟，然后50 µl含有鬼染色紫罗兰色的FACS缓冲液510可行性染料（1：400稀释；批次D0870061322133，13-0870-T500，Tonbo Biosciences）在25°C下添加了30分钟的浓度。然后将细胞用1 mL FACS缓冲液洗涤两次，悬浮在300μlFACS中，并使用FACSDIVA软件（V8.0.1; Becton Dickinson）在定制的BD Fortessa上通过流式细胞仪进行分析。如图7E所述，使用FlowJo版本10.7.2软件（BD Biosciences）进行了细胞种群门控和荧光分析。

　　为了评估相关疾病背景下的细胞类型特异性，我们分析了来自严重，轻度或无症状Covid-19感染，流感病毒感染和健康对照的患者的PBMC样品单细胞测序的SNX8表达48。从登录GSE149689下，从基因表达综合数据库中下载了来自59,572个预滤细胞的基因表达数据，用于分析和下游处理，并使用Scanpy v1.10.0（参考文献63）。（1）细胞少于1,000个总数，（2）少于800个表达基因，（3）将3,000多个表达基因的基因被过滤，作为进一步的质量控制，留下42,904个细胞进行下游分析。将基因表达数据标准化为每个细胞的10,000个计数，并被log1p转换。使用SCANPY函数高度可变的基因使用默认参数（min_mean = 0.0125，max_mean = 3和min_disp = 0.5）64计算出高度_variable_genes。仅使用高度可变的基因进行进一步分析。每个单元的计数总数被回归，并使用Max_value = 10的Scanpy函数尺度缩放基因表达矩阵。使用具有50个主成分的主成分分析进行了维度降低。用Scanpy的功能BBKNN实现的批量平衡K-Nearest邻居用于计算顶级邻居并标准化批处理效果65。使用Leiden算法聚集了批处理的细胞，并将其投影成具有均匀的歧管近似和可视化投影的两个维度。初始群集身份是通过找到具有差分表达分析的标记基因，该标记基因使用学生的t检验进行了差异表达分析，该标记基因在log1p转换的原始计数上使用scanpy函数rank_genes_groups66,67确定。

　　除非另有说明，否则使用Scipy Stats软件包在Python中进行所有统计分析。为了比较两组之间phip-seq富集的分布，使用了非参数kolmogorov – smirnov检验。对于Logistic-Recilsress特征加权，使用了Scikit-Learn package68，并将Logistic-Requression分类器应用于具有MIS-C与处于危险对照的个体的Z得分的PHIP-SEQ值。使用L1求解器与L1正则化使用，并使用五倍的交叉验证（训练中的四个中有四个，而五个进行测试）评估了该模型。对于RLBA和SLBA，首先计算出抗体指数如下：（样本值 - 平均空白值）/（阳性对照抗体值 - 平均空白值）。对于丙氨酸诱变扫描，将每个构建体的空白值组合在一起，并计算一个平均值。然后将归一化函数应用于实验样品（不包括仅抗体对照），以创建范围从0到1的归一化抗体指数。使用Mann-Whitney U-Test进行了两组样品之间的比较。当样品中的归一化抗体指数大于3 s.d时，抗体被认为是“阳性”。高于控件的平均值。在比较两组正态分布数据时，进行了学生的t检验。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。