所有程序均根据美国国立卫生研究院制定的准则，并得到斯坦福大学机构护理和使用委员会的批准。

　　雄性和雌性小鼠在所有实验中均同样使用，并随机分配给治疗条件。Hemizygous Dat-Cre（杰克逊实验室，006660）小鼠用C57BL/6 J育成（杰克逊实验室，000664）。对动物的dat-cre或纯合为VGAT-CRE进行了光遗传学实验（杰克逊实验室，028862）。对于MGFP的少突胶质细胞特异性表达，将纯合MT/MGLOX/LOX（杰克逊实验室，007676）动物与PLP1-Creert（Jackson Laboratory，0055975）交叉。对于MYRF的有条件删除，将Hemizygous PDGFRA-CRERTM（杰克逊实验室，018280）小鼠与纯合子myrflox/lox Mice48（杰克逊实验室，010607）一起繁殖，以产生hemizygous pdgfra pdgfra-creertm and+who who who who who who who who whos whos yrffos yrfffos myrfffos yrfffos yrfffos yrfffos yrfffos yrfff。纯合myrflox/lox可以实现半合子PDGFRA-CREERTM和纯合myrfopc - / - （myrflox/lox; pdgfra-creertm）。缺乏PDGFRA-CREERTM的同书用作对照动物。For conditional deletion of TrkB, hemizygous Pdgfra-CreERTM (the Jackson Laboratory, 018280) mice were bred with homozygous TrkBlox/lox (MMRC, 033048-UCD) to generate hemizygous Pdgfra-CreERTM and heterozygous TrkBlox/+, which were backcrossed to homozygoustrkblox/lox可以实现半合子PDGFRA-CREERTM和纯合TrkBopc - / - （Trkblox/lox; pDGFRA-Creertm），在先前的upplucation 5中被称为opc-trkb cko。缺乏PDGFRA-CREERTM的同窝仔被用作对照动物。For conditional deletion of Oprk, hemizygous Pdgfra-CreERTM (the Jackson Laboratory, 018280) mice were bred with homozygous Oprk1lox/lox (the Jackson Laboratory, 030076) to generate hemizygous Pdgfra-CreERTM and heterozygous Oprk1lox/+, which were backcrossed to homozygousoprklox/lox可以实现半合子PDGFRA-CREERTM和纯合子OPRK1LOX/LOX（OPRK1LOX/LOX; PDGFRA-CREERTM）。缺乏PDGFRA-CREERTM的同窝仔被用作对照动物。启动依赖MYRF，TRKB或OPRK的Cre依赖性删除， 在7周或4周大的时候，将动物腹膜内注射100 mg kg-1 tamoxifen（Sigma-Aldrich）5天。对于MGFP表达，MT/MG动物在4周龄时注射相同浓度的他莫昔芬3天。为了测试药物对少突胶质细胞的作用，使用了野生型C57BL/6 J（杰克逊实验室，000664）小鼠。所有动物均在12小时的光/黑暗周期中容纳，无限制地获得食物和水。行为实验是在同一昼夜节律期间进行的（07：00–19：00）。在不同时间进行的至少两个独立实验中重复所有小鼠实验。样本量以功率计算为指导。

　　对于光遗传学实验，通过注入AAV-DJ-EF1A-DIO-HCHR2（H134R）:: eyfp（病毒滴度1.3×1012基因组副本），每毫升每毫升，VGAT-CRE依赖于Halorhodopsin的表达Halorhodopsin的表达来实现ChannelRhopops的DAT-CRE依赖性表达。AAV-DJ-EF1A-DIO-NPHR3.0 :: EYFP（病毒滴度1×1012基因组副本每毫升）和EYFP控制AAV-DJ-DJ-EF1A-DIO-EYFP（病毒滴度1.6×1012基因组副本，每毫升）。所有用于光遗传学实验的病毒载体均从斯坦福大学基因载体和病毒核心获得。对于纤维光度法实验，通过注射AAV9-HSYN-DA2M（DA4.4）（病毒滴度，1.64×1013基因组副本）来实现GRABDA表达，从WZ Biosciences 49获得。

　　用1–4％的异氟烷​​麻醉动物，并放置在立体定位仪中。对于光遗传学刺激实验，使用汉密尔顿神经性的注射剂单方面注射1 µL AAV-CHR2 :: EYFP或AAV-EYFP病毒载体，并在5分钟内单方面注射。从核酸群中测量了病毒注射和光学套圈放置的坐标。将病毒载体注入坐标处的VTA，前后（AP）= -2.8 mm，中外侧（ML）= -0.3 mm，背腹（DV）= -4.4 mm，将光学纤维放在AP = -2.2.8 mm，ml，ml = -0.3mm，DV = -0.3mm，dv = -dv = -22.8 mm，mm，ml = -2.8 mm，ml。对于NAC刺激，放置光学套圈以AP = +1.25 mm，ML = -0.75 mm，DV = -4.00 mm。

　　在病毒载体输送后至少3周和光学伪造物植入后1周进行光遗传学刺激。将动物自由移动的动物连接到具有单纤维贴片线的473 nm二极管泵式激光系统。对于神经元细胞体和轴突末端，阶段DA神经元刺激均以30 Hz进行，每5 s的八个5 ms脉冲每5 s以15 mW（约475 mW mm -2 mm -2）的光输送为473 nm。每1分钟以473 nm光递送（参考文献30），以1 Hz进行补品DA神经元刺激。急性光遗传学刺激会持续30分钟，以进行阶段或滋补刺激。在刺激开始之前和之后，用40 mg kg -1的EDU注射动物（Invitrogen，e10187），并灌注3小时。每天进行10分钟，持续7天，并为所有刺激课程进行EDU注射。停止刺激后4周，将动物灌注。为了进行抑制实验，将自由移动的动物连接到具有单纤维贴片线的595 nm高功率LED系统。NPHR抑制GABA能神经元细胞体在1 Hz时以595 nm光递送的恒定抑制作用，从光纤尖端从15 MW（约475 MW mm -2）的光功率输出（约475 mW mm -2）进行8 s。

　　将AAV9-HSYN-DA2M（DA4.4）注射到NAC中（AP = +1.25 mm，ML = -0.75 mm，DV = -4.40 mm）和光纤纤维（400 µM核心直径（400 µM），Na = 0.48，Doric镜头位于注射位点上方DV = -4.30毫米）。在开始CPP之前，用他莫昔芬给小鼠施用小鼠。在允许3到4周的病毒表达后，在预测试期间记录了GrabDA信号，而小鼠探索了三腔CPP设备的每个腔室30分钟。然后，小鼠通过吗啡调节5天。然后在测试后探索期间再次记录GrabDA信号，持续30分钟，与预测试相同。

　　通过控制RZ5P锁定放大器（Tucker-Davis Technologies）的突触软件获得光纤光度法数据。Grabda对频率调制的465和405 nm LED（Doric镜头）感到兴奋。光信号用荧光迷你立方体FMC4（Doric镜头）过滤带通信号，并以6 kHz数字化信号。使用MATLAB（MATHWORKS）中的自定义脚本执行信号处理。简而言之，通过与单指数衰减函数拟合，对信号进行了脱毛，并且所得的荧光痕迹被z得出。为每只动物的测试和测试后的每只动物的第一次进入吗啡调节室分析视频。通过取下20 s的荧光时期的荧光时间直方图构建，该荧光的平均荧光时期由10 s和10 s组成，在腔室进入后的10 s组成，该荧光的平均成绩为时间= 0。在平均时定义，每个时期的平均Z得分被抵消，以使从-10到-1 s的平均z得分在-10至-1 s等于0。在曲线下等于0。（auc）的区域（auc）定义为0。AUC差异得分计算为每只动物的（测试后AUC-AUC-检验AUC）。

　　实时位置偏好是在一个两腔丙烯酸盒（每个腔室45×20 x 25 cm3）中进行的，而没有任何上下文提示。每只鼠标都连接到一个带有单纤维贴片线的473 nm激光系统，并在测试开始时轻轻地放入笼子的中间部分。在测试之前，将一个笼子的一个腔室随机分配用于光遗传学刺激。每当小鼠进入预先分配的腔室中，如果小鼠移动到另一个腔室，则打开光遗传学刺激。每个课程持续20分钟。Ethovision XT软件（Noldus）用于以自动化和条件盲的方式确定测试后每个腔室中花费的时间。

　　实验方案是根据先前描述的方法35改编的。CPP在丙烯酸矩形的三腔设备中进行，其两个不同的腔室通过中性走廊连接。“网格室”包括地板质地上的3毫米宽网格和白色墙壁上的黑色条纹。“斑点室”包括一个地板，上面有10毫米直径的孔和白色的墙壁。两个腔室都是立方体（18×18×18 cm3），并通过10厘米宽的走廊（10×18×18 cm3）连接。每个网格或斑点室的入口可以用透明的丙烯酸分层封闭。在第1天，通过将它们放在笼子中测试了小鼠对任何一个腔室的基线偏好。经过30分钟的自由探索，在带有两种不同种类的地板的房间之间，小鼠被送回家居笼子。在预测试期间表现出强烈偏爱的小鼠（超过75％）被排除在进一步分析之外。在第2天的早晨（条件第1天），所有小鼠均用盐水腹膜内施用，并将两种地板的非条件室放置15分钟，然后返回家园。早上的会议之后是4小时后进行调节下午会议。在下午的课程中，第一组小鼠接受了盐水和EDU（40 mg kg -1）的腹膜内注射，并放置在调节室中。将第二组小鼠用10 mg kg -1的吗啡和EDU（40 mg kg -1）腹膜内施用，并将其放置在调节室中30分钟。第三组接受了20 mg kg -1的吗啡和EDU（40 mg kg -1）腹膜内，并将其放在条件室中30分钟。第四组小鼠接受了15 mg kg -1的可卡因和EDU（40 mg kg -1），并将其放置在调理室中20分钟。对于纳洛酮实验，将动物注射5 mg kg-1的纳洛酮（Tocris-0599） 在调节期间。在接下来的第3、4、5和6（总条件1-5天）中重复这些条件会话。在第7天，在测试后，再次允许小鼠在笼子周围自由移动30分钟。食品CPP的进行方式与药物CPP类似。食品奖励组和限制对照组的食物在CPP开始前48小时限制至85％的体重，并在测试期间保持其重量。在CPP之前的两个晚上，将小鼠习惯于家用笼子中的巧克力蔗糖颗粒。在预测试期间，允许所有动物组自由探索该设备。斑点和网格室都装有空的，相同的称重船，上面贴在后角的地板上。在第2天的早晨（条件第1天），将小鼠放入非调节室中，用一个空的称重船持续30分钟。没有盐水注射。下午，将小鼠腹膜内的EDU（40 mg kg -1）施用，并将其放置在调理室中，称重船，装满了巧克力蔗糖颗粒，用于食品奖励组，并为食物限制对照组进行空的称重船30分钟。在整个调节会议期间，允许食物奖励小鼠自由食用蔗糖颗粒。这些调节会议在接下来的4天内重复。在第7天，允许小鼠在测试后30分钟内自由移动该设备，其中斑点和网格室都装有新鲜的称重船，没有蔗糖颗粒。记录所有药物调节会议以捕获运动数据。但是，用于组织学数据的最初的CPP实验是在COVID-19的大流行锁定条件下进行的，因此我们无法记录大多数实验组的调节性会话。之后，我们进行了更多的CPP分析以记录运动数据和CPP偏好， 在图3中，在这些分析中导致了不同数量的动物。使用Ethovision XT软件（Noldus）以自动化和条件性的方式分析了每个室内花费的时间和每只小鼠传播的距离的时间。

　　实验方案是根据先前描述的方法50改编的。每天每天处理动物，每天进行5分钟的测试，并习惯于实验室。将小鼠放在丙烯酸实验笼中（50×50×50 cm3），以在测试前的第二天适应10分钟。在测试当天，通过将小鼠放入实验笼中进行10分钟并记录视频来测试小鼠的焦虑。如果动物在盒子的中心（距离墙壁10厘米）花费不到2分钟，则认为它太焦虑了，无法进行测试，并从分析中丢弃了。然后将小鼠放在家用笼中持续5分钟。对于训练阶段，将小鼠放置在实验室中，带有两个相同的无生命物体（大小约为5厘米）。每次将小鼠放在实验室中时，它都会朝对象朝向不透明的壁。允许鼠标探索这些物体10分钟，然后返回其家笼。实验室和物体都使用70％乙醇清洁。对于训练阶段24小时后进行的新型对象测试阶段，将小鼠返回笼子以探索这些物体10分钟。这些物体之一被返回到实验笼中，并将相似大小的新型物体放入笼子中。用作新颖和熟悉的物体，从试验到动物到动物，新物体的位置是平衡的。最初对所有使用的物体进行了测试，以确保对动物没有偏见或偏爱。所有会话均以自动化和条件盲的方式使用Ethovision XT软件（Noldus）记录和分析。物体2厘米内的任何探索性头手势，包括嗅探和咬人，都被视为调查，但没有考虑爬上物体。分析中只包括探索物体至少20 s的动物。

　　实验方案是根据先前描述的方法51改编的。他莫昔芬给药诱导MYRF缺失后4周对小鼠进行了蔗糖偏好。在第一天，动物在实验笼中单独习惯，并用水喝瓶子。第二天，提供了一个水瓶和一个蔗糖溶液瓶（1％wt/vol），以随意进入小鼠。每24小时补充水和蔗糖溶液，并在3天内确定每天消耗。每天交换蔗糖和水瓶的位置，以防止对瓶子的位置产生偏见。通过减去对照瓶中的体积损失来校正所有测量值。

　　他莫昔芬给药诱导MYRF缺失后4周对小鼠进行了社会偏好。测试前，动物习惯于实验室和三腔实验笼。每个外室中的三腔丙烯酸实验笼（每个腔室45×20×25 cm3）都包含两个金属网格铅笔杯（直径10厘米）。将腔室用透明的丙烯酸壁划分，并带有15厘米宽的入口孔。其中一个钱伯斯在铅笔杯中包含一个新颖的同性少年，另一个房间在铅笔杯中包含一个无生命的物体。将测试小鼠放入中间腔室，并在腔室分隔器移除后1分钟，并允许小鼠自由探索20分钟。新小鼠和无生命物体的位置在会话之间平衡了。使用Ethovision XT软件（Noldus）以自动化和条件盲的方式分析了与任一铅笔杯互动的时间。

　　如上所述，对小鼠（盐水对照，n = 3;吗啡，n = 3）进行CPP测试。在第7天，再次允许小鼠在笼子周围自由移动30分钟，并分析在每箱上花费两种网格的时间。测试后，将小鼠用20 mL的灌注缓冲液（110 mM NaCl，10 mM HEPES，25 mM葡萄糖，75 mM蔗糖，7.5 mM MGCL2，2.5 mM KCl，5 µg ML-kCl，5 µg ml-1）肌肉杆菌菌素D和10 µM肌triptolide in Ultrapase in Ullapure dnnane/r r酶。迅速收集大脑，在干冰上闪烁在异戊烷中，并在-80°C下储存。将冷冻的大脑切开在低温恒温器中，直到使用约1 mm深度的1.75 mM活检打孔，直到两个半球的AP = -2.8 mm和VTA撞击。将打孔存储在-80°C以进行处理。

　　Punches for each mouse were added to a Wheaton Dounce homogenizer containing 1 ml of ice-cold nuclei isolation medium (10 mM Tris pH 8.0, 250 mM sucrose, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 1% RNasin Plus, 1× protease inhibitor, 0.1 mM DTT, 5 µg ml−1 of actinomycin D,超纯DNase/RNase无蒸馏水中的10 µM triptolide和砷霉素。通过十个中风将组织解散，悬垂的杵，然后用十个牢牢的杵分离。匀浆通过40μM细胞过滤器，并在900g下离心15分钟以颗粒。将细胞核重悬于1 mL的重悬浮缓冲液中（1倍磷酸盐缓冲液（PBS），1％核酸酶无BSA和0.5％rnasin plus），并在900g下再离心15分钟，以使核颗粒颗粒。除去上清液，然后通过添加500 µL含有0.1 µg ml -1的DAPI的重悬式缓冲液染色，然后转移到FACS管中。然后，使用具有70 µm芯片的Sony MA900混蛋对FACS进行核对。对所有样品应用了标准的门控策略。首先，核是在其大小和散射特性上门控。双重歧视门用于排除核的聚集体。最后，核在DAPI上门控。将单核分类为含有10 µL重悬式缓冲液的冷藏PCR管。使用血细胞计验证了核的计数。

　　10倍铬下一个宝石单细胞3'ht kit v.3.1用于库制备。按照制造商的说明，将核与主混合物迅速混合，并加载到10倍铬的下一个宝石芯片M上，并在10倍铬X仪器上运行，旨在从每个铬中回收20,000个细胞。根据制造商的协议，我们生成了10x 3'RNA-seq库。互补的DNA扩增和图书馆构建后，进行了质量控制，以确保样品的质量。在Illumina NextSeq2000上加载文库，并在靶向深度为20,000个读取的目标深度为20,000个读取，并在Illumina NextSeq2000上加载1％的PHIX对照（28个周期读取1，10个循环i7指数，10个循环i7索引，90个循环读取2）。

　　使用Cell Ranger（V.7.0.1），将原始读取（FASTQ）文件与鼠标参考基因组（MM10-2020-A）对齐。对于SNRNA-Seq，使用R（v.4.2.2）完成了所有分析，定量和统计测试。Seurat（V.4.3.0）用于预处理，降低降低，聚类和差异表达测试。将每个样品的细胞游侠计数矩阵合并，低质量的细胞，少于200个基因或大于5％的线粒体映射唯一分子标识符（UMIS）和假定的Doublets，并去除了4,000个检测到的基因。总共80,302个核通过了这些质量控制标准（39,780盐水和40,522吗啡）。然后将UMI计数数据归一化，以使每个细胞每个基因的计数除以每个细胞的总UMIS，乘以10,000的比例因子，自然对数转换。进行了方差稳定转化，并确定了前2,000个可变基因，然后进行主成分分析。使用前12个主组件进行UMAP，并使用基于图的聚类来识别分辨率参数为0.8的簇。为了专注于寡头谱系细胞，然后使用相似的参数将少突胶质细胞和OPC子集进行了子集和重新聚集。使用先前定义的寡头亚群标记物标记了从OPC到成熟的少突胶质细胞的轨迹37。所有差异表达测试均使用Bonferroni校正的Wilcoxon Rank-sum测试进行多个比较。调整后的p <0.05，伴随的平均log2倍变化大于0.25的幅度被认为具有统计学意义。SCTYPE和差异表达测试首先是根据规范标记基因表达和同一细胞类型的簇鉴定细胞类型的52。使用簇剖面（V.4.6.2）进行基因集富集分析 使用超几何测试确定基因本体论生物过程项的富集差异表达的基因。使用CellChat（V.1.6.1）进行细胞 - 细胞通信分析和推理，以计算聚集的细胞 - 细胞通信网络，并识别有助于不同细胞组的传出或传入信号的信号38。

　　为了测试吗啡和多巴胺的直接作用，使用了体外OPC增殖测定法。C57BL/6 P4-5小鼠幼崽被迅速斩首，并在Hibernate-A培养基中处理大脑（Thermo Fisher Scientific，A12475-01）。在旋转器上，在含有DNase（Worthington Biochemical LS002007）和Liberase（Roche Applied Sciences 05401054001）的含有HEPES-HBS的缓冲液中酶脱离了酶的组织。然后将组织混合物用1,000 µL尖端进行三杆，并通过100 µm的细胞滤网。根据制造商的说明，使用CD140（PDGFRα）Microbead试剂盒（MACS，MILTENYI BIOTEX 130-101-502）分离OPC。在层粘连蛋白涂层（Thermo Fisher Scientific，23017015）上，总共将30,000个细胞在24孔板上盖上覆盖板。OPC媒体含有DMEM（Thermo Fisher Scientific，11320082），谷氨酸（Invitrogen，35050-061），丙酮酸钠（Invitrogen，11360070），MEM非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific，11140076），抗生素 - 抗生素 - 抗生素（DID21）AR012), trace elements B (Corning, 25-022-Cl), 5 mg ml−1 of N-acetyl cysteine (Sigma-Aldrich, A9165), 10 ng ml−1 of PDGFAA (Shenandoah Biosciences, 200-54), 10 ng ml−1 of CNTF (PeproTech, 450-13) and 1 ng ml−1使用了NT-3（Peprotech，450-03）。为了进行增殖研究，在增殖培养基3天后，在OPC培养基中用各种浓度的吗啡或多巴胺处理细胞24小时。在此处理的最后4小时中，将10 µM EDU添加到培养基中以标记分裂细胞。之后，将细胞固定在4％多聚甲醛（PFA）中持续20分钟，并在HBSS中孵育直至免疫组织化学。所有体外实验均在三井（技术复制）中进行，并独立复制（生物学重复）。

　　所有小鼠均用腹膜内注射为2.5％avertin（三纤维乙醇； Sigma-Aldrich，T48402），并以20 mL的0.1 mL PBS灌注。将大脑在4％PFA中在4°C的4％PFA中后固定，然后再在30％蔗糖溶液中冷冻保护48小时。为了切片，将大脑嵌入最佳切割温度（组织 - 技术）中，并使用滑动的微型集团（Leica，HM450）在40 µM处冠状切片。对于免疫组织化学，根据制造商的协议，使用Click-IT EDU细胞增殖试剂盒（Invitrogen，C10339）染色脑部。然后在阻塞溶液中孵育后用抗体染色（3％正常驴血清，0.3％Triton X-100）在室温下30分钟。山羊抗PDGFRα（1：500; R＆D系统，AF1062），兔抗olig2（1：500; ABCAM，7349），兔子抗AST-ASTI-AST-ASTI-ASTI-AST-AST-AST-AST-AST-AST-AST-AST-Millipore，ABN1698），Rat Anti-Mbp（1：200; ABCAM AB7349），Rab749），rabibity anti-ti-hyy（500）;Millipore Sigma，AB152），鼠类抗酪氨酸羟化酶（1：250; Novus Biologicals，Mab7566），鸡肉抗GFP（1：1,000; Aves Labs，GFP-1020），GFP-1020），鸡抗Mcherry（1：1,000将SC-52在1％阻断溶液中稀释（在TBS中为0.3％Triton X-100中的1％正常驴血清），并在4°C下孵育过夜。所有抗体均已在文献中验证用于小鼠免疫组织化学。为了进一步验证抗体，我们证实了每种抗体在预期的细胞模式和大脑范围的分布中染色（例如，核olig2染色，细胞膜PDGFRα染色，中脑DA神经元中的酪氨酸羟化酶染色）。第二天，将脑切片在1×TBS中冲洗三次，并在室温下在二级抗体溶液中孵育2小时。所有二级抗体均以1：500浓度（包括Alexa 488抗兔子）（Jackson Immunoresearch; 711-545-152），Alexa 488反小鼠（Jackson Immunoresearch; 715-545-150），Alexa 488 Anti-Chicken（Jackson Immunoresearch; 703-545-155），Alexa 594 Anti-Chicken（Jackson Immunoresearch; 7033-585-1555555555555555555）Immunoresearch; 705-605-147），Alexa 647抗鼠（Jackson Immunoresearch; 712-605-150），Alexa 647抗兔子（Jackson Immunoresearch; 711-605-152），Alexa 647 Donkey Anti-Goat Goat（Jackson Immunores ereach）（711-605-152）然后将切片在1×TBS中冲洗三次，并用延长的黄金安装（Life Technologies，P36930）。

　　所有图像分析均由对实验条件或基因型的实验者进行。使用具有自动化阶段的Zeiss AxioObserver直立荧光显微镜拍摄EDU立体图像，并具有×20物镜的自动化阶段和瓷砖扫描能力（立体调查员，Microbrightfield）。在组织学分析中排除了在灌注或组织加工过程中受损的脑组织。在中脑和NAC延伸的整个DA神经元的延伸过程中，每六十µm切片进行成像和细胞计数。不包括围绕铁子引起的组织损伤的细胞。标记了具有酪氨酸羟化酶标记的区域（或光遗传学研究阳性的Dat-Cre»GFP阳性），并使用Stereo研究者软件手动对这些区域的EDU细胞进行了计数。报告的数字是该区域的函数报告的（每MM2细胞）。通过使用Zeiss LSM710或LSM980共聚焦显微镜（Carl Zeiss）获取Z-stack进行较高的分辨率成像。对于MBP强度分析，使用与动物和切片相同的激光和荧光环境的共聚焦显微镜拍摄Z-stack图像。使用fiji量化了由DAT-CRE»GFP标记的VTA上像素的平均MBP强度，并报告为该区域的函数。

　　停止慢性时遗传刺激后四周，用卡诺夫斯基的固定剂通过心心灌注对小鼠安乐死：2％戊二醛（EMS 16000）和4％PFA（EMS 15700）在0.1 M钠cododylate中（EMS 12300），pH 7.4。为了进行区域准确性和一致性，将大脑分为振动型（Leica VT1000）的250 µm厚切片，直到中脑。然后在视觉纤维标记下从VTA区域收集2毫米直径的组织。然后将样品在室温下在1％四氧化os（EMS 19100）中固定1小时，用超过滤水洗涤3次，然后在室温下染色2小时。在4°C下，样品在分级乙醇（50％，75％和95％）中脱水15分钟；然后将样品平衡至室温，并在100％乙醇中冲洗两次，然后用乙腈持续15分钟。将样品用嵌入-812树脂（EMS 14120）与乙腈混合2 h混合2 h，然后用2：1嵌入812：乙腈混合2小时。将样品放入嵌入-812中2小时，然后将其放入装满新鲜树脂的Taab胶囊中，然后将其放入65°C的烤箱中过夜。在Leica Ultracut S（Leica）上取出40至60 nm之间的切片，并安装在100英寸NI网格（EMS FCF100-NI）上。对于免疫组织化学，用10％周期性酸进行微蚀刻，并在室温下在室温下用10％metaperiodate用10％metaperapoiodate洗脱osmium。将网格用水冲洗三遍，然后用0.5 m的甘氨酸淬灭，然后在室温下在阻断溶液（0.5％BSA，0.5％ovalbumin）中孵育20分钟。将初级兔抗GFP（1：300; MBL国际）稀释在相同的封闭溶液中，并在4°C下孵育过夜。第二天，将网格冲洗三遍，并在二抗中孵育（1:10 10 nm偶联的IgG Ted Pella 15732） 在室温下持续1小时，然后用PBST冲洗，然后用水冲洗。对于每个染色组，同时进行仅次级染色以控制任何非特异性结合。在3.5％乙酸铀酰中的50％丙酮中，将网格染色为30 s，然后在0.2％的柠檬酸铅中染色90 s。使用JEOL JEM-1400 TEM在120 kV中成像样品，并使用Gatan Orius数码相机收集图像。还使用荧光显微镜测试了所有样品的相邻切片的CHR2 :: YFP和YFP信号，以确认病毒标记。所有图像分析均由对实验条件的实验者进行。还进行了仅二抗体对照，以建立免疫元标记背景量。具有三个以上独立免疫球球的髓鞘轴突被计为阳性标记。通过将最短的轴突直径除以相应​​的轴突衬套直径（轴突/轴突和髓磷脂鞘直径的直径）来计算G-RATIOS。每只动物分析了296至446个轴突。通过以每种尺寸为单×10,000电子显微照片量化髓鞘轴突的数量来分析髓鞘的轴突密度。平均量化了45张图像，并将骨髓轴突的总数除以每只动物的总面积。组平均值是根据鼠标（不是每轴突或图像）计算的。

　　在行为测试，显微镜成像和组织学分析过程中，实验者对动物的基因型视而不见。所有光遗传学实时位置偏好实验，CPP和CPA预测试前检验偏好比较，以及使用两尾配对t检验评估了高斯分布的新颖对象识别测试数据。在不假定CPP偏好数据的正常分布的情况下，我们进行了Wilcoxon非参数签名级测试。对于所有组织学分析和具有正常分布的CPP Z得分，使用未配对的两尾t检验分析了组平均差异。对于未通过正常性测试的数据，使用了Mann-Whitney非参数测试。所有统计分析均使用GraphPad Prism软件进行。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。