所有小鼠均根据加州大学旧金山大学机构动物护理和使用委员会批准的所有程序处理。在所有实验中，在温度控制的（22–24°C）中，在12/12 h的光/黑暗周期中，在所有实验中均饲养小鼠（每个笼子2至5个），并随意进行食物和水。住房条件符合加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会所维护的标准，其中包括标准尺寸的老鼠笼子，床上用品，内斯特，gnawing块和Enviro-Dry嵌套材料。未提供其他环境丰富。男性和女性用于所有实验。对于青春期期间的少突胶质发生的跟踪，NG2CREER：Tau-MGFP小鼠51,52（JAX，NOS，NO.008538和021162）通过Oral Gavage从P26 TO 26 to P28收到100 mg kg-1 tamoxifen（Sigma，Sigma，CatalogNo。T5648）。一个子集还通过腹膜内注射还接受了80 mg kg -1 EDU（Carbosynth，Catalog NE.NE08701）。为了阻止青少年的少突根发生，PDGFRA-CREER：MyRFFL/FL小鼠13,53（Jax，Nos。018280和010607）接收到100 mg kg-1 tamoxifen，由P10到P14的口服饲料。为了在体内可视化树突状刺，PDGFRA-CREER：myrffl/fl小鼠与Thy1-YFP-H小鼠交叉（JAX，no。003782）。在整个数据获取和分析过程中，实验者对动物基因型视而不见。

　　用avertin对小鼠进行深度麻醉，并在1×PBS中用4％多聚甲醛灌注。将脑组织分离并在该溶液中在4°C下过夜，然后在1×PBS中存储为0.1％NaAZ。在滑动的微型集团上，在闪烁冰冻和冠状动脉（30μm）之前，对大脑进行了蔗糖保护（PBS 30％）。在室温下，用0.2％Triton X-100和10％正常山羊血清透化/阻断自由浮动的截面。将切片与在0.2％Triton X-100中制备的初级抗体一起孵育，在4°C的1×PBS中在1×PBS中孵育10％的正常山羊血清过夜。将切片与二级抗体在室温下的1×PBS中的10％正常山羊血清中孵育2小时。Primary antibodies and concentrations used are as follows: rabbit anti-ASPA (1:1,000), chicken anti-GFP (1:1,000), rat anti-MBP (1:200), rabbit anti-PDGFRα (1:200), rabbit anti-cleaved caspase-3 (1:200), mouse anti-glial fibrillary acidic protein (1:1,000), human anti-SOX9（1：2,000），兔抗IBA1（1：1,000），小鼠抗NF-L-L degenotag（1：1,000），兔抗NF-H（1：1,000），小鼠抗PV（1：1,000），生物素化的WFA（1：400）（1：400），兔抗Caspr（1：1：600）和鼠标抗小鼠抗BCAS1（1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：300;补充表2中列出了其他细节。上面的主要抗体已经过验证，用于在小鼠组织，已发表的文献和制造商的网站中用于免疫组织化学。使用的二抗包括：Alexa Fluor 488-，594或647偶联的二级抗体，涉及兔子，小鼠，人，人，鸡，大鼠或链霉亲素（1：1,000（1：1,000，全部均在山羊中饲养；从Thermo Fisher Scientific或Jackson Immunoresearch购买的山羊；补充表2列出了其他细节。细胞核用DAPI（载体实验室）标记。根据制造商的说明，使用ABCAM TUNEL分析套件（ABCAM，ABCAM，CatalogNo。AB66110），根据制造商的说明对固定脑部进行了TUNEL免疫染色。

　　用Zeiss Axio Imager Z1带有apotome Z1的瓷砖Z-stack（具有2 µM步骤），涵盖30 µM视觉皮层和侧面遗传核或20 µM视神经的侧面，并使用APOTOMES附件和Zeiss Zen 2（蓝色版本2（蓝色版本），v.2.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0）。为了进行定量，从每只小鼠的两个或三个部分拍摄图像。使用斐济的细胞计数器手动定量细胞密度。在整个成像采集和分析中，实验者对基因型视而不见。

　　用异氟烷麻醉8-12周的小鼠。迅速去除大脑，并将其放入含有125 mm NaCl，2.5 mm KCl，2 mm CaCl2、1.25 mm NAH2PO4、1 mm MGCL2、25 mm NaHCO3和15 mm -glucose的冰冷的脑脊液（ACSF）中。ACSF用95％O2和5％CO2饱和。将渗透压调整为300–305 MOSM。使用振动叶片的微型群（Leica VT1200）在冰冷的ACSF中制备含有视觉皮层的冠状切片（300 µm）。将切片在32°C下回收20分钟，然后在室温下转移到ACSF。恢复期后，切片在30-31°C时以2-3 ml min -1的速度移至浸没的记录室，并在恢复5小时内记录大脑切片。使用电阻的2-4MΩ的玻璃移移移移移感制作了MIPSC的电压钳记录，该溶液中含有126 mm CSMESO3，8 mm NaCl，10 mm HEPES，2.9 mm QX-314，2.9 mm QX-314，8 mm Na2 Na2 Na2磷酸蛋白酶pH 7.2–7.3，渗透压285–290 MOSM。在录音期间在线监控输入阻力；分析中排除具有大于20MΩ的电阻的细胞。记录以0 mV的持有潜力进行。在浴室中，用四毒素（1μM），NBQX（10μM）和APV（50μM）在药理学上分离MIPSC。使用2×基线噪声的阈值分析每个细胞的200到300个事件。使用WINWCP软件（英国Strathclyde大学）的多灯700B放大器（分子设备）获得录音。在2 kHz中过滤信号，以10 kHz（NI PCIE-6259，国家仪器）数字化，并使用Minianalysis计划（SynaptoSoft）进行了离线分析。在整个记录和分析中，实验者对动物的基因型视而不见。

　　使用5％的异氟烷​​麻醉小鼠，并与2-3％的异氟烷​​保持麻醉。右眼眼睑被两个床垫缝线缝合，以适用于青春期NG2CREER的P26：Tau-MGFP小鼠或6-12周的临界后pdgfra-creer：myrffl/fl小鼠。在手术前后，对美洛昔康和丁丙诺啡进行疼痛管理。每天检查动物，以确保在实验的所需持续时间内保持缝合眼保持闭合。在事后剥夺ISI会议之前，将缝合线去除。用无菌盐水冲洗眼睛，并在显微镜下检查清晰度。仅使用没有角膜不熟悉的小鼠或感染迹象。

　　如先前所述，对内在信号的重复光学成像和眼部优势的定量进行了定量。简而言之，在记录过程中，将小鼠用0.7％的异氟烷​​在氧气中通过自制的鼻膜施加，并补充了单次肌内注射20-25 µg氯普蛋白烯。小鼠进行了非侵入性程序，其中将头板固定在头骨表面以实现头部固定成像，并经经颅记录图像。使用自定义Linux软件，使用装有135×50 mm串联镜头（Nikon）和红色干扰过滤器（610±10 nm）的DALSA 1M30 CCD摄像头（DALSA）获得固有信号图像。以每秒30的速率获取框架，在暂时的额定框架上以四个帧的速度存储，并在1,024×1,024摄像头的空间套筒以2×2像素为单位时，以512×512像素图像存储。The visual stimulus for recording the binocular zone, presented on a 40 × 30 cm2 monitor placed 25 cm in front of the mouse, consisted of 2°-wide bars that were presented between −5 and 15° on the stimulus monitor (0°, centre of the monitor aligned to centre of the mouse) and moved continuously and periodically upward or downward at a speed of 10° s−1.如前所述，通过傅立叶分析提取了刺激频率的皮质反应的相位和幅度。响应幅度是至少四个测量值的平均值。如前所述，计算了眼优势指数。简而言之，使用5×5像素的均匀核通过低通滤波平滑后，基于同侧眼反应图选择双眼响应型区域（ROI）（ROI），并以峰值响应幅度的40％的阈值进行阈值。在此ROI中为每个像素计算了眼部优势评分（C -i）/（C+I），其中C和我分别表示对对侧和同侧眼刺激的响应幅度 然后将眼优势指数计算为所有反应像素的眼部优势得分的平均值。在整个成像和分析中，实验者对基因型视而不见。

　　在8-12周的年龄，将3×3 mm2颅窗（第1号盖玻片，华纳仪器）放置在皮质的左半球上，与被剥夺的眼对侧放置。使用5％的异氟烷​​麻醉小鼠，并与2-3％的异氟烷​​保持麻醉。使用否切开了与盖玻片大小相匹配的颅骨切开术。11头手术刀叶片（精细的科学工具）和盖玻片小心地放置在颅骨切开术中的硬脑膜顶部，而不会过多压缩大脑。使用立体定向坐标将窗口居中，距离Bregma的2 mm横向和3 mm的视觉皮层中心。使用牙科水泥（C＆B metabond，Parkell）密封窗户和头骨。在手术期间，在头骨上附有定制的金属头条，以进行头部固定成像。在两光子成像之前，允许小鼠恢复2-3周。

　　如前所述，用PDGFRA-CREER：MyRFFL/FL小鼠与Thy1-YFP-H小鼠进行了纵向在体内两光子成像。具体而言，在同氟朗兰素麻醉下，通过小鼠的颅面窗户在皮质表面下方反复成像表达YFP的皮质锥体神经元的顶端树突。使用带有谐振扫描仪（Thorlabs）的Bergamo II两光子显微镜系统和使用Thorimage LS软件的数值孔径水免疫物镜（Nikon）获取图像。YFP在925 nm处激发，具有模式的，可调的，超快的激光（Insightx3，光谱物理学），其功率为15-100兆瓦，可传递给物镜的后置。以1,024×1,024像素的形式获取图像堆，其体素大小为0.12μm，x和y和z-step为1μm。在获取过程中，将来自谐振扫描的成像帧进行平均，以达到1 ns的像素停留时间。每只鼠标最多获得了多达六个成像区域。图中显示的代表性图像是通过制作三维堆栈的Z射击而创建的，并进行了中位数过滤并增强了对比度。

　　如前所述31,55，使用Igor Pro（WaveMetrics）编写的“自定义软件地图管理器”（https://mapmanager.net）分析了树突状刺。在整个成像采集和分析中，实验者对基因型视而不见。为了注释，首先使用ImageJ中提供的“简单神经突示踪剂”插件的修改版本对树突轴进行追踪。沿着树突状段的脊柱位置通过所有成像课程的三维图像堆栈手动识别。为了进行纵向分析，通过比较来自不同会话的图像和连接持续性刺的图像进一步跟踪棘突。将脊柱添加和消除的速率计算为在给定成像会议上新添加或消除棘的数量，除以上一个成像疗程中该树突段的棘突总数。周转率代表脊柱添加和消除的总和。

　　树突状棘的荧光强度被用作脊柱大小的代理，因此为每个脊柱定义了三维ROI，即树突轴（4μm拉伸）与该脊柱和附近的背景区域相邻。为了比较成像会话之间的强度值，并说明了每日成像条件下的较小变化，在背景减法后，将脊柱信号强度标准化为相邻树突状轴的信号。通过首先减去基线值，然后在基线和各自的成像日值之和分开时，将每个脊柱值直接归一化为基线成像会话的平均值。这将脊柱尺寸变化-1和+1之间的变化值。对每个树突段进行了所有脊柱分析，平均每个基因型，并作为来自两个相邻成像会话的值（-3和-2和-2，-2，-1和-1和0、1和2，等等）的平均值，以提高清晰度。

　　为了分析脊柱聚类，与基线相比，棘突根据其平均大小的平均变化而归类为增加，减少或稳定。这些类别的阈值是根据对照小鼠的变异性设置的，并在基线±1 S.D处定义。大小变化（±0.14）。通过在每个树突段沿每个脊柱的最接近邻居来计算最近的邻居分析。只有在数据集中仅包含一个最接近的邻居对，如果它们的距离低于1.0μm（以避免重叠的ROI）或3.5μm以上，则将对排除。两种脊柱增加，沿相同方向或相反方向上的变化的最接近的脊柱对的分数被量化，以比较基因型之间的聚类程度。

　　为了测试聚类的统计显着性，在一个随机棘突池中进行了最接近的邻居分析，其中脊柱尺寸变化值沿每个树突中的所有脊柱位置随机洗牌。通过从10,000个随机脊柱配对池的直方图的尾部进行概括，其中最接近的骨分析导致脊柱对分数超过了实际观察到的值。

　　所有图形值均显示为平均值±s.e.m。补充表1列出了实验（所使用的统计测试，统计值，精确n值）的统计细节。每个实验中包含的动物数量是基于文献中建立的标准。使用GraphPad Prism进行统计。统计显着性定义为p <0.05。使用正态性和相等方差的测试来确定要使用的适当统计检验。所有报道的t检验均为两尾，当群体差异显着差异时，韦尔奇的纠正措施。对于超过两组的实验，使用了单向方差分析。对于具有多个变量的实验，使用了双向方差分析。对于从同一动物重复测量的实验，使用了双向重复测量方差分析。从至少三个独立重复的实验之一中选择了所有代表性图像，结果相似。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。