在美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）微生物组计划gnotobiotic Animal设施中饲养并维持无菌C57BL/6NTAC小鼠。C57BL/6 SPF小鼠购自Taconic。C57BL/10SGSNAI- [KO] UMT（µMT），C57BL/6- [TG] CD11C：EYFP（CD11C – YFP）和C57BL/6- [KO] CCR7（CCR7 - / - ）小鼠通过NIAID-TACONIC-TAConIC EXPLACT程序获得。IL21R - / - 小鼠由W. Leonard（NHLBI/NIH）提供，Bcl6floxcd4cre小鼠由P. schwartzberg（Niaid/NIH）提供，CD40LG - / - - 由J. Kovac（J. Kovac提供）（临床中心/NIH），LTA -lta -lta -laz提供了。（NCI/CCR/NIH），D。Kaplan（匹兹堡大学）提供了Hulang-DTR小鼠，而C. Mayer（NCI/NIH）提供了AICDA - / - 小鼠33。CD19CRE（JAX编号006785），PRDM1FLOX（JAX编号008100），FOXP3EGFP-CRE-ERT2（JAX NUMBER 016961），ROSA26TDTOMATO（JAX NUMBER 007909）和AID – GFP（JAX Number-GFP（Jax Number Number 018421）从Jackson中购买了。Bcl6-YFP小鼠由D. Dominguez-Sola（纽约市西奈山）提供。所有小鼠均在美国协会的无病原体条件下饲养和维持在NIAID的实验动物护理认可的动物设施的认证，并按照在实验动物的护理和使用指南（温度，+20至+24°C；湿度至湿度为30-70％; 30-70％; 30-70％; 30-70 h Light/10 H daunp of Bearty Ansive and hemide niaid and becret。所有实验均根据NIAID动物护理和使用委员会批准的动物研究建议（LHIM-3E）在NIAID上进行。每个实验使用了6至12周龄之间的性别和年龄匹配的小鼠。在可能的情况下，进行初步实验以确定样本量的要求，考虑可用的资源和道德，还原主义动物的使用。报告了不同实验组的每个小鼠（参见图传奇中的N）。预先确定了排除标准，例如由于技术问题而引起的染色不足或低细胞产量。将动物随机分配给实验组。实验在可能的情况下被视而不见。

　　对于具有细菌培养的TA，在600 nm（OD600Nm）的光密度下接种TSB，并用新鲜菌落制备的细菌悬浮液在37°C下孵育约7 h，直到OD600NM达到0.8。对于细菌的TA，使用无菌棉签在整个皮肤表面（大约36 cm2）放置2.5 mL细菌悬浮液（约109 cfus ml -1）的相关性。细菌悬浮液的应用每天重复四天。为了感染，将小鼠静脉内感染了104次或在皮内感染了106个表皮链球菌NIHLM087。通过使用传统的细菌学技术评估CFU，在静脉内感染后3天或在皮肤排除后5天，在肝脏和脾脏中枚举细菌。对于FTY720治疗，在整个实验过程中，每隔一天，每隔一天将小鼠注射1 mg kg -1的芬洛莫德（Sigma）（Sigma）。对照组接受假注射。对于LC耗竭，将Hulang-DTR小鼠注射1μg白喉毒素腹膜内腹膜内4天。对照组接受假注射。对于TAM诱导的标签，将FOXP3EGFP-CRE-ERT2雌鼠与Rosa26TdtdoMato雄性小鼠交叉，在8-10周时，将使用10 mg Tam（Sigma）溶解在玉米油中5天的5天。与TDTOMATO的Foxp3+ Treg标记在协会结束后至少持续了21天。

　　用氯胺酮和甲基嗪麻醉小鼠，并在腹部中间进行切口，将肌肉和其他组织放在一边，露出脾脏。然后将脾脏移除，并关闭切口。在实验开始之前，监测小鼠30天，以完全恢复。

　　切除耳朵，并分成腹侧和背面。将组织样品在含有55 µMβ-甲醇，20 µM HEPES（HYCLONE），0.25 mg ML-1释放酶纯化的酶混合物（rochediaiapnostic）和0.2 mg mg ml-1 dnase I（Sigma）和1.5 co2 co2 co2 co2 c的RPMI中消化。使用Medicon/Medimachine组织均质器系统（Becton Dickinson）将消化的皮肤表匀浆，并以500克旋转5分钟。收集耳塞的LN并通过70 µm的细胞滤网推动。在500克旋转5分钟后，将细胞颗粒用于测定。使用冷PBS冲洗骨髓并通过70μm的过滤器加工，并将细胞沉淀物在ACK（Thermofisher）裂解缓冲液中裂解在室温下5分钟。测定前，用PBS洗涤细胞两次。通过用无菌棉签在300 µL的PBS中用无菌棉签擦拭10 s，收集皮肤拭子10 s。将样品在3,000g下离心10分钟，并将所得的PBS溶液用于ELISA。

　　Single-cell suspensions were stained with LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit (Invitrogen) in PBS to exclude dead cells. For the detection of transcription factors, cells were stained using the FOXP3 staining set (ThermoFisher Scientific) according to the manufacturer’s protocol. For detection of Langerin expression, cells were fixed and permeabilized with BD Cytofix/Cytoperm and stained in BD Perm Wash buffer (BD Biosciences). Cells were stained with the following antibodies: hamster anti-mouse TCRβ–BUV737 (H57-597, BD Horizon, catalogue number 612821, 1:400), rat anti-mouse IFNγ–BV421 (XMG1.2, BD Horizon, catalogue number 563376, 1:100), rat anti-mouse IL-4–PE (11B11, BioLegend, catalogue number 504103, 1:100), rat anti-mouse CD4–BV711 (GK1.5, BD Horizon, catalogue number 563050, 1:400), rat anti-mouse CD4–BV510 (RM4-5, BD Horizon, catalogue number 563106, 1:500), rat anti-mouse CD4–BV650 (RM4-5, BD Horizon, catalogue number 563747, 1:400), rat anti-mouse CD62L–BV605 (MEL-14, BD Horizon, catalogue number 563252, 1:600), rat anti-mouse CD62L–PE (MEL-14, BioLegend, catalogue number 104407, 1:500), rat anti-mouse CD45–BUV396 (30-F11, BD Horizon, catalogue number 564279, 1:300), rat anti-mouse CD45–BV650 (30-F11, BD Horizon, catalogue number 563410, 1:300), rat anti-mouse CD45–APC (30-F11, eBioscience, catalogue number 17-0451-82, 1:400), rat anti-mouse CD45–BV510 (30-F11, BD Horizon, catalogue number 563891, 1:400), rat anti-mouse CD24–BUV396 (M1/69, BD OptiBuild, catalogue number 744471, 1:200), rat anti-mouse CD24–BV605 (M1/69, BD Horizon, catalogue number 563060, 1:200), mouse anti-BCL6–AF488 (K112-91, BD Pharmingen, catalogue number 561524, 1:100), rat anti-mouse CXCR5–AF647 (L138D7, BioLegend, catalogue number 145531, 1:100), hamster anti-mouse PD-1–BV711 (J43, BD OptiBuild, catalogue number 744547, 1:200), rat anti-mouse PD-1–BV605 (29F.1A12, BioLegend, catalogue number 135219, 1:200), rat anti-mouse/human Ki-67-PE–Cy7 (SolA15, eBioscience （热门科学），目录编号为25-5698-82，1：300），大鼠抗小鼠IGD – Percp – Percp – Cy5.5（11-26C.2A，Biolegend，Biolegend，目录号405709，1：800），Rat Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Antia1：600），大鼠抗小鼠IgG1 – Bv711（A85-1，BD地平线，目录号565786，1：200），大鼠抗小鼠IgG2B – FITC（R12-3，BD Pharmingen，Catalog Mumber，Catalog Number Nubm nubtHorizo​​n, catalogue number 562313, 1:400), rat anti-mouse B220–APC–Cy7 (RA3-6B2, BD Horizo​​n, catalogue number 552094, 1:400), rat anti-mouse CD19–BUV396 (1D3, BD Horizo​​n, catalogue number 563557, 1:300), rat anti-mouse CD19–BV785（6D5，Biolegend，目录编号115543，1：300），大鼠抗小鼠/人类GL-7 – EF450（GL-7，EBISOSCIENCE（THERMOFISHER SCICEBIFIC），目录编号48-5902-82，1：200），大鼠抗Mouse/Hust-Mouse/Human Hust-7 – Percp – bip-biog-biog-biog-biog-biog-biog-biog-74444444444。1:200), rat anti-mouse CD38–APC (90, BioLegend, catalogue number 102711, 1:300), hamster anti-mouse CD95–BV510 (Jo2, BD Horizo​​n, catalogue number 563646, 1:300), rat anti-mouse/hamster/human FOXP3–AF700 (FJK-16s, eBioscience (ThermoFisher Scientific),目录编号56-5773-82，1：100），大鼠抗小鼠FOXP3 – PERCP – CY5.5（R16-715，BD Pharmingen，目录号563902，1：100），大鼠抗小鼠MHCII – ANTI-MHCII – AF700（M5/114.15.2，EBIISCIESMICER（THERMIS-CATCAL-56）1：200），大鼠抗小鼠CD11B – FITC（M1/70，Ebioscience（Thermofisher Scientific），目录编号11-0112-82，1：200），仓鼠抗小鼠CD11C – PECY7（N418（N418（929f3.01，树枝状，目录编号DDX0362P-100，1：200），大鼠抗小鼠CD44 – BUV395（IM7，BD Optibuild，目录数740215，1：400），大鼠抗Mouse CD44 – PE – PE – cy7（Im7，im7，bd catal off catal catal of catal catal off catal catal catal off catal catal off catal catal off catal of catal off catal catal ogn ,，大鼠抗小鼠CD103 – BV510（M290，BD地平线，目录编号563087，1：200），鼠标抗小鼠/大鼠XCR1 – APC（Zet，Biolegend，Biolegend， 目录编号148205，1：200），大鼠抗小鼠F4/80 – APC – CY7（BM8，Biolegend，目录编号123117，1：200）和大鼠抗小鼠CD25 – Per-per-CP – Cy5.5（PC61.5（PC61.5）在FCBLOCK（Thermofisher），0.2 mg ML -1纯化的大鼠IgG和1 mg ML -1的正常小鼠血清（Jackson Immunoresearch）的情况下进行染色。在配备FACSDIVA软件（v9.0）的BD LSRFortessA细胞分析仪（BD Biosciences）上获取细胞，并使用FlowJo软件（v10.8.2）进行了分析。

　　对于耳朵真皮，用镊子将耳朵针扎在1％多聚甲醛溶液（电子显微镜科学）中，在4°C下固定，并在1％BSA中阻塞，在1％BSA中，0.25％Triton X阻止缓冲液在室温下固定2小时。对于LN切片，收集LN并将其固定在10 mg ml -1多聚甲醛中24小时。在磷酸盐缓冲液中洗涤样品，并在30％蔗糖磷酸盐缓冲液中脱水，该缓冲液安装在O.C.T.中。化合物（Fisher）和在干冰上捕捉冻干。切入冷冻仪上的厚度为11 µm的切片。将切片在磷酸盐缓冲液中洗涤，并在1％BSA中阻塞，在室温下封闭0.25％Triton X阻止缓冲液30分钟。在用抗体的阻止缓冲液中，将组织染色过夜：大鼠抗小鼠CD19 – APC（1D3，BD Pharmingen，目录数量561738，1：200），大鼠抗小鼠CD49F – EF450（EBIIOGOH3，EBIIOGOH3，EBISCIENCE（EBIOSCIENT）（ebioscience）反小鼠CD45-AF700（30-F11，Ebioscience（Thermofisher Scientific），目录编号56-0451-82，1：200），大鼠抗小鼠CD4 – EF570（RM4-5，RM4-5，Ebiososcience（Thermofisher Scientific），Catalog Scientific），编号为41-0042-82-82-82，1.200），速度为：Ebioscience（热科学），目录编号56-0041-82，1：200），大鼠抗小鼠CD35 – BV510（8c12，bd optibuild，目录数740132，1：500），大鼠抗小鼠CXCR5 – ASCCR5 – FAF647（100）anti-mouse PD-1–BV421 (J43, BD Horizo​​n, catalogue number 562584, 1:200), rat anti-mouse HEV–AF488 (MECA-79, eBioscience, catalogue number 53-6036-82, 1:200), rat anti-mouse LYVE-1–eF615 (ALY7, eBioscience, catalogue number42-0443-82，1：200），大鼠抗小鼠CXCL13 – APC（DS8CX13，EBISOSCIENCE，目录编号17-7981-82，1：200），大鼠抗小鼠IgG2B-FITC（R12-3，R12-3，R12-3，R12-3，R12-3，BD Pharmingen，Catalog Number number 55555555555555，100）IGD – PE（11-26C.2A，BD Pharmingen，目录编号558597，1：600），大鼠抗小鼠B220-EF615（RA3-6B2（RA3-6B2） 目录编号42-0452-82，1：400），大鼠抗小鼠Langerin（CD207）–AF488（929F3.01，Dendritics，目录号DDX0362A488-100，1：200）。用PBS洗涤3次后，将组织用延长的金（分子探针）抗叶试剂安装。在配备LAS X软件的Leica TCS SP8共聚焦显微镜上捕获了耳角和LN部分图像。使用Imaris Bitplane软件（V10.0）分析图像。

　　对于ELISA，将小鼠在安乐化时流血，并在平底96孔Maxisorp微滴定板（NUNC）中分别分析血清和耳朵拭子样品。将孔与PBS中的热杀死的细菌培养物涂在4°C下的PBS中过夜。将板在PBS中洗涤，并用PBS中的0.1％牛血清白蛋白（BSA）封闭，然后将样品在PBS中的0.1％BSA中串行稀释，并将等分试样添加到相应的子孔中。将板保持在4°C过夜，然后在PBS洗涤后，将板与碱性磷酸酶（AP）偶联的同种型山羊抗体抗体（SouthernBiotech）孵育：1040-04，1：1,000），山羊抗小鼠IGM – AP（目录编号1021-04，1：1,000），山羊抗小鼠IgG – AP（目录号1036-04，1：1,000），山羊反小鼠IgG2B – AP（山羊IgG2B – AP（目录）（目录号1079-04，1：1,000），山羊抗小鼠IgG3 – AP（目录号1100-04，1：1,000），山羊抗小鼠IGE – AP（目录编号1110-04，1：1,000）。洗涤板，并将磷酸酶底物P-硝基苯基磷酸酶（Sigma-Aldrich）添加到每个孔中。使用BioTek Synergy H1微板读取器在405 nm处读取该反应，并提供了Gen5 3.14软件。抗体滴度被定义为样品的插值稀释液，从而在背景上方0.4的曲线线性部分上产生吸光度。对于ELISPOT测定，ELISPOT 96孔板（Multiscreen HTS，Millipore）用PBS中的热杀性链球菌培养（10μgml-1）涂覆。在PBS中用0.1％BSA阻塞后，将重复的孔与股骨骨髓或皮肤的单核细胞一起孵育。将细胞在37°C和5％CO2下孵育5小时。在用0.05％Tween 20中彻底洗涤细胞后， 加入每孔100μL的AP偶联山羊抗小鼠抗体（Southernbiotech）。通过在每10毫升去离子水（Sigma-Aldrich）中添加50μl的Sigmafast BCIP/NBT B5655 1片剂，可以看到标记单抗体产生细胞的结合抗体。使用具有CTL总机分析仪（CTL）2.6.1的免疫孔分析仪（CTL）对斑点形成细胞进行计数。

　　将细胞从皮肤中分离出来。用表面标记在冰上染色后，以区分B细胞和CD4+ T细胞以及总SEQC主题标签抗体（Biolegend）以独特地标记每个样品，以使用85-multe noss umples对Facsaria Fusion Cellter（BD Biosciences）在Facsaria Fusion Cell sorter（BD Biosciences）上与标记的抗体进行标记并分类。将所有样品合并在一起，并将细胞加载在铬芯片上（10倍基因组学）。总共为1车道的B细胞加载了15,000个细胞，而对于T细胞，每条车道加载了30,000个细胞，总计4个泳道。然后按照制造商的说明，使用铬单细胞5'试剂盒制备基因表达，标记和BCR或TCR的库。在NextSeq 1000（用于T细胞）和NextSeq 2000（对于B细胞）平台（Illumina）上对库进行了测序。使用BCL-Output命令v3.10.5将Illumina文件转换为FASTQ文件，并通过使用Cell Ranger V7.1.0（10x genomics）（10x）（10x genomic）（10x）（10x genomics）（https://cf.10xgenomics.com/sup/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/celp/refdata-gex-2020-2020-a.tar.gz）。

　　四个T细胞mRNA文库的整体测序质量很高，条形码和独特的分子标识符（UMI）区域的碱基> 30质量得分或更高，RNA读数中> 89％的碱基的碱基具有Q30或以上。此外，中位基因计数范围为1,364-1,500，测序饱和度> 71％，约70％的读数自信地映射到转录组。在4个样本中，每个单元的平均读数约为30,000。对于四个TCR文库，具有生产性V – J跨度（TRA，TRB）对的细胞百分比> 80％，并且每个细胞的平均读数为18,000。对于四个HTO库，每个单元格的平均读数为1,600至2,500，> 93％的有效条形码。

　　在对表达数据的下游分析中，使用createSeeRatObject函数将CellRanger输出（Filtered_feature_bc_matrix）加载到seurat（v5.0.2）61中，该功能保留了至少3个细胞中检测到的基因，至少每个细胞检测到每个细胞（min.cells = 3 and.cells = 3和min.features = 200）。保留了200-3,000个RNA，不到5％的线粒体RNA和少于10,000个RNA读数的细胞进行进一步分析。使用两步过程对主题库进行了反复列表。首先，使用Seurat的Htodemux将一个来自一个组织的所有主题标签组合在一起并消除。对于更详细的示例视图，使用Multiseqdemux62对每个主题标签进行了数据反复编译。然后，通过使用17个PC来处理数据，并通过两步过程来删除代表污染物的离群群集，用于群集识别的0.8分辨率。在第一步中，将离群簇7和13滤波出来，而第二步导致删除离群群集18。然后使用默认参数在SEURAT簇之间使用差异表达的基因手动对其余簇进行手动注释。使用Scretoire v.2.0.0（参考文献63）处理TCR数据，利用氨基酸（CDR3）clonotype定义，并将其添加到seurat对象中。从seurat对象中提取每个群集和每个组织的克隆型丰度，并使用圆形（v.0.4.15）软件包可视化皮肤中的簇之间的clonotype重叠64。单个序列绘制在Circos图上（用轴数表示）。对于每个群集，序列是通过clonotypes组织的，并且通过其丰度值排序clonotypes。Circos图中的每个链接都代表一个clonotype，它在两个链接的簇中都出现，其链接在每一端的宽度代表该群集中的clonotype丰度。对于组织之间的重叠分析， 为每只小鼠计算了在脾脏，LNS或两者中检测到的皮肤中检测到的TCR的百分比。

　　B细胞mRNA库的总体测序质量较高，条形码> 94％的碱基，UMI区域的Q30质量得分或更高，而RNA读取中的碱基> 94％的碱基为Q30或更高。此外，中位基因计数范围为946，测序饱和度> 42％，约有81％的读数自信地映射到转录组。每个单元的平均读数大约为23,000。对于HTO库，每个单元格的平均读数为428，> 97％的有效条形码。

　　在对B单元表达数据的下游分析中，使用CreateSeeRatObject使用createSeEratObject将其保留在至少100个细胞中检测到的基因，将至少200个类别检测到的基因= 100 = 100 = 100。为了滤除低质量的单元，我们使用了R包装Scuttle（v1.4.0）的ISOUTLISL功能，NMAD（中值绝对偏差的中位数）为4的最高允许的线粒体含量（百分比）（百分比）和3和2.5的最高基因和最高基因和最高基因和UMI Counts（Nfeature_rna和nc），均为4和2.5。使用归一化函数进行了RNA计数数据和HTO计数数据的中心对数比率转换的对数正态化（对数正态分）。对于HTO将细胞倒入TSB和TA治疗组并去除任何其他双重动物，HtoDemux的正常量= 0.99，而find Integrationanchors，IntegratedAta，RunPCA，Runumap和Findneighbors的功能则具有前20位。Seurat的FindClusters功能用于将细胞与默认的Louvain聚类设置和0.8分辨率聚集。使用默认参数在Seurat簇之间使用差异表达的基因手动注释簇。

　　使用Irepertoire提供的IR-RepSEQ+服务进行了研究样品中自适应组的高通量测序。为12个样品中的每个样品生成了下一代测序库，重复，涵盖了BCR重链，并具有IgM，IgM，IgD，IgE，IgA，IgA，IgG1，IgG1，IgG2，IgG2A，IgG2A，IgG2B和IgG2B和IgG2B和IgG2B和IgG2C）和IgG3子型的覆盖范围和区别。这项技术促进了BCR重链的放大，同时解决了Airr-Seq Analysess65中已知的错误来源。测序方案涉及每种V – D – J组合的底漆对的初始利用，从而可以使用标签进行扩展，以随后进行重链的全局扩增。这种扩增过程是在单个测定中进行的，在逆转录步骤中结合了UMIS，以区分单个RNA分子，并最大程度地减少PCR重复和测序误差的影响。

　　使用Qiagen onestep RT-PCR混合物进行逆转录，然后选择第一链cDNA，并使用Spriselect珠选择（Beckman Coulter）去除残留的引物。随后，使用V基因底漆混合物进行第二轮结合和延伸，并使用Spriselect珠子纯化第一和第二链合成产物。使用特定于在初始合成步骤中使用的C和V引物的5'端的公共位点的引物来实现库放大。最终构造的库包括Illumina Dual指数测序适配器，10核苷酸UMI和与C基因引物相关的8-核苷酸内部条形码。放大的库是多重的，并在IREPERTOIRE的一个P1 600周期套件（300个成对的末端读取）上进行了汇总，以在Illumina NextSeq 1000平台上进行测序。所得的免疫受体序列数据通过恒定区域（包括CDR3高变量区域）覆盖了第二个框架区域。使用IRMAP v3.0软件66,67,68分析了原始数据。简而言之，根据Illumina双重指标和条形码序列对测序的读取进行了反复的曲线。合并的读取使用IMGT参考库（https://www.imgt.org）映射到种系V，D，J和C参考序列。通过映射结果定义的CDR3区域被转化为氨基酸。然后通过组合UMIS和CDR3区域来凝结数据集，以删除通过测序和扩增引入的不正确的CDR3。将CDR3和UMI组合相同的读数缩合为一个UMI计数。

　　为了在组织和D50计算之间进行BCR克隆型重叠分析，将clonotypes定义为独特的CDR3氨基酸序列和特定的重链V段的组合。对于突变的BCR重叠分析，将clonotypes定义为独特的CDR3氨基酸序列，特定的重链V段和特定数量的突变（在整个V段中，“ V_Missismatches”）的组合。对于组织之间的重叠分析，计算了每只小鼠在脾，LN或两者中检测到的皮肤中BCR的百分比，同时也被检测到。D50多样性指数计算为唯一的clonotypes的百分比（按降序的丰度订购），占BCR总量总量的一半。

　　使用GraphPad Prism9进行统计分析。没有使用统计方法来确定样本量。数据表示为平均值±S.E.M.如每个人物传说中所述，使用Dunnett的单向或双向方差分析，或Tukey的多重比较测试或Tukey的多重比较测试或两尾未配对的t检验或两尾的Mann-Whitney Test。使用Prism（V9）绘制所有图形，并使用Adobe Illustrator（V28.0）或MS PowerPoint（V16.79.1）进行编辑。对于抗体滴度，对对数转换数据进行了统计分析。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。