编码人PTH1R的质粒（GenBank标识符：U17418.1;残基27-491）被构造并纯化，如先前报道的17。该构建体使用BACMAM系统（Thermo Fisher Scientific）在HEK293 GNTI（N-乙酰葡萄糖氨基转移酶I阴性）（美国型培养物收藏，CRL-3022）中表达，并且在Freestyle 293 Medium（GibCo）中生长并维持细胞在37°C下，并在37°C条件下生长和维持在8％CO2中，并在8％CO2下进行。请注意，这些细胞是由SF9细胞（生命技术）中产生的杆状病毒感染的，并补充了10 mM丁酸钠，以增强18小时后的蛋白质表达，并在30°C下在悬浮液中再培养48小时。通过离心（5,000g，10分钟，4°C）收集培养的细胞，并在低渗性裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5、150 mM NaCl和20％甘油）中被超声处理。通过离心（10,000g，10分钟，4°C）去除细胞碎片。通过以180,000g的超离心为1 h收集膜级分，并在溶解度缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 9.0，200 mm NaCl，1％LMNG，0.1％CHS，20％甘油，20％甘油和100μmPCO371）中溶解。通过以180,000g的超速离心将溶解的受体与不溶性材料分离20分钟，并与Ni-NTA树脂（Qiagen）孵育30分钟。用20列的洗涤液（20 mM Tris-HCl，pH 9.0，500 mm NaCl，0.03％GDN，10％甘油，100μMPCO371和30 mm咪唑）用洗涤胶束取代洗涤剂胶束。在洗脱缓冲液中洗脱受体（20 mM Tris-HCl，pH 9.0，500 mM NaCl，0.01％GDN，10％甘油，100μMPCO371和300 mM咪唑）。用TEV蛋白酶处理洗脱株，以裂解GFP-HIS10标签并针对透析缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 9.0，500 mm NaCl，100μMPCO371和10％甘油）进行透析（20 mM Tris-HCl，pH 9.0，500 mm）。用Ni-NTA树脂切除了切割的GFP-HIS10标签和TEV蛋白酶。通过在SuperDex 200 10/300增加柱上的尺寸排斥色谱法纯化受体，在SEC缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 9.0，150 mm NaCl，0.01％GDN和100μMPCO371）中平衡。收集峰分数并浓缩到约5 mg mL – 1。

　　如先前报道的34，构建并纯化了编码迷你GS的质粒。迷你GS在大肠杆菌（BL21）细胞中表达。将这些细胞培养在补充有1 mM异丙基-β-硫代乙型吡喃糖苷（IPTG）的LB培养基中。20小时后，通过超声波缓冲液（20 mM TRIS-HCl，pH 7.5、150 mM NaCl，2 mM MGCL2和1μMGDP）中的超声处理破坏细胞，而Mini-GS蛋白被Ni-NTA亲和力纯化，然后由Ni-NTA亲和力纯化，然后由Size-Exclusion Chromatection in Ni-NTA亲和力纯化。

　　还构建，表达和纯化了HIS6-TAG融合的大鼠Gβ1和牛Gγ2，如先前报道的17。在SF900 II培养基（Gibco）中，在27°C下，在SF900 II培养基（GIBCO）中生长至每毫升4×106细胞的细胞密度。通过离心收集细胞，并在低渗性缓冲液中裂解。通过Ni-NTA亲和色谱法纯化Gβ1-Gγ2异二聚体，然后在HILOAD SUPERDEX75 16/600列上进行尺寸排斥色谱法。

　　将纯化的Mini-GS和Gβ1-Gγ2混合并在冰上孵育过夜。将混合物浓缩并加载到SuperDex 75 10/300上增加尺寸 - 排斥柱，并在缓冲液中平衡（20 mm Tris-HCl，pH 7.5，150 mm NaCl和1μMGDP）。合并含有迷你GS异三聚体的峰分数并浓缩至5 mg ML – 1。

　　如先前报道的17,35，编码NB35的质粒编码。该蛋白在在25°C的1 mM IPTG中培养的LB培养基中培养的LB培养基中培养的LB培养基中表达蛋白质。20小时后，通过超声波缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5、150 mM NaCl和2 mM MGCL2）中的超声处理收集并破坏细胞，并且NB35蛋白通过Ni-NTA亲和力色谱纯化，然后在HiloAd SupereDex75 16/6/6/6/6/6/6/6/6/16/6/16/6/16/6/16/6/16/16/16/16/16/16/16/16/16/16/汇总峰分数并浓缩至3 mg ML – 1。

　　PCO371在Chugai Pharmaceutical合成，其纯度和稳定性通过液相色谱 - 质谱法证实。将纯化的PCO371结合的PTH1R蛋白与Mini-GSβ1γ2的1.2倍过量的摩尔混合和1.5倍的NB35混合，并将混合物在冰上孵育，以在pH 9.0中过夜。使用Ni-NTA亲和力树脂纯化样品，并加载到SuperDex 200 10/300增加尺寸-Exclusion色谱柱上，在缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 9.0，150 mm NaCl，0.01％GDN，0.01％GDN和100μmPCO371）中平衡，以将复合物与观点分开。PCO371 – PTH1R-MINI-GS异三聚体– NB35复合物的峰值分数合并并浓缩至7 mg ML – 1。

　　将纯化的复合物应用于新鲜发光的量化量子碳网格（R1.2/1.3，AU，300网格），使用100％湿度的4°C下的Vitrobot Mark IV IV。将制备的网格转移到泰坦KRIOS G4显微镜（Thermo Fisher Scientific），该显微镜在300 kV的加速电压下，使用Gatan量子量子LS能量滤波器（GIF）和纳米螺旋罗杆EFTEM模式的Gatan Quantum-LS Energy Filter（GIF）和Gatan K3 Summit Direct Electron检测器。图像以105 K的名义放大倍数收集，对应于每个像素（日本东京大学）校准的像素大小为0.83Å。使用串行EM（v.3.7.4）软件获得数据集，散焦范围为-0.8至-1.6μm。将每个图像剂量分级为72帧，剂量速率为7.5 e-1 s-1 s-1，以积累54.578 E-Å-2的总剂量。使用RISION-3（参考文献36）对6,333次剂量分级的电影进行梁诱导的运动校正，并使用CTFFIND4（参考文献37）估算了造影剂转移函数和Defocus参数。最初，使用raplacian的laplacian拾取功能从Relion-3中挑选了4,880,293个颗粒，并从6,333个显微照片中挑选，并以每个像素为3.63Å。这些粒子进行了几轮2D和3D分类。最好的类包含109,422个颗粒，然后以每个像素的像素大小为1.11Å，然后进行3D细化。均匀的子集对每颗颗粒的散焦细化，横梁倾斜精致，贝叶斯抛光和3D细化进行。根据傅立叶壳相关性= 0.143标准，最终的3D细化和后处理产生了2.9Å的全局分辨率。在扩展数据中描述了处理策略图2。

　　PTH1R – GS – NB35复合物的初始模板源自PTH – PTH1R – GS – NB35结构（PDB标识符：7VVL），然后使用COOT-0.9.9.3 EL38进行大量重塑。PCO371 – PTH1R-GS的模型使用COOT手动调整，并使用Phenix.Real_Space_refine（V.1.1.14-3260）39 RefMac540和ServalCat41对工作图进行了精制，并在Molprobity42中进行了验证。

　　该系统包括PTH1R，PCO371，1-磷酸-2-烯酰磷脂酰胆碱（POPC），TIP3P水和150 mM NaCl。使用Modeller（V.10.1）43创建了含有氨基酸27-491的PTH1R的初始模型，PTH1R的冷冻结构与PCO371作为模板。缺失的氢原子是使用程序VMD（v.1.9.3）44构建的。使用MEMPROTMD Pipeline45将蛋白质嵌入POPC膜中。通过添加150 mM NaCl，将模拟系统的净电荷中和。模拟系统为96×96×180Å3，包含123,567个原子。来自CHARMM36力场的分子拓扑和参数用于蛋白质，脂质和水分子。使用Charmm-GUI配体读取器和Modeller47,48制备了PCO371的分子拓扑结构和参数。

　　用程序NAMD（v.2.13）进行了分子动力学模拟。将模拟系统的能量最小化1,000步，具有固定位置的非氢原子。最小化后，除非蛋白质5.0Å以外的脂质分子，又，用10 kcal mol-1的约束进行了另外1,000步的能量最小化。接下来，在NVT条件下进行0.1 ns进行平衡，对蛋白质的重原子进行10 kcal mol -1Å -2的约束。最后，在NPT条件下对2.0 ns进行平衡，对于蛋白质的所有Cα原子，具有1.0 kcal mol -1Å -2的约束。使用langevin动力学在310 K保持恒定温度的同时，使用Nosé -Hoover -Hoover langevin Piston49,50进行生产运行，同时在310 K下保持恒定温度。使用粒子网埃瓦尔德方法50计算远程静电相互作用。模拟进行了三次。使用MDTRAJ（V.1.9.8）51，Seaborn（https：//zenodo.org/record/54844）和Cuemol（v.2.2.2.3.443）（http://wwwwww.cuemol.org）对模拟结果进行了分析和可视化。

　　使用Glosensor CAMP积累测定法测量了PTH1R诱导的GS激活。我们首先构建了一个质粒，其中人类的全长PTH1R基因与前面的血凝素衍生的信号序列N终端融合到FLAG表位标签中。将HEK293A细胞以每毫升的2×105细胞的浓度为6 cm培养皿中（每孔4 ml（nissui Pharmaceutical）补充了10％FBS（Sigma，f7524，lot 0001641439）和青霉素 - 链霉素 - glutrutamine – dedmememine – Complete dymememine degnememine – ded demememine thed demememine fbs（Nissui Pharmaceutical）。The transfection solution was prepared by combining 10 μl (per well hereafter) of 1 mg ml–1 polyethylenimine MAX (Polysciences) solution and a plasmid mixture consisting of 1,000 ng Glo-22F cAMP biosensor (human codon-optimized and gene-synthesized)-encoding pCAGGS plasmids and 400 ng Flag–PTH1R plasmids in400 µL Opti-MEM（热泡科学）。孵育24小时后，使用含0.53 mM EDTA的Dulbecco的PBS（D-PBS）收集转染的细胞，离心并悬浮在2 mL的HBSS中，其中包含0.01％BSA（脂肪含量无酸的级别; Serva; Serva; Serva; Serva; Serva）和5 mm Hepes（ph 7.4）（ph 7.4）（ASSAY）（ASSAY）（ASSAY）。将细胞悬浮液以每孔40μl的体积分配到白色的96孔板中，并在测定缓冲液中稀释的10μL-酸脂蛋白钾溶液（Fujifilm Wako Pure Chemical）。在室温下孵育2小时后，测量板的基线发光（配备了2pmt的Spectramax L，分子设备； SoftMax Pro（v.7.03），分子设备）和20μL的6×6×配体在分析缓冲液或单独添加了测定缓冲液（车辆）中是手动添加的。在室温下读取板，读取20分钟，间隔为30 s。将配体加入后8-10分钟的发光计数平均并标准化为初始计数，并且在车辆处理中信号的折叠变化进一步归一化为福斯科林（10 µm） 并绘制了营地积累响应。使用Prism 9软件（GraphPad），使用非线性回归将响应拟合到所有数据。使用了小于2的绝对值的山坡约束的Prism 9工具中的可变斜率（四个参数）。PEC50和EMAX值是从平均数据的非线性回归曲线中获得的。为了进行多次比较分析，使用单向或双向方差分析，然后使用Dunnett的测试。

　　使用纳米β-β-arrestin-recruitment Assay52测量β-arrestin对PTH1R的募集。简而言之，在6厘米培养皿中进行质粒转染，其混合物为200 ng n末端大的位熔合β-arrestin 1（LG-β-arrestin 1）或LG-β-arrestin 2和1,000 ng c- c-terminal c-c-terminal c-t端子小比位融合PTH1R（PTH1R-SM）质粒。孵育24小时后，使用含0.53 mM EDTA的D-PBS收集转染的细胞，以190g离心5分钟，并悬浮在4 mL的GloSensor分析的测定缓冲液中。将细胞悬浮液以每孔的80μl（以下96孔板）的体积分配到白色的96孔板中，并用20μL的甘油嗪（Carbosynth）加载在测定缓冲液中。在室温下孵育2小时后，测量板的基线发光（Spectramax L配备了2pmt，分子设备； SoftMax Pro（v.7.03），分子设备）和20μL的6×6×配体在分析缓冲液或车辆中稀释的6倍配体。在室温下以40 s的间隔读取板15分钟。将配体添加后的13到15分钟的发光计数平均并标准化为初始计数。使用与GloSensor分析所述相同的步骤对所有数据拟合了响应。

　　使用先前描述的流式细胞仪方法17测量PTH1R的细胞表面表达。简而言之，将HEK293A细胞在转染前1天以每毫升2×105细胞的浓度为6孔培养板中。使用与GloSensor分析所述相同的步骤进行转染。转染后一天，通过添加100μl的0.53 mM EDTA D-PBS，然后将100μl的5 mM HEPE（pH 7.4）收集细胞。将细胞悬浮液转移到96孔V底板中，并用抗flag表位（Dykdddk）标记单克隆抗体（克隆1E6，Fujifilm Wako Wako Pure Chemicals;10μgMl– 1稀释在2％Goat Serum and 2 MMMM Edta-gotta-goatsing d-gotta d-gonat d-gont-gont-aT d-gonating d-gont-t-gonating d-gonating d-gont，IgG（H+L）与Alexa Fluor 488（1：200）相结合的二级抗体（热泡科学，10μgML– 1在用D-PBS洗涤后稀释）。（EC800配备了488 nm激光，索尼）在FL1通道中记录了来自Alexa Fluor 488的荧光信号，并使用FlowJo 10软件（FlowJo）分析了流式细胞仪数据（FlowJo）。样品用于分析。

　　使用500 ng mvenus –β-arrest蛋白2和200 ng flag – pth1r质粒的混合物进行转染（在6厘米盘中的每孔）进行转染。孵育1天后，将转染的细胞收集并在35毫米的胶原蛋白涂层玻璃底盘（Matsunami）上恢复。1天后，将培养基更改为没有酚红和FBS（饥饿缓冲液）的DMEM。孵育1小时后，将细胞与Alexa-647标记（1：2,000）的FLAG-M1抗体孵育1小时，在饥饿缓冲液中洗一次并放在共聚焦显微镜上。使用配备有×100/1.46 alpha-Plan-Apochromat油型透镜和ImmersoltM 518F/37°C（4444970-9010-000-000-000，Zeiss）的LSM880使用LSM880进行活细胞成像。在活细胞成像过程中，将盘子安装在一个腔室（STXG-WSKMX-SET，Tokai Hit）中，以将孵育条件保持在37°C和5％CO2下。我们使用以下设置拍摄了双色延时图像：时间间隔为5分钟；总时间为35分钟。在时间点1到2之间添加了0.01％BSA-HBS中的200 µL配体溶液。使用Zeiss Zen 2.3 SP1 FP3（Black，64位）（V.14.0.21.201）处理了收录的串行图像。使用斐济（V.2.0.0.0-RC-69/1.52p）进行共定位分析。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。