为了实现结构测定，将ADGRD1中GPS之前的NTF（残基M1-L544）和C末端残基S828-V874截断。对于ADGRF1，除去了增益域之前的N末端区域（残基M1 – R250）和柔性C末端（残基Q861 – E910）。为了产生缺乏蛋白水解的ADGRF1，在截短受体的GPS基序中引入了两个突变，H565a和T567a。人ADGRD1的密码子优化基因（UNIPROT编号：Q6QNK2-1；残基T545 – T827）和ADGRF1（Uniprot编号：Q5T601-1；残基V251 – K860）与修改后的PFASTBAC1 Vector（Invitrien at ing thaig）一起，将其置于pfastbac1 vector（potect）中。终点。为了促进表达和纯化，将FLAG表位标签和双链标签添加到ADGRD1的C末端，而对于ADGRF1，将FLAG和链球链球链球标签添加到受体的N和C末端。为了提高蛋白质产量和稳定性，使用缺乏α-螺旋结构域的缩短Gα亚基（Minigα）21的异三聚体G蛋白用于与ADGRD1和ADGRF1形成复合物。通过引入多个突变（Minigαs，g49d，e50n，a249d，s252d，s272d，i372a和v375i;minigαi;minigαi，g42d，g42d，g42d，g42d，e43n，e43n，e43n，g217d，g217d，g217d，a217d，a219a，a219a，a219a，a219a q，通过引入几种突变（Minigαs，g49d，e50n，a249d，s252d，s252d，i372d，i372a and a249d，a249d），产生显性阴性的微型α亚基。为了进一步提高异三聚体G蛋白复合物的稳定性38。将Minigαs和MinigαI的基因克隆到PfastBac1载体中，其标签为6倍，增加了N末端。用N端6×His TAG和Gγ2的人Gβ1的基因被亚克隆到PfastBac双载体（Invitrogen）中。通过使用位置定向的诱变PCR产生了用于结构和功能研究的所有突变体。

　　通过在高五个昆虫细胞中共表达受体Minigα和Gβ1γ2（Invitrogen），获得了G蛋白结合的ADGRD1和ADGRF1复合物。通常对细胞进行支原体污染测试。使用BAC-BAC杆状病毒表达系统（Invitrogen）产生高滴定重组病毒库存，并用于以1.5×106细胞的密度转染昆虫细胞，感染比为1：1：1：1：1：1：1：1：1。收集前，将转染的细胞进一步在27°C下进一步培养48小时。

　　通过离心收集表达ADGRD1 –或ADGRF1-G蛋白复合物的细胞，并悬浮在含有20 mM HEPE的缓冲液中，pH 7.5、50 mM NaCl，2 mM MMGCL2和2 mM MM MGCL2和EDTA无蛋白酶蛋白酶抑制剂抑制剂鸡尾酒片（ROCHE）使用DonES HAMEGONITION。悬浮的膜溶液补充25 mu ML – 1 apyrase，并在室温下孵育2小时。通过以20,000克离心30分钟收集膜颗粒。然后通过与含有20 mM HEPE的溶解度缓冲液（pH 7.5，150 mm NaCl，2 mM MGCL2，2.5％（w/v）Lauryl Maltose Neopentyl甘氨酸（LMNG，Anatrace）和0.05％（W/v）Cholester（W/V）Cholester（W/V）Cholesteration（W/v）ChoLester（W/V），从膜上提取复杂蛋白。在4°C下2小时。通过以30,000克离心30分钟收集上清液，并与链球菌 - tactin XT Sepharose树脂（IBA Lifesciences）在4°C中孵育。对于ADGRD1 -MINIGS和ADGRF1 -MINIGS复合物，在此孵育过程的开头增加了1.5摩尔过量的纳米型35（NB35；有关表达和纯化的方案），以提高复杂的稳定性。

　　通过在800克离心5分钟通过离心收集树脂，并用20毫米HEPES的4柱体积，pH 7.5，150 mm NaCl，2 mM MGCL2，0.01％（w/v）LMNG和0.001％（w/v）（w/v）CHS，以降低LMNG浓度。通过将树脂与20 mM HEPES，pH 7.5、150 mM NaCl，2 mM MGCL2和0.25％（w/v）糖 - 脱子蛋白（GDN，Anatrace，Anatrace）在4°C下孵育2小时，从而进行洗涤剂交换。然后将树脂用20毫米HEPES，pH 7.5、150 mm NaCl，2 mM MGCL2和0.01％（w/v）GDN洗涤10柱体积。将复合蛋白用200 mM Tris-HCl的5列体积洗脱，pH 8.0、150 mM NaCl，2 mM MGCL2、0.01％（w/v）GDN和50 mM Biotin，并在4°C下与Ni-NTA树脂（Clontech）进一步孵育1小时。收集树脂并用10毫米HEPES，pH 7.5、150 mm NaCl，2 mM MGCL2和0.01％（w/v）GDN的10柱体积洗涤。然后，使用补充300 mM咪唑的相同缓冲液洗脱复杂的蛋白质，并使用SuperDex 200增加10/300 GL色谱柱（GE Healthcare），并用20 mM HEPES，pH 7.5，150 mm Nacl，2 mm mgcl2和0.01％（w/v）gdn（w/v）。使用100 kDa分子量截止浓度浓度（Millipore）汇总并将复合部分浓缩至3 mg ML – 1。使用SDS -PAGE和分析SEC分析蛋白质的纯度和同质性。

　　NB35被表达并纯化，如先前所述26。简而言之，将6×His标记的NB35基因克隆到PET28A载体中，并在大肠杆菌染色BL21（DE3）中表达。将细胞培养在37°C下补充有50μgml -1 kanamycin的LB培养基中，直到达到0.6的600 nm（OD600 nm）的光密度。添加1 mM IPTG后，将培养物在16°C下生长12小时。通过以4,000克离心30分钟收集细胞颗粒，然后通过超声处理以10 mM HEPE，pH 7.5和100 mM NaCl裂解。通过以30,000g离心分离上清液30分钟，并在4°C下与Ni-NTA树脂一起孵育1小时。然后将树脂用10毫米HEPES，pH 7.5、100毫米NaCl和30毫米咪唑的20柱体积洗涤。将NB35蛋白用10毫米HEPES，pH 7.5、100 mM NaCl和300 mM咪唑的10列体积洗脱，并使用SEPEX 75 10/300 GL柱（GE Healthcare）通过SEC进一步纯化，预启用了10 mm HEPES，pH 7.5 HEPES，pH 7.5和100 mM NACL。将峰分数合并在一起，并浓缩至3 mg ML – 1。最终的NB35样品补充了10％甘油，并将其储存在–80°C下，直到使用为止。

　　通过负染色电子显微镜证实了ADGRD1 –和ADGRF1 -G蛋白复合物的形成，并通过200 kV talos arctica arctica g2电子显微镜（FEI）评估样品质量。为了进行数据获取，将3μl纯化的复合样品应用于获得的发光300英寸金网格（Cryomatrix M024-AU300-R12/13），然后通过使用Vitrobot Mark IV（Thereo Fishericixic和1.5 s Blot clot clot clot）和1.5 s Blot clot clot clot和1.5 s Blot clot clot clot clot和1.5 s blot clot clot clot，然后通过液体氮气中的液体乙烷中的液体乙烷在液体乙烷中进行效率进行玻璃化。通过使用300 kV Titan Krios G3电子显微镜（FEI）选择了准备充分的网格进行数据采集，该网格以81,000倍的名义放大倍数，配备了K3 Summit Direct电子检测器（GATAN）和GIF-Quytum LS Imaging Enermation Filter，其缝隙宽度为20 ev。通过Serialem39捕获图像，物理像素大小为1.071Å，散热器范围从–0.8μm到–1.5μm。每个图像堆栈总共包含40帧，总计3 s，每帧暴露0.075 s，总剂量为70个电子。

　　通过MotionCOR240对ADGRD1 –和ADGRF1-G蛋白复合物的图像堆栈进行梁诱导的运动校正。每个图像的对比传递函数（CTF）参数由GCTF V.1.1841确定。通过无模板的自动选择3.142提取粒子的投影。使用RISION 3.1进行了二维（2D）分类，三维（3D）分类，3D自动抛光，贝叶斯抛光和CTF细化。密度图的分辨率是通过与0.143标准的金标准傅立叶壳相关（FSC）计算得出的。通过在Relion 3.1中进行后处理进行锐化后，使用Resmap v.1.1.4估计局部分辨率43。

　　对于ADGRD1-MINIGS复合体，总共收集了4,588部电影，并进行梁诱导的运动校正和CTF测定。通过无参考的自动选择产生了总共3,307,950个粒子投影，并进行了两轮2D分类以丢弃假阳性颗粒。由Relion 3.1生成的AB INTIO算模型用作3D分类的初始参考模型。选择了3,195,673个颗粒的子集进行另一轮3D分类。1,266,674个颗粒的外观最佳数据集经受了CTF的细化，贝叶斯抛光和3D自动再填充，从而在2.8Å分辨率下进行最终地图。

　　对于ADGRF1 -MINIGI1综合体，总共收集了14,521部电影，并分别处理为3个数据集，共3,031、6,921和4,569部电影。所有数据集都提交给梁诱导的运动校正和CTF测定。通过无参考的自动采摘，分别提取了总共3,781,704、8,302,989和5,610,993个粒子投影，并进行2D分类以丢弃假阳性颗粒。由Relion 3.1生成的AB INTIO算模型用作3D分类的初始参考模型。最佳模型被选为另一轮3D分类的参考模型。从三个数据集中看上去最好的类别进行了CTF细化和贝叶斯抛光，然后合并以进行3D自动填充，并在受体– G蛋白质络合物上使用掩模和掩模进行了另一轮聚焦的3D分类。从聚焦3D分类中进行的1,735,602个粒子的数据集进行了另一轮3D自动再填充的回合，生成的地图具有3.4Å的全局分辨率。

　　总共收集了10,299部ADGRF1-MINIGS的电影，并进行梁诱导的运动校正和CTF测定。通过无参考的自动选择提取了总共提取6,972,863个粒子投影，并进行三轮2D分类以丢弃假阳性颗粒。ADGRF1-MINIGI1复合物的模型低到60Å，并用作3D分类的初始参考模型。最佳模型被选为另外两轮3D分类的参考模型。选择了具有365,932个颗粒的最佳外观类，并进行CTF细化，贝叶斯抛光和3D自动填充，从而产生的地图，全局分辨率为3.1Å。

　　收集了总共9,125部ADGRF1（H565A/T567A）–Minigi1复合物的电影，并进行了梁诱导的运动校正和CTF测定。通过无参考的自动选择提取总共提取9,258,154个粒子投影，并进行2D分类以丢弃假阳性颗粒。由Relion 3.1生成的AB INTIO算模型用作3D分类的参考模型。外观上最好的799,431个颗粒的类别进行了CTF的细化，贝叶斯抛光和3D自动再填充，导致图的全球分辨率为3.0Å。

　　ADGRD1 –和ADGRF1 -G蛋白复合物的模型是通过从Alphafold预测模型44的受体，GAI，Gβ和Gγ的亚基中募集的受体（蛋白质数据库（PDB）ID：6LML）和Glucgogogon – glucgogogon（PDB – glucgogon）（pDB）（pDB），建立了GαI，Gβ和Gγ的亚基。6LMK）作为初始模板。Chimerax v.1.145将每个模型都停靠在相应的低温EM密度图中，然后在COOT46中进行迭代手动调整，而phenix.Real_Space_refine的真实空间改进。使用Molprobity48验证了模型统计数据。

　　ADGRD1 – Minigs的最终模型包含277个ADGRD1（T545 – T821）的残基，210个Minigα的残基（I26 – K58，F208 – N254和R265 – L394），339个Gβ1（S2 -–ν340）的残基，Gβ1的残留物，gβ1（S2 –ν340）的128 –grγ22（S2 –ν340）和128 – rans and gγ2（a7 – r 2）NB35（Q1 – S128）。最终的ADGRF1 – Minigs模型包含280个ADGRF1（T567 – V647和S654 – K852）的残基，211个Minigα的残基（I26 – K58，I207 – N254和R265 – L394），339个残基Gβ1（S2 -n2340），S2 -56340）和127个NB35的残基（Q1 – S127）。对于ADGRF1 -MINIGI1复合物，最终模型包含286个ADGRF1（T567 – K852）的残基，207个MinigαI的残基（K10-M53，T182 – Y230和N241 – F354），339Gβ1（S2 -– s2 -– s2 -– r）残基，gβ1和56 – 56 – 56 – 56 – 56 – a7对于ADGRF1（H565A/T567A）–Minigi1复合物，最终模型包含286个ADGRF1（A567 – K852）的残基，207个MinigαI的残基（K10-M53，T182-Y230，N241 – F354），N241 – F354），339 Rastues and 339 Rastues and 56 Rastues and S2-2-2-2 -2- n940（s2 3 3 3 3933334）Gγ2（A7 – R62）。受体和G蛋白的其余残基是无序的，没有建模。最终的完善统计数据在扩展数据表1中提供了。通过针对半映射之一来完善最终模型，并将所得的映射与模型FSC曲线与两个半图和最终模型进行比较，从而排除了精炼过程中的反拟合。使用Pymol V.1.8和UCSF Chimera V.1.15制备结构数字。

　　在N末端，将野生型ADGRD1和ADGRF1和功能研究中使用的突变体构造为具有FLAG标签的PTT5载体，以进行受体表达测量。按照制造商的指导，使用Lance Ultra Ultra Camp检测试剂盒（Perkinelmer）来测量介导GS信号传导中ADGRD1和ADGRF1的基础活性。简而言之，将2 mL HEK293F细胞（常规测试细胞进行支原体污染），密度为1.2×106个细胞，每毫升瞬时用野生型或突变体受体的2,000 ng质粒转染2,000 ng质粒，并在37°C下在48°C中培养在5％Co2 Coy2 yseere shake shake shake shake shake shake shake shake shake shake shake shake shake rpm shake。收集后，通过将10μl细胞与15μl单克隆抗FLAG M2-FITC抗体（Sigma; 1：120稀释在4％BSA中稀释的TBS和20％的活化溶液（Invitrogen）7-AAD（Invitrogen）在4°C下稀释的TBS，在4°C中稀释的TBS中，测量受体的细胞表面表达。孵育后，加入175μlTBS缓冲液，并使用流式细胞仪读取器（Guava Easycyte HT，Millipore）测量荧光信号。

　　将十微晶的细胞分配到384孔板中（每井悬浮在刺激缓冲液（HBSS缓冲液）（HBSS缓冲液（Thermo Fisher Scientific）中，补充了5 mM HEPES，pH 7.4、0.1％BSA（PerkinElmer）（Perkinelmer）和0.5 mM IBMX（Sigma），然后在室温下供应30分钟，并在室内温度下启动30分钟。在室温下，在室温下进行1 h的ulight-anti-camp工作溶液是通过在330 nm处激发的Synergy II（Bio-Tek）读取器，并在620 nm和665 nm处通过标准剂量响应曲线使用GraphPad Prism 8.0计算了cAMP的积累。

　　按照制造商的说明，使用IP-ONE GQ测定试剂盒（CISBIO生物测定）进行了肌醇单磷酸（IP1）积累测定，以测量ADGRF1在介导GQ信号传导中的基础活性。在HEK293F细胞中表达野生型ADGRF1和突变体，并如上所述测量表达水平。将14颗微量的细胞分配到384孔板中（每孔悬浮在刺激缓冲液中18,000个细胞），并在37°C下孵育1.5小时。然后加入3μLIP1-D2抗体（1:20在裂解和检测缓冲液中稀释）和3μl隐形标记的抗IP1单克隆抗体（1:20在裂解和检测缓冲液中稀释1:20）并在室温下孵育1小时。通过Synergy II（Bio-Tek）读取器测量荧光信号，并在330 nm处激发，并在620 nm和665 nm处发射。使用GraphPad Prism v.8.0根据标准剂量反应曲线计算IP1的积累。

　　为了研究ADGRD1和ADGRF1的合成茎肽诱导的G蛋白激活，进行了使用Trupath Biosansors进行BRET测定，以测量与Gα亚基融合的RLUC8与GFP2融合的RLUC8之间的近端相互作用。如前所述49，从addgene（Addgene KitNo。10000163）获得的生物传感器套件是从B. Roth获得的礼物，包括GαSS-RLUC8，GαI1-RLUC8，Gβ3和Gγ9-GFP2，如前所述49。合成茎肽PD1和PF1（GL Biochem），以50 mm的浓度溶于二甲基亚氧化磺氧化甲醛（DMSO），并用20 mm Hepes，ph 7.4）溶于不同的浓度，并用测定缓冲液（HBSS Buffer（Thermo Fisher Scientific）稀释到不同的浓度。

　　The wild-type or mutant ADGRD1 and ADGRF1 were transiently co-transfected with plasmids encoding Gα-RLuc8 (GαsS-RLuc8 for Gs activation assay; Gαi1-RLuc8 for Gi activation assay), Gβ3 and Gγ9-GFP2 at a ratio of 2:1:1:1 (receptor plasmid, 800 ng; G protein subunit质粒，每毫升的密度为1.2×106细胞，在2 mL HEK293F细胞中为400 ng。如上所述进行细胞培养和受体表面表达测量。将细胞在60μl的测定缓冲液中将细胞铺成96孔白板（每孔40,000个细胞），并在37°C下孵育30分钟。然后加入10μl新鲜制备的50μm鞘嗪400A（Nanolight Technologies）。平衡5-10分钟后，通过具有410 nm（RLUC8-二氧甲苯甲酸400A）和515 nm（GFP2）发射过滤器的Synergy II（Bio-Tek）读板测量BRET基线。用不同浓度的30μl合成茎肽刺激细胞，并连续监测BRET信号五次。最后测量用于数据分析。将BRET比率计算为GFP2发射与RLUC8发射的比率。

　　如前所述的33,50进行了较小的修饰，对特异性结合的磷脂的鉴定进行了鉴定。简而言之，用5 mM TCEP在25°C下将ADGRF1和对照ADGRD1蛋白还原30分钟，并在25°C下用20 mM Idoacetamide烷基化30分钟。然后将蛋白质样品用胰蛋白酶（promega）在37°C的酶与蛋白质比的1:50（w/w）过夜消化。将消化的蛋白质干燥在真空浓缩器中，然后用涡流和超声处理用400μl冰冷的甲醇：水（9：1，v/v）提取。在4°C下以12,000g离心15分钟后，收集上清液并在真空下冻干。将脂质提取物重悬于甲醇：氯仿（9：1，v/v）中，等效浓度为2μm。在Q的精确质谱仪（Thermo Fisher Scientific）上分析样品，在正离子模式下运行，该模式与Waters Accipity UPLC系统（Waters）结合使用。液相色谱（LC）分离在CSH C18色谱柱（100×2.1 mm；1.7μm）（水域）（水）上以0.4 ml min – 1的流速在40°C下进行，流动相位A乙腈A组成：乙腈：水（60:40，V/V/V）（60:40，V/V），具有10 mm ammon和0.1 formatate和0.1 formicate和0.1 formicate and Adic and Adic and Adic Andife and Andife and Idic and Andip and Andip Andip Andip and Andip and Andip and Andip and Andip and Andip and and Andip and Bys and Bys B.2-丙醇：乙腈（90:10，V/V），甲酸铵铵和0.1％甲酸。LC梯度设置为如下：0 15％B；0-4分钟30％b;4-4.5分钟48％b;4.5-22分钟82％b;22-24分钟99％b;24-30 min 15％B。采集方法设置为以下参数：质量范围100-1,500 m/z；喷射电压3.5 kV;鞘气（氮）流速35单位；辅助气体（氮）流速10单位；毛细管温度320°C。MS1扫描参数包括分辨率70,000，AGC目标3E6和最大注射时间200 ms。MS/MS光谱是在将碰撞能量设置为20 eV的前10个前体上获得的。所有样品均以三个独立的重复准备。

　　通过将准确的质量和串联质谱与内置脂质光谱库脂质-blast51匹配，在MS-DIAL（v.4.70）中鉴定了ADGRF1和对照样品中的磷脂。然后，使用TraceFinder（V.4.0，Thermo Fisher Scientific）从每个样品中获取鉴定脂质的提取离子色谱图（EIC），基于准确的质量匹配和与各个峰的保留时间对齐。脂质与ADGRF1的特异性通过ADGRF1中每个脂质与对照样品的EIC峰面积的比率进行了评估。平均EIC比> 2且P <0.05（n = 3）的脂质定义为对ADGRF152的特定粘合剂。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。