按照A. L. Smith57最初描述的协议的修改版本，将线粒体从猪心中分离出来。在线粒体提取之前，对猪心进行了三种不同的治疗条件：（1）新鲜 - 立即将冰放在所有后续程序上；（2）温和 - 在室温下孵育40分钟，然后放在冰上以快速冷却以隔离；（3）苛刻 - 在室温下进行超过4小时的饲养，然后在冰上冷却。然后将分离的线粒体重悬于含有0.25 M蔗糖，10 mm Tris缓冲的溶液中，pH 7.8时用H2SO4和0.2 mM EDTA。调整悬浮液以在600 nm的1.3吸光度单元时达到最终的光密度。

　　对于低温EM网格制备，将3.3μl线粒体悬浮液应用于每个量子孔碳网格（r2/1，300筛网）。将网格在维持在8°C和95％相对湿度的玻璃体标记IV（Thermo Fisher Scientific）腔室中孵育5 s。在将网格迅速浸入液态乙烷中，在大约-170°C的温度下，使用标准的玻璃体滤纸将多余的溶液印迹。

　　最初，使用耶鲁大学科学山电子显微镜设施的200 kV冰川显微镜（Thermo Fisher Scientific）对网格进行最佳的冰条件。随后将选定的网格转移到配备了生物化能量滤波器和K3 Direct电子检测器（GATAN）的300 kV Titan Krios显微镜（Thermo Fisher Scientific）中，以在耶鲁大学西部校园电子显微镜设施上进行高分辨率数据采集。使用Serialem Software58和Gatan DigitalMicrograph促进自动数据收集。所有图像均以超分辨率模式捕获，物理像素大小为6.1Å（在上分辨率上有效3.05Å）。总共收集了八个倾斜系列，针对从-6 µm到-10 µm的相对较高的散焦范围，以更好地对比度，以确保更可靠的初始重建。将分组的剂量对称方案以2°的增量从-60°到60°，用于倾斜序列采集，累积剂量为100 E-/Å2。

　　使用自定义脚本简化了断层图重建。使用MotionCorr2（参考文献59）进行初始帧对齐，然后以显微照片为两个。倾斜系列堆栈是使用内部脚本生成的。使用Aretomo 1.2.5（参考文献60）对所有倾斜系列进行对齐和重建。用GCTF61和CryoSparc62估算了初始对比传递函数（CTF）参数。使用IMOD63和Chimerax64对原始显微照片和重建结果进行了可视化和诊断。

　　在EMAN2中挑选了单个SC颗粒（参考文献65）。元数据制备在Relion-4.0（参考文献66）中产生12,000个子图颗粒，其binning系数为2（像素尺寸为12.2Å）。在两轮3D分类之后，选择了806个SC颗粒进行最终细化，从而导致37Å的亚图平均图。使用傅立叶壳相关性评估分辨率，阈值在RELION-4.0中为0.143（参考文献66）。使用subtomo2Chimera代码将平均地图反射到原始断层图上，可从https://github.com/builab/subtomo2chimera获得。

　　使用冰川或Titan Krios Electron显微镜（Thermo Fisher Scientific）进行自动数据采集。晶状体配备了K3直接电子检测器（GATAN），并以200 kV的形式在上分辨率模式下以0.434Å的像素大小以100μm的客观孔径进行操作。Titan Krios也配备了K3直接电子检测器，以300 kV的速度运行，像素大小为0.416Å，在超分辨率模式下使用Gatan Energy滤波器进行操作。使用Serialem软件包58促进自动数据收集。每个成像位置设置为3×3孔，每个孔的暴露于200 kV，每个孔的暴露在300 kV时，每个孔的暴露率为4个。对于冰川的总电子剂量，将总电子剂量分级为42 E/Å2，而Titan krios的总电子剂量为50 E-/Å2，以每帧40 ms分布在45帧之间。对于200 kV数据集的液压参数范围从-1.0μm到-3.0μm，对于300 kV数据集，降解参数范围从-1.0μm到-1.3μm至-3.0μm。数据收集的详细信息总结在补充表1-6中。

　　对于所有数据集，使用MotionCor2（参考文献59）或CryoSparc62进行运动校正。使用GCTF61或CryoSparc62估计每个运动校正显微照片的CTF。如下所述，使用迭代排序策略用Gautomatch或CryoSparc挑选颗粒。可以从https://github.com/jackzhang-lab下载用于实时数据传输和即时预处理的Cryo-EM脚本。

　　由于低信噪比和高度拥挤的大分子环境所带来的挑战（扩展数据图1A），传统的粒子选择方法不足以生成可靠的数据集，可与可靠的二维（2D）分类，初始化的三维（3D）重新构造和局部局部细化。为了解决这个问题，我们实施了一种迭代策略来优化粒子选择和排序。该方法涉及几轮迭代2D粒子拾取，2D分类和3D分析，包括AB Initio 3D重建，3D分类和多层次局部改进。与常规的粒子选择方法不同，我们的策略使用Gautomatch和CryoSparc62进行模板匹配，以逐渐增加3D投影的分辨率，因为重建逐渐改善了循环。我们使用了几种独立的参考来源来跨验证最终结果。为了最大化高质量颗粒的产率，将所有周期中SC的明确特征的粒子合并为随后的3D交叉分类。在以下各节中解释了该策略的更多细节。

　　传统的2D分类未能使用从我们的原位冷冻em线粒体中选择的图像产生有意义的班级平均值，这三个主要原因是：（1）导致信噪比较低的厚样品和较大的散热性变化，（2）拥挤的环境，在挤压粒子检测和（3）强烈的束缚的环境中，并（3）均具有（3）均具有（3）隔离的束缚，并且（3）均具有（3）均具有（3）均具有（3）均具有隔离的束缚。（扩展数据图1b）。

　　为了解决这个问题，我们最初使用了强烈的膜信号，并专注于使用2D分类包围的侧视图。这些侧视图原则上包含了足够的方向信息，以进行完整的3D重建。首先，蛋白质信号在2D分类中完全平均，而由于强侧视信号，膜对齐（扩展数据图1C）。然后，我们进行了几个2D分类的循环，仅专注于表现出透明膜信号的颗粒。

　　通过全面的2D分析，我们发现潜在携带线粒体SC的区域表现出局部曲率的特殊特征。具体而言，这些区域的特征是膜信号似乎朝着基质方向凹，表明存在CIII2（扩展数据图1C – E）。通过将CIII2周围具有特征性凹面膜的类的颗粒合并并进行进一步的2D分类，我们获得了改进的2D平均值，显示了CIII2周围清晰的膜特征（扩展数据图1D）。值得注意的是，与CIII2相邻的额外蛋白质密度很明显，可能代表CI或CIV密度。但是，目前尚不清楚本地线粒体中存在多少种类型的呼吸SC，以及CI，CIII2和CIV始终以SC的形式出现还是部分出现。

　　为了进一步解决这些观察结果并获得公正的密度图，我们使用了四种独立的方法来生成初始参考：（1）CRYO-ET亚参数平均（补充图1），（2）使用分配给2D平均粒子的颗粒进行重构，该平均粒子具有可见的蛋白质密度（扩展数据图1f）和特征cii2 abbrane ciyii abbrane ciii2 abbrane tarey（3）膜信号减法后使用颗粒的Initio 3D重建（扩展数据图1H）和（4）由随机选择未分类粒子或随机噪声产生的模型（扩展数据图1i）。将所有这些参考都合并为3D分类，随后用于局部细化和集中分类（扩展数据图1i）。鉴于原位冷冻EM数据集比传统的单粒子数据集更异质，因此我们包括了从方法（4）生成的“错误参考”，以更好地分类。最后，重新提取了与显示A型SC的明确特征的类的粒子，并合并以进行进一步的分类和改进（扩展数据图1i）。

　　在重建的SC I1III2IV1（A型）图周围，我们观察到了额外的密度，清楚地表明，更多的蛋白质与A型SC结合以形成较大的SC。我们怀疑天然线粒体膜中存在更多类型的SC。在低分辨率下，大型单粒子3D分类和平均冷冻子体积的初步结果证实了这一猜测。为了进一步提高3D分类的高分辨率细化的准确性，我们故意提供了使用以前周期的丢弃粒子从随机子统计产生的额外的错误参考。这些错误的参考文献可随机吸收低质量和错误的选择粒子，从而导致目标类别相对干净的数据集。然后，我们积累了分类为良好类的粒子，这些粒子由几个周期的透明二级结构定义。由于线粒体环境拥挤，始终存在错误分类和未对准的颗粒。为了解决这个问题，我们通过合并掉入类相似的3D地图的类的粒子来重新组织粒子。我们从不同类别中选择了多个参考文献，包括被认为是“不良”的参考文献，并在每个子数据集中重新构成3D分类。之后，我们重组了被认为是“好”的不同类别的所有子集并将其重新分类。然后，根据这些结果，我们合并了以前循环中属于特定目标的所有粒子，并在合并的数据集上进行了3D分类的进一步循环。这种进一步的分类使用了先前分类周期和局部细化产生的高分辨率参考，以丢弃低质量或错误分类的粒子。

　　经过大量的交叉分类，然后进行局部改进后，我们确定了其他各种SC，包括其他三个主要类别：B型（I1IIII2IV2），类型O（I2IIII2IV2）和X型（I2IIIII4IV2）。除了四个主要类别外，还观察到其他类别I1III2，I4III4IV4甚至更高阶的组件。但是，由于人口较低，它们在这项研究中不受进一步的改进。随后，我们通过提供一组缺乏SC的正确形式的参考文献来交叉验证我们的分类结果。在3D分类和细化后，我们还进行了进一步的无参考2D分类，以验证不同形式的SC。这使我们能够直接直接从2D平均值中可视化四个主要类的不同特征，而无需强加任何参考。最终的多级局部改进和重点3D分类中，只有收敛到正确复杂形式的数据集都包含在最初的。

　　分层掩​​蔽策略用于对所有四种主要类型的SC进行局部完善。具体而言，将掩模的大小逐渐减小，以专注于每种类型的呼吸SC的不同区域，以确保稳定的局部细化。我们将A型SC分为五个主要领域：（1）CI亲水区，（2）CI疏水区，（3）CIII2，（4）CIV和（5）脂质环境。

　　在进行多级局部细化之前，使用1,113,902个高质量粒子的图像使用了两次bin bin的图像（在嵌套后每个像素后为1.664Å），将A型SC精制到3.39Å。其中包括类型B，类型O和X型，因为它们都共享A型区域。我们最近并重新提取了这些颗粒，生成了1,050,463个最终粒子，用于随后的局部细化（在重新萃取后边缘附近的颗粒被排除在外）。最初，使用未链接的颗粒（每个像素为0.832Å），CI，CIII2和CIV的分辨率略微恶化（约3.5Å）。通过优化多个局部改进参数，包括掩盖大小，全局CTF，局部CTF细化，局部角度细化和不均匀的细化67来实现进一步的改进。

　　通过迭代应用这些技术，我们将CI，CIII2和CIV的亲水区域的地图和CIV的疏水区分别为2.46Å，2.58Å，2.31Å和2.66Å的平均分辨率（补充图2和补充表和补充表1-6）。甚至针对CI和CIII2的较小的区域口罩，也进一步改善了当地决议。CIII2的大多数蛋白质区域中的局部分辨率范围为1.8至2.4Å（补充图2C）。针对特定子域（例如Q/QH2结合位点）的重点分类和完善，从而进一步改进了模型构建。对于更复杂的区域，例如SCS跨膜区域的脂质环境和Q/QH2结合位点，进行了进一步的集中分类和局部改进。为了确保相邻区域的无缝集成，所有局部面具都是手动创建的，以便使用较小的区域分别精制的较小区域包含足够大的最终复合图。将所有局部精制的段集成到Chimerax64中的复合图中。

　　使用类似的多级改进方法来确定其他形式的呼吸SC的结构。详细的参数和改进结果总结在补充图2中。2–5和补充表1-6。

　　限制膜蛋白在本机环境中限制高分辨率的低分辨率冷冻重建的关键瓶颈之一是周围膜的严重信号干扰。这种干扰可以显着影响冷冻EM数据分析的几个步骤，包括从头算重建，欧拉角度的确定以及2D和3D分类以及对齐参数的细化。为了解决这个问题，我们开发了一个计算工具包，以检测来自2D平均值的膜信号，估计检测到的膜的局部几何形状，并抑制或删除这些信号以实质上提高天然膜环境中线粒体复合物的一致性可靠性。

　　最初，我们生成了一系列的15-30个计算模拟的脂质双层的投影，局部曲率范围为0 nm -1至0.02 nm -1。这些模拟的2D膜用作模板，用于检测使用Gautomatch的线粒体膜的侧视信号。随后，进行了三到五个2D分类的循环以丢弃低质量和非膜颗粒，从而导致一部分颗粒显示出脂质双层的清晰侧视图。然后，我们使用ra尺估计了每个脂质双层的近似方向和中心。通过最大化每个2D平均值与一系列模拟脂质双层之间的互相关来确定局部曲率。使用来自CryoSparc62产生的2D分类的比对参数旋转并翻译这些曲线。通过最大化原始图像和转换的2D平均值之间的归一化互相关来完善每个膜段的中心。使用这些估计的参数，我们通过局部平均沿膜曲线的图像强度局部平均，该图像强度比典型的脂质双层大约25％。主导原始图像中对齐的膜信号被削弱，以增强蛋白质信号的贡献，以促进随后的重建，比对，分类和局部改进。这改善了蛋白质区域的信号贡献以进行初始比对，类似于我们先前描述的微管信号减法方法中观察到的临界效应68,69。最后，将比对和分类参数与膜信号一起应用于原始图像，以进行随后的局部细化和集中分类。

　　与先前发表的体外结构相比，原位线粒体呼吸链复合物在很大程度上保留了膜结构的天然状态（图2扩展数据2）证明了这一点。在最终的3D重建和3D后2D类平均值中，可以观察到这种高密度的高忠诚度，从而使天然膜结构的直接建模。

　　线粒体SC的内膜结构的模型构建涉及四步过程。首先，在给定密度图（例如A型SC）中，从原始信号中取出离散点的基础。通过最小二乘最小化拟合了一个2D平面；估计每个SC的正常矢量，并旋转坐标系，使该矢量与Z轴对齐。其次，这些抽样的离散点用于生成两个光滑的曲面，厚度约为4 nm。第三，生成平面磷脂双层结构以匹配这些估计表面的几何形状。最后，将第二个步骤和第三步的信息集成到几何变形，每个平面膜结构变成光滑的弯曲表面。

　　为了优化膜模型构建的初始采样，我们将蛋白质周围的膜结构分为三个不同的组：结构化脂质，与表面相关的脂质和通用双层脂质。第一类结构化脂质包括与蛋白质跨膜区域密切相关的脂质。这种紧密的关联实现了这些特定脂质物种的鉴定和直接的原子水平建模，在使用洗涤剂纯化的先前报道的结构中也观察到。第二类，与表面相关的脂质，包括位于蛋白质直接周围的脂质，形成了伪晶格结构。在此晶格中，可以辨别部分磷脂酰乳头和疏水性尾巴。我们的原位密度图使我们能够明确确定此类别中单个脂质的位置。但是，当前密度图的质量不允许识别存在的特定类型的脂质类型。第三类，通用双层脂质，代表了一个远离蛋白质的区域，在蛋白质中，只能观察到与双层相对应的密度特征。我们使用通用的磷脂膜模型来近似磷脂酰头组的可能水平位置。由于脂质双层的流体性质和密度图中的高噪声水平，即使在集中分类后，这些通用双层脂质的中心位置也可能在不同的子类之间有所不同。但是，在四种主要类型的SC中，膜的平均几何特征和膜的中心位置显着一致。因此，这些通用双层脂质仅用于校准磷脂双层的中心位置和方向， 而不是表示每个SC的双层中单个磷脂分子的实际位置。这种方法促进了对SC之间总体几何变化的分析，尽管不是在单个磷脂分子结构的水平上。

　　为了为通用双层脂质实现足够平滑的模型，我们使用COOT Software对初始结构进行了真实空间的改进70。使用局部高斯滤波器对精制结构进行进一步的平滑，以最大程度地减少局部膜区域的残留噪声。此步骤启用了每个点的轮廓图和局部曲率的精确估计（图2B）。我们使用Charm-GUI Web Service71生成模拟的矩形平面磷脂双层。然后将此平面结构映射到高斯平滑后获得的弯曲表面。该映射过程产生了最佳拟合密度图的弯曲膜模型。从这些估计的表面中，可以直接检索有关线粒体SC围绕膜的局部几何形状的信息，以进行随后的几何分析和比较。

　　原子模型是使用COOT72手动构建的。首先将使用Chimerax64的牛CI（PDB：7QSK），牛CIII2（PDB：2A06）和牛CIV（PDB：2A06）和牛CIV（PDB：5XDQ）的高分辨率结构使用。然后，对拟合的模型进行了手动突变，调整和真实空间，以纠正局部区域中的错误，以使用COOT72最好地匹配密度图。最终模型使用phenix.Real_Space_refine73具有几何约束，并使用MolproBity74进行了验证。使用UCSF Chimerax64和Pymol生成数字。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。