质粒源自先前报道的构建体，受体向量源自PHR_PGK（Addgene 79120），并将其克隆到phr_gal4uas_pgk_mcherry（Addgene 79124）中。这项工作中报道的所有构建体都是使用Nebuilder Hifi DNA组装（NEB E2621）生成的。补充表1中列出了构造的映射，对应于哪个图。序列在补充表2中列出了序列。在补充表3中列出了本手稿中描述的新组件的起源。

　　Lenti-X 293T细胞（Clontech 632180）在Dulbecco修饰的Eagle的培养基（DMEM）中培养，补充了10％FBS（Millipore Sigma），1倍吡啶钠（Millipore Sigma）（Millipore Sigma）和50 U ML-1 Penicicillin-1 Penicillin-stroptheptycin（Ml-1 Ml-1）。表达核定核RFP的A375细胞是UCSF的A. Marson实验室的礼物。从UCSF细胞和基因组工程核心获得A549细胞（CCLZR013）。A375和A549细胞系在293T培养基中生长。从ATCC（HTB-37）获得CACO-2细胞，并在DMEM（Gibco 11965092）中生长，并补充了20％FBS和50 U ML-1 Penicillin-1-链霉素。M28细胞是从国家癌症研究所的B. gerwin实验室获得的，并在RPMI 1640（GIBCO）生长，其含有10％FBS，50 U ML -1 Penicillin -strepthepsycin和1 x Glutamax（Gibco）。供应商对从ATCC或UCSF细胞和基因组工程核心获得的细胞进行了认证。测试了所有细胞系的支原体（ATCC 30-1012K）。对于病毒产生，将1E6 Lenti-X 293T细胞在2.5 mL 293T培养基中以每孔1×106的速度播种在六孔血管中。播种后的一天，使用由1.34μgPCMVDR8.91和0.17μgpmd2.g的包装混合物转染，使用Transit-Lenti转染试剂（MIRUS）（MIRUS）（MIRUS）（每1μg每1μg总DNA）。转染两天后，通过离心收集病毒上清液，并立即用于转导。

　　对于Jurkat实验，首先将HEK293T细胞在DMEM（Gibco）中培养，并补充了10％FCII（Gibco）和50 U ML -1 Penicillin -Streteptycin（Gibco），然后用“诱导” DMEM DMEM培养基，并补充了10％FCII，少量少量和50 mm sodiul and -1 u -1 u和50 u -1 mm和50 u -1 mm。补充了10％FCII，0.1 mM HEPES，1×GLUTAMAX，1×MEM非必需氨基酸和50 U ML-1青霉素 - 链霉素的“病毒” DMEM培养基。在补充1×谷歌，10％FCII和50 U ML -1青霉素 - 链霉素的RPMI 1640中培养Jurkat T细胞。对于慢病毒的产生，将293T细胞在12孔容器或T75板中以400,000个细胞接种，并生长至90％的汇合。然后，将22μg表达载体与22μgPCMV和4.5μgPVSV-G混合（对于12孔转染，将这些微克量的DNA量除以4）。然后使用PEIMAX（Thermo Fisher Scientific）和1×Opti-MEM（Gibco）包装该DNA混合物，并添加到293T细胞的培养基中。然后，在12-17小时后，将培养基从这些细胞中取出，并用含有10 mM丙酮酸钠的“诱导” DMEM培养基代替。孵育6-8小时后，将“诱导”培养基替换为“病毒”培养基。两天后，使用Lenti-X浓度（Takara）收集病毒上清液，通过离心浓缩，并立即用于转导。

　　通过阳性选择（干细胞17851），以散装CD3+格式的格式（Vitalant）从匿名供体血液中分离出T细胞。对于无孔实验，分离了CD8+种群（干细胞15063）。捐赠材料的使用已获得UCSF机构审查委员会的批准。分离后，在RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific 11875093）中将T细胞冷冻在液氮中，补充了20％的人类AB血清（Valley Biomedical HP1022）和10％DMSO。对于实验，将T细胞在37°C下融化，在由X-Vivo15（Lonza 04-418Q）组成的人T细胞培养基中洗涤和培养，5％人类AB血清，10 mM N-乙酰基甲基甲酸 - 甲膜甲烷（Sigma-Aldrich A9165）中性（SIGMA-ALDRICH A9165）中和1 M naOH（SIGMA-ALDRICH A9165）和1 M MNAHOH（SIGMA-ALDRICH A9165）perrement and Seppermma-Aldrich（sig sig sig-sig-sagmma-Aldrich70777）。IL-2（NCI BRB临床前存储库）。解冻后的一天，使用1：3细胞：珠子比，用洗涤后的Dynabead（Thermo Fisher Scientific 11132d）刺激T细胞。第二天，以1：1的总体积比添加未贴上的慢病毒上清液。感染24小时后，将细胞轻轻颗粒（400g持续5分钟），并将耗尽的培养基换成新鲜的完整培养基。在随后的膨胀三天后，通过磁分离去除了纳皮德，并分类细胞（贝克顿·迪金森·facsaria II），以表达表达表位标记的受体和构成性表达荧光团的报告记者电路（如果适用的情况下）的种群。实验通常在排序后4至7天开始。所有实验均在incucyte分析以外的其他人类T细胞培养基中进行，该培养基在RPMI – 10％FBS中进行。

　　为了进行分类，将T细胞颗粒并重悬于100μlPBS中，并以1：100的比例重置2％FBS和抗体。在室温下进行20–30分钟的染色后，将细胞颗粒并重悬于PBS中，并在2％FBS上重悬于冰上，并将其保持在冰上直至分类。对于测量荧光报告基因的流式细胞仪，直接分析细胞并在散射（FSC-A与SSC-A），单细胞（FSC-H与FSC-A）和由报告基因构建体表达的本构共荧光液（补充图1A）中直接分析并进行门控。为了进行涉及免疫组织化学的细胞仪实验，将细胞在PBS中洗涤一次，然后在室温下染色20-30分钟，然后在分析前洗涤3次。补充表4列出了所使用的抗体。

　　重组可溶性因子被轻轻地重悬于各自的制造商征收的重组缓冲液中，并在-80°C中以单使用等分试样冷冻。在室温下解冻后，将蛋白质在T细胞培养基中稀释至适当的浓度，然后以1：100稀释的96孔板中直接添加到T细胞中，或以培养基至2倍的终浓度预先稀释，并以1：1的比例添加。将细胞短暂混合并在37°C下孵育，直到通过流式细胞仪（BD FACSYMPHONY X50 SORP或LSR II SORP）测定报告基因表达。除非另有说明，否则显示的数据代表72小时的配体暴露。代表性门显示在补充图1B中。在补充表5中列出了实验中使用的重组可溶性因子，抑制剂在补充表6中显示。在未指定的情况下，TGFβ是指人类TGFβ1，而VEGF则指的是人VEGFα。如前所述38，通过在80°C的80°C孵育5分钟进行潜在人TGFβ1的激活。对于TRE3G启动子，添加了Doxycycline Hyclate（ABCAM AB141091）作为配体模拟试剂。对于化学抑制剂实验，DAPT，GI254023X和氯喹的工作浓度分别为10μM，10μM和25–100μM。分别以0.17μgml-1和1.4μgml-1的浓度使用阻断抗体，PAN-TGFβ阻滞剂（R＆D MAB1835）和贝伐单抗（Selleck，A2006）。立即在配体之前添加化学抑制剂和阻断抗体。

　　对于Jurkat实验，在新鲜的RPMI培养基中收集了Jurkat T细胞，并以每毫升400,000个细胞重悬于。将De-Novo设计的原始物质稀释至1×PBS中的适当浓度，并在96孔板中以1:10稀释（20μl为200μL）添加到新鲜洗涤的细胞中。将测定板在37°C下孵育17-24小时，然后使用流式细胞仪进行分析。这些实验中使用的矫形器和抑制剂也分别在补充表5和补充表6中列出。

　　如前所述制备了微孔39。简而言之，通过光刻术在硅晶圆上制造了具有周期性微孔阵列（24 µm×40 µm直径×深度，10 µm井到孔间距）的阵列的主SU8模具。然后，通过O2-铂治疗将主霉菌钝化，然后通过真空吸尘器下的三氯（1H，1H，2H，2H，2H，2H-全氟辛基）硅烷（Sigma-Aldrich）蒸气沉积。将聚二甲基硅氧烷（PDMS）施放在晶圆上并固化以产生主模层的阴性。小心地从晶圆上取下PDMS块后，切开圆形PDMS邮票（直径为4毫米），并将其放在玻璃底盘（Mattek）的盖玻片（第1.5号）上。将一滴前聚合物溶液（Bio133，我的聚合物）添加到PDMS邮票的一侧，从而通过毛细管促进基板和邮票之间的间隙填充。固化紫外线暴露后，仔细去除PDMS邮票。最终的微孔阵列模式用pluronic Acid F127（Sigma-Aldrich）处理过夜，以阻止可溶性配体与微小细胞的非特异性结合。

　　矫正配体在大肠杆菌BL21（NEB）中表达。简而言之，编码设计序列的DNA片段通过Gibson组装组装成PET-29载体，并通过热休克进一步转化为BL21菌株。蛋白质表达是通过自动诱导系统诱导的，并用固定的金属亲和力色谱（IMAC）纯化蛋白质。使用SuperDex 75 10/300 GL或SuperDex 10/300 200列（GE Healthcare）进一步纯化了当局。蛋白质浓度通过纳米体（Thermo Fisher Scientific）测定，并通过灭绝系数进行标准化。将蛋白质稀释至1×PBS中的适当浓度，并使用1：100稀释液应用于细胞培养基。

　　对HeLa细胞进行设计，以用可切合的GFP结构域代替转录因子表达SNIPR受体。将这些细胞以每孔15,000的密度为15,000的18孔玻璃底部µ-s-slides（Ibidi 81817）。将MCHERRY融合的SNIPR配体与培养细胞一起孵育15分钟，3 h，6 h或24 h，然后在成像前30分钟添加了30分钟。将细胞在PBS中洗涤3次，并立即进行成像。共聚焦激光扫描显微镜在配备有LU-N4激光单元的尼康A1R HD25系统上进行（使用：488 nm，561 nm和640 nm）。使用20×，NA 0.75，WD 1.00毫米空气目标（Plan Apochromat Lambda）与一个多层次（EM 650 LP）和两个GAASP探测器（DM 560 LP EM 524/42（503-545）和DM 652 EM 652 EM 600/45-45-45（578-623）一起获取数据。通过NIS Elements软件控制了采集，并使用Fiji和Custom Wortent Python脚本分析了数据。

　　将表达MCHERRY融合的TGFβSNIPR的Jurkat T细胞播种成微孔。通过以下程序进行重组TGFβ1的荧光标记。将重组TGFβ1（10 µg）溶解在HEPES缓冲液（pH8，100 mm）中，然后与5当量的Alexa Fluor 647 NHS酯（Thermo Fisher Scientific A37573）（DMSO中的20 mg ML -1）混合。反应一小时后，通过将溶液通过旋转脱盐柱（Zeba Micro Spin，Thermo Fisher Scientific）去除过量染料。为了诱导SNIPR激活，将Alexa Fluor 647标记的TGFβ1添加到夹在微孔中的细胞中，终浓度为100 ng ml-1。在每次6小时和24小时，在每次成像疗程之前，将细胞用Lysotracker（Thermo Fisher Scientific L7526）染色30分钟。在Olympus Fluoview 3000激光扫描共聚焦显微镜上使用60倍Plan-Apo油物镜（NA 1.42）进行活细胞成像。获取了Z堆栈图像，并在斐济分析了数据。

　　为了在体外检测细胞生产的TGFβ和VEGF，将靶细胞在每种细胞类型的天然培养基中以20,000孔为20,000的平底96孔培养容器中播种。粘附和生长24小时后，将生长培养基吸入，并在人类T细胞培养基中用40,000个T细胞代替。BFP报告基因激活是通过流式细胞仪在48小时后通过流式细胞仪确定的。同样，在Transwell膜中，Transwell细胞系统中的体外共培养需要50,000个目标细胞（Corning 3388）。孵育24小时后，将T细胞以每孔100,000的孔在孔的底部接种，并在通过流式细胞仪确定BFP报告基因激活之前将细胞孵育72小时。为了通过ELISA生产TGFβ1和VEGF，在平底的96孔培养容器中以100,000孔接种靶细胞，并孵育72小时。孵育后，根据制造商的规程使用了HTGFβ1ELISA（Thermo Fisher Scientific BMS249-4）和HVEGF ELISA KIT（Thermo Fisher Scientific KHG0111）。遵循相同的方法，将靶细胞接种并收集上清液，用于LuminexTGFβ3-PLEX发现测定测定多种物种阵列（TGFβ1-TGFβ3）和VEGF-A，VEGF-B和VEGF-B和VEGF-C分析。为了生成矫形器发件人细胞，用质粒用质粒编码矫形器，该晶体瞬时转染，该质粒编码矫形器，该矫形器之前是经过修改的血清白蛋白分泌标签。然后将细胞生长48小时以在收集培养基之前允许蛋白质表达。为了消除任何潜在的细胞污染，将培养基以500克离心。为了评估矫形器的功能，将发件人细胞的条件培养基添加到Jurkat细胞中， 作为接收器单元。在分析BFP表达之前，将细胞孵育24小时。BFP信号表明发件人和接收器细胞之间成功的正凝剂介导的信号传导。

　　对于体外活细胞成像和杀死测定，将带有核位置MKATE2的A375，A549或M28靶细胞在其天然培养基中的平底96孔板中播种。24小时后，在RPMI 1640（GIBCO），10％FBS，50 U ML-1青霉素 - 链霉素和30 U MLL-1 IL-2中立即取出培养基，并立即被CD8+ T细胞代替，以维持实验开始时保持预期的2：1效应：目标比率。使用Incucyte S3 Live细胞分析系统（ESSEN BIOSCIENCE）对板进行成像，每个孔收集的三个或四个图像，成像周期为4-6小时，至少为7天。通过使用incucyte软件对荧光靶细胞核自动分割来计数细胞。

　　所有动物工作均在UCSF机构动物护理和使用委员会（协议AN177022-03C）的批准下进行。所有实验均使用NOD.CG- PRKDCSCIDIL2RGTM1WJL/SZJ（NSG）（RRID：IMSR_JAX：0055557）的小鼠在实验开始时为8-12周，年龄为8-12周。对于所有肿瘤模型，将0.1 mL无血清DMEM中解离的癌细胞皮下植入了侧面。肿瘤注射7天（排序后5天）在0.1 mL PBS中将T细胞在0.1 mL PBS中施用。除图5C外，用1×106个肿瘤细胞和6×106 T细胞进行实验，其中使用了1.5×106个肿瘤细胞和9×106 T细胞。通过卡钳监测肿瘤的大小，对于使用小鼠 - 人类交叉反应性汽车的实验，将小鼠的重量为每天0.1 g，在T细胞注射后一周，然后在所有随后的肿瘤测量时间点处。将小鼠安乐死在沿肿瘤测量的任何轴上安乐死，或达到超过2,000 mm3的肿瘤体积，其中体积=½×最大轴×（最小的轴）（最小的轴），或者在肿瘤注入时指定的肿瘤注入时的体重降低15％，或者在我们的IAC型型脉络脉络中所指定的脉络脉冲，或者在IAC型型幽默的情况下，或者遇到了脉络脉的其他因素，或者是伴有幽默的脉络脉络量。行为障碍（呼吸困难，外观）或肿瘤溃疡占肿瘤表面积超过50％的肿瘤。未通过统计方法预先确定样本量。没有进行随机化和盲。

　　除非另有说明，否则数据点表示个人技术复制。技术重复作为不同的样本进行。没有使用统计方法来预先确定样本量。对于肿瘤曲线比较，比较了曲线测量的面积；对于在研究结束前被安乐死的小鼠，最终的肿瘤体积测量值是通过最终时间点的。在每个实验的峰值减肥当天进行小鼠减肥的比较。补充表1中显示了使用的个别生物学捐助者。

　　在GraphPad Prism 10中进行了图表绘图和统计分析。使用BD FACSDIVA进行流式细胞仪和分类，并使用FlowJO 10.8.0进行了事后门控和分析。使用定制编写的Python脚本进行了成像共定位分析，该脚本报告了Pearson的相关系数（补充数据1中提供）。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。