人外周血单核细胞（PBMC）和血清是从多个同类群体中获得的多个供体获得的，这些供体在扩展数据表1中概述。从所有参与者那里获得了知情同意。所有研究均在芝加哥大学机构审查委员会（IRB; ID＃09-043-A）的批准下进行。IRB在埃默里大学（Emory University）的IRB批准了2009年的PH1N1感染和2009年单价灭活流感疫苗（MIV）同类疫苗。嵌合HA疫苗研究队列被确定为临床试验NCT03300050，有关试验设计的更多详细信息在其他地方概述了4,5。该研究已在当地临床场所获得IRB批准，包括西奈山，杜克大学和辛辛那提儿童医院医疗中心的伊坎医学院。用小鼠进行的所有实验均根据芝加哥大学和西奈山机构动物护理和使用委员会的医学院进行。

　　人类胚胎肾脏HEK293T（女性，＃CRL-11268），Madin Darby Canine肾脏（MDCK;雌性，＃CCL-34，NBL-2）和人类A549（＃CCL-185）细胞被购买并由美国类型文化（ATCC）购买并认证。MDCK-SIAT1细胞先前生成37。在37°C下，所有细胞都保持在5％CO2的加湿气氛中。将HEK293T细胞维持在添加了2％超低IgG胎牛血清（FBS； Invitrogen），1％ - 谷氨酰胺（Invitrogen）和1％抗生素 - 抗生素 - 抗生素抗疾病（Invitrogen）的高级-DMEM中。将MDCK，MDCK -SIAT1和A549细胞保持在补充的DMEM中，该DMEM添加了10％FBS（Invitrogen），1％ - 谷氨酰胺（Invitrogen）和1％青霉素 - 链霉素（Invitrogen）。用NFAT驱动的荧光素酶报告基因（＃G7010）表达FCGRIIIA和FCGRI的Jurkat细胞被Promega获取并验证，并直接用于抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。从供应商接收后未对细胞系进行身份验证，也未对支原体进行测试。

　　如前所述38,39,40，产生单克隆抗体。疫苗接种或感染后大约7天从每个供体获得外周血，或在接种疫苗后28天获得。分离淋巴细胞并使用rosettesep富含B细胞。总质质体（CD3 -CD19+CD27HICD38HI;除2014年四价灭活流感疫苗（QIV）），IgG+plasmablasts（CD3 -CD19+IGM -CD27HICD27HICD38HIIGG+IGA-+IGA-+2014+2014+2014;（CD3-CD19+IGM-CD27HICD38HIIGG-iga+; 2014 QIV队列）或HA+诱饵分数MBC（CD3-CD19+CD27+CD27+CD38LO/+HA+;在030-09M 1B06中）被单杆分为96-well Plelates。通过逆转录酶PCR（RT – PCR）扩增编码免疫球蛋白重链和光链的基因，测序，克隆到人IgG1，人κ链或人λ表达载体，并共转染到HEK293T细胞中。使用蛋白A琼脂糖珠从上清液中纯化分泌的mAb。对于2014年QIV队列产生的mAB，mAb名称包括分类质子出现的原始同种型，所有mAb均表示为人类IgG1。CH5/1结合B细胞（CD19+CD27+CH5/1+）在CH5/1疫苗接种后28天（NCT03300050）从供体中分选。用A/California/04/2009 HA探针（用于030-09M 1B06）或CH5/1探针对细胞进行排序，每个探针均具有Y98F突变，可在B细胞上植入非特异性结合与唾液酸的非特异性结合。MAB重链和轻链序列是从CH5/1诱饵B细胞（IDT）的单细胞RNA测序数据中合成的，并将其克隆到人IgG1，人κ链或人λ表达向量中。通过使用我们的内部软件Vgenes预测的所有V（d）J序列对所有V（d）J序列进行对齐，确定B细胞克隆。使用WEBLOGO41进行共识序列分析，并使用Clustal Omega确定序列比对。

　　所有测定中使用的流感病毒均以特定病原体（SPF）卵在内部生长，收获，纯化和滴定。重组HA，CHA和MINI-HA是从BEI资源或内部产生的。在扩展数据2中使用的重组HA突变蛋白是通过深度突变扫描实验（见下文）的突变产生的（请参见下文），或在其他研究中自然出现的已知突变，或在其他研究中鉴定出了2,10,42,42,42,43,44,44,45,45,45,46,46,47,47,47,48,48,48,48,48,48,48,48,48,515152（Exter）。所有突变均在A/California/7/2009的HA上进行，并在HEK293T细胞中表达，并使用Ni-NTA琼脂糖珠（Qiagen）纯化。

　　将高蛋白结合微量固定板（Costar）用碳酸盐缓冲液或重组HA中的8个出血性HA（包括下面描述的HA突变体）覆盖，在4°C下在磷酸盐缓冲液（PBS）中以2μgml-1的形式涂覆。第二天早晨，用PBS 0.05％的Tween洗涤板，并用含有20％FBS的PBS在37°C下被阻塞。然后将抗体串行1：3从10μgml -1开始，并在37°C下孵育1.5 h。辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗人IgG抗体1：1,000（杰克逊免疫研究）用于检测mAb的结合，随后使用超级水库ELISA ELISA底物（EBIISCISCIESCICES）开发板。在微孔板分光光度计（Bio-Rad）上以405 nm的形式测量吸光度。为了标准化测定，每个板上都包括具有已知结合特性的对照抗体，并且当对照的吸光度达到3.0光密度（OD）单位时，就会开发板。所有ELISA均以两次副本进行。为了将抗体定义为靶向H1茎，对MAB进行了测试与CH5/1的结合，该抗体利用了表达H5的病毒和PH1N1病毒的茎结构域的头部结构域，并利用PH1N1病毒53的茎结构域，以及针对PH1N1（A/CALICALIA/2009）的Haemagglutination抑制（HAI）活性。绑定CHA和缺乏HAI活性的单元格被归类为结合HA茎域的单元。为了对抗原特异性进行分类，未明确结合与HA头或茎的mAb被列为结合未知的HA+表位。通过执行非线性回归，使用Prism 9（GraphPad）计算了在摩尔浓度（M）下以分离常数（KD）表示的亲和力测量值。所有实验均以两次重复和技术复制进行两次。

　　将板与50 µL的A/California/2009 HA涂层，浓度为1 µg mL -1，并在4°C下孵育过夜。为了生物素化，将具有已知表位特异性的抗体，CR9114（CS表位）和047-09-4F04（锚式表位）在4°C下与EZ-link Sulfo-NHS-Biotin（Thermo Scientific）在4°C下孵育24 h或48 h或48 h，分别在使用前使用。在37°C下用含有20％FBS的PBS阻塞板后，将血清样品孵育（人血清的1:50的稀释度或MAB的20μgml -1的稀释度）在室温下孵育2小时。然后，将生物素化的CR9114或047-09 4F04添加，浓度等于其KD的两倍，并在室温下与血清或MABS在井中孵育2小时。在添加Zeba旋转脱盐柱，7 K MWCO（Thermo Scientific）之前，将生物素甲基化的抗体脱盐。洗涤板后，将井与HRP偶联的链霉亲和素（Southern Biotech）在37°C下孵育1小时，以检测生物素胆碱化的抗体。然后添加超级水库ELISA底物（EBIOSCIENCES），并在微孔板分光光度计（Bio-Rad）上以405 nm的形式测量吸光度。为了标准化测定，将生物素化的CR9114或047-09 4F04在每个板上的指定井中孵育而没有任何竞争血清或MAB，并且当这些井的吸光度达到1-1.5个单位时，记录了数据。减去背景后，通过将观察到的样品的OD除以所达到的OD的OD来确定血清样品竞争百分比，从1的O​​D除以从1中减去该值，然后从1中减去100。对于血清数据，通过PRISM软件（GraphPad）对非线性回归进行对数进行对数转换和分析，以确定非线性回归以确定EC50值。对于图4和扩展数据图5，仅包括所有时间点血清的供体。所有实验均以两次重复和技术复制进行两次。

　　High-protein binding microtitre plates (Costar) were coated with 10 μg ml−1 calf thymus double-stranded DNA (dsDNA; Thermo Fisher Scientific), 2 μg ml−1 Salmonella enterica serovar Typhimurium flagellin (Invitrogen), 5 μg ml−1 human insulin (Sigma-Aldrich), 10 μg ml−1PBS中的KLH（Invitrogen）和10μgml-1大肠杆菌LPS（Sigma-Aldrich）。将板涂在100％乙醇中的10μgml -1心磷脂中，并允许干燥过夜。用水洗涤板，并用PBS，0.05％Tween和1 mM EDTA封闭。将mAb在PBS中稀释1μgml -1，并连续稀释四倍，并将其添加到板中1.5 h。洗涤板，将山羊抗人IgG-HRP（Jackson Immunoresearch）在PBS中稀释1：2,000，二元和1 mm EDTA。用水洗涤板，并用PBS，0.05％Tween和1 mM EDTA封闭5分钟。再次用水洗涤板，并用超级水库ELISA底物（EBISOSCIENCE）开发，直到阳性对照mAb 3H9（参考文献54）达到3的A450。所有实验均以重复和技术复制进行两次。

　　先前描述了此处使用的突变库55。这些文库由所有单个氨基酸突变组成，以a/wsn/1933（H1N1）组成。实验是通过使用生物学的一式三份文库进行的。如先前概述的56，进行了045-09 2B06的突变抗原分析（CS表位结合单元）。简而言之，将106个病毒文库生物学复制的106个组织培养剂量50（TCID50）在1 mL中稀释在IgM中（添加了0.01％FBS，0.3％BSA和100​​ mg ML-1钙钙的0.01％FBS，氯化钙），并以045-09 2body的浓度在045-09 2BODY的浓度上孵化。37°C时1.5 h。MDCK-SIAT1细胞被病毒抗体混合物感染。感染后两个小时，去除培养基，用1 mL PBS洗涤细胞，并加入2 mL新鲜IgM。Fifteen hours post-infection, viral RNA was extracted, reverse-transcribed using primers WSNHA-For (5′-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAAC-3′) and WSNHA-Rev (5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTCCTTATATTTCTG-3′), and PCR amplified according to the如前所述55，条形编码 - 取消库的制备。如前所述56，使用针对病毒核蛋白（NP）和细胞GAPDH的定量RT – PCR（QRT -PCR）估算了存活抗体中和的整体部分。使用病毒文库的十倍连续稀释液，我们没有选择抗体选择的细胞作为感染性的标准曲线。与病毒 - 抗体混合物样品相比，来自标准曲线样品的QPCR CT值是针对NP和GAPDH的。然后，我们生成了一个线性回归，以适合标准曲线样品的NP和GAPDH CT值之间的差异，然后使用此曲线插值插入抗体 - 病毒选择样品的分数。在三个文库重复中，存活的抗体选择的比例为0.17、0.1和0.14。

　　使用DMS_Tools2版本2.4.12软件包57分析Illumina（R）深层测序数据，可以在https://github.com/jbloomlab/dms_tools2上找到。使用的计算机代码位于https://github.com/jbloomlab/2b06_dms，执行大多数分析的Jupyter Notebook在https://github.com/jbloomlab/2b06_dms/blob/blob/blob/master/master/Analsisy_notebook.ipynb。处理测序计数以估计每个突变的差异选择，这是该突变的对数富集在抗体选择的条件下与对照56相比。2B06在每个突变上施加的差分选择的数值测量值可以在以下网址找到：https：//github.com/jbloomlab/2b06_dms/blob/blob/master/master/results/results/diffsel/diffsel/tidy_difffiffsel.csv。

　　先前确定了A/WSN/1933（H1N1）HA的氨基酸偏好55。简而言之，通过在MDCK-SIAT1细胞中以低多重感染的方式传播病毒文库来进行深度突变扫描。在对所得病毒进行深度测序后，使用Python软件包DMS_Tool（http://jbloomlab.github.io/dms_tools/）确定氨基酸偏好，版本1.1.12。该程序将亚复杂子读取为参考HA序列，计算每个氨基酸位点的突变数，并根据突变计数计数预选前和选择后确定氨基酸偏好。

　　如前所述58,59进行了MAB表征的微中和化测定。MDCK细胞在补充有10％FBS，1％青霉素 - 链霉素和1％ - 谷氨酰胺的DMEM中，在37°C下，使用5％CO2。实验的前一天，将25,000个MDCK细胞添加到96孔板的每个孔中。将两倍的mAb串行稀释液与等体积的100 TCID 50病毒混合1小时，并在37°C下添加到MDCK细胞中1小时。除去混合物，并在37°C下用1倍的MEM培养细胞20小时，并补充有1μgml-1 tosyl苯基苯基苯基氯甲基酮（TPCK）处理的胰蛋白酶和适当的MAB浓度。用PBS洗涤细胞两次，在-20°C下用80％冰冷的丙酮固定至少1小时，用PBS洗涤3次，用3％BSA – PBS固定30分钟，然后用2％H2O2处理30分钟。将细胞与小鼠抗NP抗体（1：1,000; Millipore）在室温下在3％BSA – PBS中孵育1小时，然后在3％BSA – PBS中在室温下在3％BSA – PBS中孵育山羊抗小鼠IgG HRP（1：1,000; Southern Biotech）。用超级水库ELISA底物在405 nm处开发板，直到仅病毒对照达到1的OD为1为止。未感染的井中的信号平均代表100％的抑制作用。平均无具有MAB的感染井中的信号表示为0％的抑制作用。复制井用于计算平均值和S.D.中和，半最大抑制浓度（IC50）由乙状结肠剂量 - 反应曲线确定。将抑制比（％）计算为：（（OD阳性对照 - OD样本）/（OD阳性对照 - OD阴性对照））×100。最终IC50使用Prism软件（GraphPad）确定。所有实验均以两次重复和技术复制进行两次。

　　将每孔播种在96孔细胞培养板（Corning）中，第二天早晨使用细胞进行中和测定。从30μgml -1开始制备抗体稀释液，随后在1x MEM中稀释三倍。将每个稀释度与10,000个冷适应的A/Ann Arbor/6/1960（H2N2）病毒的10,000个形成斑块形成单位（PFU）在室温下1小时混合。1小时后，将细胞用PBS洗涤，并在37°C下将100μl抗体 - 病毒混合物洗涤1小时。接下来，除去抗体 - 病毒混合物，并将60μl包含TPCK的1倍MEM添加到每个孔中。在每种相应的抗体稀释液中，还将60μL添加到每个孔中，并将细胞在33°C下孵育3天。在第三天，使用火鸡红细胞进行血凝测定法以评估每种抗体稀释时的HAU。

　　通过腹膜内注入0.2、1和5毫克每千克MAB鸡尾酒，将MAB鸡尾酒（扩展数据图2b）被动地转移到6-8周龄的女性BALB/C小鼠（杰克逊实验室）中，在补充对照小鼠中进一步详细介绍了5 mg每kg iS kg sharax spectiby specipial speciby speciby speciby mabip abab i。在感染前2小时给予MAB进行预防治疗，并在感染后48小时进行治疗。对于A/荷兰/602/2009的预防性mAb研究（图3a），用异氟硫里硫酸盐对小鼠进行了麻醉，并用10个致命的剂量50（LD50）的小鼠适应的A/602/2009 H1N1 Virus和10 ne ne ne ne nous insive insive insive insive insive in ne verus（n n n ive insertiment）挑战。为了治疗A/Netherlands/602/2009和A/A/Fort Monmouth/1/1947的预防治疗，用氯胺酮 - 羟嗪 - 水鸡尾酒进行了麻醉，每千克氯酸盐和0.15 mg氯胺酮和0.03 mg xg xylazine; xg xylazine;A/荷兰/602/2009或A/A/Fort Monmouth/1/1947。读出，每天1-2次监测生存和体重减轻2周。小鼠在体重减轻25％或实验结束时（挑战后14天）对小鼠进行了。根据先前执行的功率分析，每次实验每个条件进行了五只小鼠。数据汇总以进行分析。

　　为了确定肺病毒载量的差异，如上所述，以预防性给予每公斤5 mg抗体鸡尾酒。在MAB给药后两个小时，将小鼠（每组n = 5只小鼠）麻醉，并在A/荷兰/602/2009的1 LD50上挑战术。在感染后第3天和第6天收集肺，通过斑块测定确定均质和病毒载荷。所有实验均根据芝加哥大学和西奈山机构动物护理和使用委员会的伊坎医学院进行。动物研究未盲目或随机。

　　为了确定小鼠肺组织中的病毒载量，进行了标准的斑块测定。MDCK细胞的汇合单层被均质的肺组织的连续稀释液感染，范围从1：10到1：1,000,000，在1x MEM中稀释（1％青霉素 - 链霉素抗生素混合物，1％HEPES，1％ - 谷氨酰胺和1％含钠含量的含量含量含量含量含量），每个1％shake in 33 33333333333333333的333333。之后，将含有2％Oxoid琼脂（Thermo Fisher），H2O，2X MEM，DEAE和TPCK处理的胰蛋白酶的覆盖层添加到细胞中。将板在33°C下孵育3天，然后在4°C下用3.7％多聚甲醛固定过夜。通过免疫染色可视化斑块。在这里，除去琼脂叠加层，并用3％的牛奶和PBS封闭板。去除阻塞溶液，并将稀释液（H1N1豚鼠抗抗生体（H1N1豚鼠抗抗生素（在内部产生））添加1％的牛奶和PBS中1小时。将板用PBS和二级抗体和二抗抗体（抗小鼠IgG H＆l Peroxidase固定（Rockland）延长1％：3,000％的奶料和1％奶中的PBS和二级抗体（抗小鼠IgG H＆l鼠）均添加了1％和PBS。使用PBS三次，并使用KPL TrueBlue过氧化物酶底物（Seracare）开发。

　　将A549细胞保存在补充了10％FBS，10 U ML-1青霉素和10 mg ML-1链霉素的DMEM中，并将96孔的白壁板（Costar）铺板为2.5×105细胞，每ML在37°C下为5％CO2，每毫升均为一夜之间。第二天，将细胞用PBS洗涤，并在不存在TPCK处理的胰蛋白酶的情况下用A/602/2009感染了5个在UltramDCK培养基（LONZA）中的感染5。24小时。在测定缓冲液（rpmi 1640补充了4％超低IgG FBS; Gibco）中串行mAb，从60μgml-1开始，并稀释了三倍。吸气细胞培养基，并将25μl测定缓冲液和25μl稀释的抗体添加到每个孔中。用NFAT驱动的荧光素酶报告基因（Promega）稀释至3×106细胞，将25μl的细胞添加到每个孔中，并在37°C孵育6小时6小时，将25μl的细胞添加到每个孔中，将25μl的细胞添加到每个孔中，将25μl的细胞稀释到3×106个细胞中。将板从孵化器中取出，并在室温下放置15分钟。在Bioglo荧光素酶底物（Promega）中，将75μL添加到每个井中，并使用Syngregery H1杂交多模片读取器（Biotek）立即读取发光。使用Prism 8（GraphPad）确定EC50值。

　　将三个mAb（FISW84（PDB：6HJQ），CR9114（PDB：4FQI）和FI6V3（PDB：3ZTN））的足迹映射到一个HA frotomer（使用UCSF Chimera 60和Adobe的一个HA frotomer（A/California/4/4/2009，PDB：4M4Y）上。将HA – FAB复合物的负染色EM图在UCSF嵌合体中对齐，并将估计的足迹映射到一个HA原始物上。HA三聚体的个别录像带以不同的灰色阴影表示。

　　通过与HA（A/California/04/2009与E376K或E376G稳定突变）在室温下2小时的HA（A/California/04/2009与E376K或E376G稳定突变）一起孵育免疫复合物。样品以大约10μgml-1的形式沉积在发光，碳涂层的400网格铜网（电子显微镜科学）上，并用2％w/v的铀酰甲酸甲酸盐染色。将样品以×52,000放大倍率为120 kV成像，在配备Eagle CCD 4K摄像头（FEI）或×62,000放大倍率的Tecnai Spirit T12显微镜上成像200 kV，在Tecnai T20显微镜上配备了CMOS 4K摄像头（TVIPS）。用Leginon收集显微照片，用Appion，Relion和Xquartz处理单个颗粒，并用UCSF Chimera映射足迹，并用UCSF Chimera 60,61,61,62,63制成数字。

　　在室温下，将222-1C06和045-09 2B05 Fab与HA（A/California/7/2009，E376K）孵育1小时。将靶向侧面斑块的045-09 2B05 FAB添加到免疫复合物中，以诱导颗粒翻滚并增加角采样3。使用热渔民玻璃体，将免疫复合物（0.5 mg ML-1）与Lauryl麦芽糖肾上腺糖（5 µm，Anatrace）孵育至发光的AU 1.2/1.3 300网格网格（电子显微镜科学），供7 s和plunge-Froz添加到发光的AU 1.2/1.3 300网格（电子显微镜科学）上。用CETA 4K CMOS摄像机（FEI，总剂量49.92 E/Å2）和Gatan K2 Summit探测器在计数模式下以200 kV Talos Arctica电子显微镜（FEI）和GATAN K2 Summit探测器的200 kV talos电子显微镜（FEI）进行样品成像。使用Leginon，Appion中的MotionCor2和CryoSparc2中的Patch-CTF收集2,243个显微照片，对齐并进行了CTF校正，分别为61,62,64,65。在CryoSparc2中，使用APO HA模板挑选粒子，通过无参考的2D分类选择，并通过3D分类和细化重建。最终地图通过C3对称性和44,224个颗粒解决了全局3.75Å分辨率。数字是在Prism 8（GraphPad）和UCSF Chimera60中制成的。

　　使用ABSY（http://www.absysy.org/absysy/）生成了222-1C06 FAB的预测模型，并与CA09 H1 HA + 045-09 2B05（PDB：7mem）的初始模型一起扩展为EM密度。最初的模型是使用Coot和Rosetta66,67迭代精制的。最终模型使用H3和KABAT编号方案进行编号。最终模型和图是使用Molprobity，Emringer68,69，Phenix和PDB验证服务器评估的。对免疫复合物进行建模后，我们将FAB密度分割为Cryo-EM图中的HA的FAB密度，并在HA密度中映射了222-1C06模型的足迹。冷冻EM数据收集和完善统计数据包括扩展数据表4。

　　将人血清样品在55°C下热灭活30分钟，然后在捕获中孵育选择IgG-FC（MS）亲和力基质（Fisher）在4°C下在旋转器上结合72 h。与IgG结合的树脂的样品以4,000 rpm离心，并收集上清液。将IgG样品用PBS洗涤3次，然后进行离心以去除上清液。将缓冲液交换为含有100 mM Tris，2 mM EDTA和10 mM半胱氨酸的缓冲液，然后用Amicon过滤器离心，然后在37°C下与木瓜蛋白酶孵育4小时，以80 rpm的速度摇动。将消化反应用50 mM碘乙酰胺淬灭，缓冲液与TBS交换，并通过SuperDex 200增加10/300列（GE Healthcare）的尺寸 - 排斥色谱法（SEC）分离。收集Fab和未消除的IgG并浓缩，并在室温下将500μgFab与10μgHA复合18小时。通过SEC纯化反应，并收集并浓缩了免疫复合物。如上所述制备负污渍EM网格。

　　将HEK293T细胞铺在六孔板中，并用0.2μg质粒和10μgml-1 PEI转染过夜。12–16小时后，将培养基替换为PFHM-II（Gibco），并将细胞休息3天。将转染的细胞胰蛋白酶胰，洗涤和等分。用10μgml -1的单个mAb染色30分钟。将细胞洗涤并用抗人IgG FC-BV421染色30分钟。将细胞洗涤两次，并在BD LSRFortessa上运行，并使用BD FACSDIVA软件收集。使用FlowJo V10分析数据。

　　将CH5/1+记忆B细胞（CD19+CD27+HA+）进行分类，并将使用10X基因组铬控制器和制造商的指令（10X Genomics）分类为纳米级凝胶胶珠乳胶（GEMS），以实现单细胞分辨率。根据5'基因表达和B细胞免疫球蛋白富集指导进行分类的单细胞进行处理，以准备库进行测序。在西北大学使用Illumina Hiseq 4000或芝加哥大学的Illumina Nextseq 500对图书馆进行了测序。CellRanger单细胞软件套件（版本3.0）用于执行样本反复编码，条形码处理，以及单细胞5'和V（d）J计数，并且使用CellRanger MkFastQ将其删除层次的原始基础呼叫（BCL）文件中的示例特定FASTQ文件。随后，分别将GRCH38-1.2.0和CellRanger-VDJ-GRCH38-Alta-Alta-Embbl-2.0.0用作转录组和V（d）J组装的参考。CellRanger计数和CellRanger VDJ封装用于识别基因表达并组装V（D）J对抗体。

　　使用Seurat 3工具包（版本3.2.0）分析单细胞数据集。我们为所有20个捐助者（包括细胞质量控制（QC），归一化，高度可变特征，数据缩放和线性尺寸降低）进行了常规的预处理步骤。更具体地说，我们仅保留QC步骤中2500多个检测到的基因的细胞。我们还使用R package linq-View（版本0.99）70中的“软threshold”功能过滤了具有高线粒体基因表达的细胞。我们使用常规日志归一化将RNA数据归一化。我们为每个数据集确定了2,000个高度可变的基因，并在线性降低步骤中进行了原理分析（PCA）。然后，我们整合了来自接种疫苗的参与者的所有20个单细胞数据集，以使用Seurat 3中的锚方法去除批处理效应。在此分析中，我们过滤了数据集，并且仅保留具有转录组和全长以及配对的重链和轻链v（d）J序列（n = 1,952）的细胞。从这些细胞中，我们确定了使用VH1-69基因和κ-Light链的一组“ VH1-69/κ” B细胞，该细胞富含针对BN茎状表位的B细胞。我们还通过以下规则确定了一组“锚点表位”特异性的B细胞：（1）VH基因座：VH3-23，VH3-30，VH3-30-3或VH-3-3-48；（2）VK基因座：VK3-11或VK3-15；（3）JK基因座：JK4或JK5；（4）K-CDR3长度等于10；（5）K-CDR3肽中的“ NWP”模式。

　　PAN-H1保护模型基于从人类，猪和禽类来源分离的不同H1进化枝的共识菌株（在补充表4中列出），如Zhuang等人71所述，并包括欧亚猪的A/Swine/Jiangsu/Jiangsu/J004/2018（参考资料23）。为了生成第1组HA保护模型，我们根据先前的研究72从FludB（https://www.fludb.org/;补充表5）选择了每个组1 HA亚型的一个代表序列。使用Muscle73产生了来自这些HA蛋白序列的多个序列比对，并使用熵Model41定量每个残基的保护。季节性H1保护模型基于1918 - 1957年至1976 - 2019年间循环的H1N1病毒共识菌株（总计59个菌株），这是先前描述的3。使用Liber74和Burke和Smith HA编号72进行氨基酸对齐和H3编号。

　　为了预测所研究的FV片段的结构（222-1C06，FISW84，241 IgA 2f04和SFV009 3G01）使用A/California/4/2009 E47G HA（PDB：7MEM），我们应用了Rosettaantibody67,75,76的程序。使用Protonate 3D工具77,78将FVS质子化。通过利用Amber79,80中的均匀背景等离子体方法来确保电荷中立性。使用Ambertools20的TLEAP工具（参考文献81）封装，将结构模型浸泡在TIP3P水分子的立方水箱中，其最小壁距离为10Å，至protein82。所有抗体模型的参数均来自琥珀色力场14SB83。使用多步平衡协议仔细平衡FV 84。

　　为了增强构象空间的采样，在Gromacs88,89中进行了脾气暴躁的偏置 - 交换元元素85,86,87，并使用了2个实现90。我们选择了元动力学，因为它可以增强对预定义的集体变量的采样。采样是由历史依赖性偏置电位加速的，该偏差电位是在集体变量85,86,91的空间中构建的。作为集体变量，我们使用了一个良好的协议，增强了所有六个CDR循环的正弦和余弦的线性组合，这些cdr循环是用函数进行的，并结合了羽羽2（参考文献90）。如前所述，ψ扭转角捕获了构象转变综合的92。本文提出的基本方法已在各种研究中得到了验证，该研究与大量实验结果93进行了验证。使用PMEMD模块的GPU实现在NPT集合中以300 K进行模拟，以尽可能接近实验条件，并获得蛋白质和水的正确密度分布。我们使用的高斯高度为10.0 kJ mol -1，宽度为0.3 rad。高斯沉积发生每1,000步，使用10个偏置器。为准备好的FV结构进行了500 ns的偏置元元动力学模拟。将所得的轨迹与整个FV对齐，并使用程序CPPTRAJ80,95聚类，使用平均链接层次群集群算法，RMSD截止标准为1.2Å，导致大量集群。使用Amber 20（参考文献81）仿真包装对抗体片段的簇代表进行平衡并模拟100 ns。

　　分子动力学模拟使用琥珀20的PMEMD.CUDA模块在NPT集合中进行（参考文献80）。用摇动算法96限制涉及氢原子的键，允许时间步长为2.0 fs。通过使用Berendsen算法97与外部浴场耦合，通过弱耦合与外部浴室进行大气压力（1 bar）。Langevin Thermostat98用于在300 k处保持模拟过程中的温度。

　　使用获得的轨迹，我们使用python库pyemma 2使用了10 ns的python库2。将TICA应用于确定所研究的Fab片段的最慢运动，因此获得了采样构象空间的动力学离散99。在TICA构象空间的基础上，使用脓肿2使用Markov-State Model100计算热力学和动力学。在溶液中所得的动力学主导式集合被进一步用于预测H1与FVS的相互作用。为了建模复合物并预测结合界面中的相互作用，我们将全长流感HA（PDB：7MEM）的晶体结构用作模板结构。另外，获得的复杂结构进一步最小化并平衡。

　　所有统计分析均使用Prism软件（GraphPad版本8和9）或R的R进行。用于测试的MAB数量的样本量（n）在相应的数字或PIE图的中心表示。相应的图传说中指出了实验的生物重复次数和所使用统计显着性的特定检验的数量。p值小于或等于0.05被认为是显着的：*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001和**** p <0.0001。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。