所有消耗品，例如抗体，化学药品等，都可以在补充表6中的资源清单中找到。

　　所有动物实验均根据使用实验动物的指南进行，并得到上巴伐利亚州政府委员会的批准（Regierungspraesidium Oberbayern；＃02-2018-12）。这项研究中使用的所有小鼠均在6至16周之间，与基因型和实验设置无关。apoe - / - （B6.129p2-apoetm1unc/j; jax菌株：002052），wt（C57BL/6J； JAX菌株：000664），AIM2 - / - （B6.129p2-aim2gt（CSG445）（CSG445）Byg/Jax;（ASC - - / - ; B6.129S5 pycardtm1vmd）和R26-Cag-asc-Citrine（B6.CG-GT（ROSA）26ORTM1.1（CAG-PYCARD/MCITRINE*，-CD2*）; CD2*）; CD2*）; jax strain; jax strain：030744444444444444444444444444444.444444444444444444444444444444444444444444444.44444444444444444444.4444444444444444444444.44444444444444444444.444444。德国）。LDLR - / - ：MX1CRE：C-MYBFL/FL小鼠被饲养并安置在Walter Brendel Center（德国慕尼黑）的动物设施中。从8周开始，将APOE - / - 小鼠喂给HFD（＃88137，SSNIFF）。CGAS - / - （B6（C）-CGASTM1D（EUCOMM）HMGU/J），NLRP1 - / - （DEL（11NLRP1A-NLRRP1C-PS）1SMAS）和NLRP3 - / - / - （C57BL/6J-NLRRP3 TM1TM1）和nlrp3 - / - / - 6J-NLRP3 TM1TM1TMENICE rM and niment and niment and niment and niment and niment and niment。（德国）。

　　在这项探索性研究中，基于瞬态缺血 - 再灌注中风模型的先前结果估算了动物数量，该模型涉及中风后动脉粥样硬化的程度和变异性。在手术期间死亡的所有小鼠中排除了数据。详细的排除标准如下所述。将动物随机分配到治疗组，所有分析均由对组分配的研究者进行。所有动物实验均根据动物研究进行并报告：报告体内实验（到达）指南35。

　　小鼠每天通过口服饲料接受每天接受阿司匹林（20 mg kg-1，sigma aldrich）和rosuvastatin（5 mg kg-1，sigma-aldrich）。在水（无菌DDH2O）中溶解阿司匹林和紫花想蛋白蛋白，并与粉末状饮食（SSNIFF）混合。单个每日推注为500 µL。

　　如我们先前描述的18，APOE - / - 小鼠接受了DNase注射。简而言之，1,000 U重组DNase I（Roche）溶于孵育1倍缓冲液（40毫米Tris-HCl，10 mm NaCl，6 mM MGCl2和1 mm Cacl2和1 mm CaCl2，pH 7.9，在PBS; Roche中稀释，Roche稀释）被静脉注射到静脉内，然后在100°100°dementer in Perfien pergie the the Perighe the the静脉内注射。对照组以与实验组相同的体积，常规时间和时间进行盐水注射。

　　将CASPASE-1抑制剂VX765（DMSO中的库存）溶解在PBS（Belnacasan，Invivogen）中，并在手术前1小时以100 mg kg-1体重的最终体积为300 µl（参考文献18），并以100 mg kg-1体重进行了手术。对照组以与实验组相同的体积，常规和时间进行盐水注射。

　　小鼠接受了两次注射（手术前1小时和手术后1小时）的NLRP3炎性抑制剂MCC950，溶于无菌盐水中，剂量为50 mg kg -1体重（Invivivogen）。将MCC950或对照（无菌盐水）注入最终体积200 µL。

　　AIM2抑制剂4-硫酸钙钙甲烯酸酯最近以Green等人的特征表征。36。将储备溶液（以DMSO为单位）溶解在PBS中，并在手术前1小时以5 mg kg -1的体重为200 µL，腹膜内注射1小时。对照组以与干预组相同的体积，常规和时机进行对照注射（无菌盐水）。

　　源自刺激性嗜中性粒细胞的DNA（有关中性粒细胞刺激和净NET -DNA的分离）以5 µg的最终体积为200 µL（无菌盐水）静脉注射。对照组以与干预组相同的卷，常规和时间安排进行对照组注射（无菌盐水）。

　　使用特异性抗体对LY6G（克隆：1a8，bioxcell）耗尽嗜中性粒细胞。以14 mg kg -1体重的浓度以250 µL腹膜内的浓度施用小鼠。对照组以与实验组相同的卷，常规和时机进行控制IgG注射。

　　将PAD4抑制剂GSK484（100％ETOH中的库存）稀释至最终浓度为4 mg kg -1体重，最终体积为100 µl。GSK484在手术前1小时给药。在超过6小时的存活时间中，对腹膜内进行了第二次大球（4 mg kg-1体重），手术后4小时。对照组以相同的卷，常规和时机为管理对照组注射（无菌盐水）。

　　小鼠在手术前1小时和手术后1小时，在无菌盐水中进行了两次注射抗IL-1β（克隆：B122，生物XC）。抗IL-1β或相应的IgG对照以4 mg kg-1体重的最终体积为200 µl，以4 mg kg-1的体重注入腹膜内。

　　图1A中提供的分析是使用来自德国急性缺血性中风患者的两个多中心前瞻性观察性医院队列研究（Proscis和Demdas/DeDemas）进行的。所有患者均提供了书面知情同意。补充表1提供了患者特征。研究方案和详细的基线患者特征先前已描述为13,14。基本的人口统计学和中风相关特征如下。简而言之，对于Proscis和Demdas/DeDemas队列，在过去7和5天中证实了18岁或以上的急性缺血性中风和症状发作的急性缺血性中风的患者。中风后3和12个月，Proscis的患者接受了后续电话访谈，而Demdas/Dedemas的患者在中风后3个月进行了电话采访，并在中风后6和12个月对医生进行了面对面的访谈和检查。目前分析的关注结果包括在中风后的头12个月内发生复发性缺血性中风或短暂性缺血性攻击，这是由患者自我报告并记录在他们的病历中的。

　　预期在2018年6月至2020年12月之间，在汉诺威医学院的神经病学和心胸部移植和血管手术系中，预期在神经病学和心胸部移植和血管手术系中前瞻性地招募了计划进行颈动脉内膜切除术的患者。在标准的中风诊断之后，排除了动脉和同时的中风病因，包括颅骨计算机断层扫描和/或MRI，计算机断层扫描或MR-Angiography，Transthoracic或Transopophopophegeceal Echopartiography，心脏超声心动图，心脏节奏性节奏和多普勒/Duplex Ultrasound。在手术前立即抽取周围静脉血液，并将EDTA全血样品用于流式细胞仪分析。在颈动脉内膜切除术期间获得颈动脉斑块样品，并立即保存在PBS中。在收集的同一天，将血液和组织样品均进行进一步分析。所有患者均提供了书面知情同意书，汉诺威医学院的伦理委员会批准了这项研究。

　　招募了13例有症状的患者和7例无症状，高级颈动脉狭窄的患者。中位年龄为73岁（25-75％：62-80岁）。有关临床和人口统计患者详细信息，请参见补充表2。

　　2016年9月至2018年2月在慕尼黑德国心脏中心和Klinikum Rechts der Isar（均在慕尼黑技术大学）之间，前瞻性地招募了St-Elevation心肌梗塞（STEMI）的患者。补充表3中提供了患者特征。

　　STEMI的诊断是基于过去12小时内的胸痛，在至少两个末端或至少两个胸部导线中，持续的ST段高度为1 mm或更多，并根据心脏导管的1型心肌梗塞的诊断。排除标准为：心脏病性休克，左心室射血分数为35或更少，共存的慢性或炎症性疾病，抗炎药疗法（例如，皮质醇）和2-5型的心肌梗死。入院后立即在EDTA管中收集血浆分析的血液样本，或在冠状动脉干预后6小时收集。

　　年龄匹配和性别匹配的患有已知稳定冠状动脉疾病的患者用作对照。他们在2017年2月至2018年2月之间在德国心脏中心慕尼黑门诊咨询期间进行了预期招募，以进行常规检查。排除标准是：心肌梗塞史，左心室射血分数减少，慢性或炎症性疾病以及抗炎药疗法。在门诊部咨询当天，在EDTA管中收集了血浆分析的血液样本。所有患者均提供了书面知情同意书，慕尼黑技术大学的机构伦理委员会批准了这项研究（235/16S）。在收集后，将STEMI和对照患者的EDTA试管在4°C和1,600G下离心30分钟。血浆等分试样存储在-80°C以进行进一步分析。

　　如前所述进行串联狭窄手术。简而言之，在HFD启动后4周，APOE - / - 小鼠（C57BL/6J背景）在30％和70％N2O的混合物中递送2％。在脖子上切开一个切口，并从圆周结缔组织中阐明了正确的颈动脉。为了控制狭窄直径，将150 µm或450 µm的虚拟置于裸露的右颈动脉的顶部，距离分叉的远端1 mm，距远端狭窄的近端为3 mm。随后，在动脉和针头均绑有6-0架的聚酯纤维缝合线，然后小心去除销钉。双联狭窄手术后，用HFD喂食动物额外4周。

　　对供体动物（B6.129P2-AIM2GT（CSG445）BYG/J或C57BL/6J）被安乐死，并在冷PBS中收集了股骨，胫骨和肱骨。从骨骼中分离出骨髓，并通过40μm细胞滤网过滤以获得单细胞悬浮液。洗涤后，使用自动细胞计数器（Countess 3，Thermo Fisher Scientific）和锥虫蓝溶液（Merck）评估细胞数和活力。将细胞静脉注射到MX1CRE中：C-MYBFL/FL受体小鼠（LDLR - / - 背景；每只小鼠8–15×106细胞），总体积为100 µl盐水。在移植时，以前已经用聚（I：c）溶液以10μgG -1体重的剂量治疗接受者小鼠每隔一天五次诱导骨髓耗尽38。将小鼠用HFD喂食，并在移植后维持4周，以建立有效的骨髓再填充。

　　串联狭窄手术四周后，将APOE - / - 小鼠用2％的异氟烷​​和70％N2O的混合物递送2％。在耳朵和眼睛之间进行切口，以暴露颞骨。将小鼠放置在仰卧位，并将激光多普勒探针附着在大脑中部动脉（MCA）领域上方的头骨上。通过中切口暴露了常见的颈动脉和左外颈动脉，并进一步分离并结扎。将2毫米硅涂层的细丝（Doccol）插入内部颈动脉中，轻轻向MCA前进，直到感觉到抗性，并通过相应的血流减少（即激光多普勒多普勒流动信号的降低80％或更多）证实闭塞。闭塞60分钟后，将这些动物重新纳入并去除细丝。恢复后，将小鼠放在家居笼子里，并随意获取水和食物。假手术的小鼠接受了相同的手术手术，但丝被移除以代替向MCA前进。在所有小鼠中，通过反馈控制的加热垫在整个手术中保持体温在37°C。排除标准包括：（1）MCA闭塞不足（血液流量降低至基线值的20％以上），（2）手术期间的死亡，以及（3）通过组织学分析缺乏脑缺血后的脑缺血后。

　　如先前所述39进行了心肌梗塞手术。简而言之，在MMF麻醉下进行插管（咪达唑仑5.0 mg kg -1体重，盐酸二甲米丁1.0 mg kg -1体重和柠檬酸柠檬酸0.05 mg -kg -1体重；内侧旋转），胸腔切开术在左室内术中进行。鉴定出左前降冠状动脉，并通过以8-0的prolene缝合线结扎来诱导心肌梗塞。盐酸阿atamezole（5 mg kg -1体重）和皮下注射的氟马兹尼il（0.1 mg kg -1体重）用于拮抗MMF麻醉。小鼠接受皮下丁丙诺啡（0.3 mg kg -1体重），每8小时一次镇痛，持续3天，从手术程序结束开始。

　　用高频超声成像系统（VEVO 3100LT，Visual Sonics）测量ApoE - / - 小鼠中的颈动脉血流，并在串联狭窄手术后和每周4周后使用40-MHz线性阵列传感器（MX550D，Visual Sonics）和40-MHz线性阵列传感器（MX550D，Visual Sonics）进行测量。将小鼠用异氟烷递送为30％O2和70％N2O的混合物进行麻醉。从CCA的两侧记录了B模式，颜色多普勒模式和脉冲多普勒速度光谱。对于右CCA（RCCA），检查了五个位置：在接近近端连接之前，在两个连接之间，两次连接之间，几乎远端连接且远端连接以上。对于未连接的左CCA（LCCA），仅测量了三个位置：LCCA的近端，中部和远端。用样品体积校准确定脉冲多普勒速度，以覆盖整个血管腔，以及在流动方向和超声梁之间的最小截距角（小于60°）。从双方的CCA中记录了峰值收缩速度（PSV）和末端舒张期（EDV）。Vevolab v3.2.0软件用于超声成像分析。平均速度计算为：平均速度=（PSV+2×EDV）/3。

　　在假手术后2和7天，在一个小动物扫描仪（Mediso的3T纳米斯坦PET/MR，MEDISO，内径为25毫米）中进行了MRI。对于扫描，将小鼠用1.2％的异氟烷​​在30％o2 //的70％N2O中通过口罩应用。通过腹部压力敏感垫和直肠探针连续监测呼吸速率和体温（37±0.5°C），并调整麻醉以使其保持生理范围。获得以下序列：冠状T2加权成像（2D快速回声（FSE），重复时间/回声时间（TR/TE）= 3,000/57.1 ms，平均14，分辨率167×100×100×500 µm3），冠状T1-Wighted Imution（2D FSE（2D FSE）（2D FSE）（2D FSE，TR/TR/TE/TE/TE = 610）167×100×500 µm3）和扩散加权成像（2D自旋回波，TR/TE = 1,439/50 ms，平均值4，167×100×100×700 µm3）。然后使用Image J对MRI图像进行后处理。

　　如前所述24进行MRI。简而言之，在O2/N2O（30/70）的混合物中使用异氟烷对小鼠进行麻醉，并在所有过程中保持在麻醉下，同时保持体温为37°C。在MRI之前，将小鼠进行尾静脉导管插入DNA和基于微基质的磁性颗粒（M3P）的给药。使用BioSPEC 7T TEP-MRI系统和表面线圈（Brukery）进行MRI。使用TOF序列获得了成像数据，以可视化血管结构，用于铁敏感成像的T2*加权序列以及用于组织对比的T2加权序列。对于T2*加重序列，TR/TE = 50/8.6 ms的MRI参数设置为TR/TE = 12/4.2 ms，TR/TE = 50/8.6 ms，TR/TR/TR/TR = 3,500/40 ms对于T2加权序列。T2*加权图像使用ImageJ软件校正后校正后，作为四片（最小强度）的堆栈表示。

　　用氯胺酮（120 mg kg-1）和甲苯嗪（16 mg kg-1）深度麻醉小鼠，并通过50 mM EDTA（Sigma-Aldrich）的右心室穿刺通过心脏穿刺来抽取静脉血液；通过以3,000g离心分离血浆15分钟，并在-80°C下储存直至进一步使用。心脏穿刺后，立即用冰冷的盐水心铁灌注小鼠。随后，将来自两侧的CCA以及主动脉弓和心脏仔细分离并嵌入在化合物（OCT，Tissue-Tek）中，冷冻在干冰上，并存储在-80°C下，直到切片。

　　头部在肩膀上方切下。将皮肤从头部上移开，并从骨头上剥去肌肉。去除下颌骨和颅骨上颌骨后，整个颅骨的整个大脑在4°C下被4％多聚甲醛（PFA）固定。随后，将样品转移到pH 7.4时0.3 m EDTA（C. Roth，292.94 g mol -1）的脱钙化溶液中，并存储在4°C下。3天后更改EDTA解决方案。将样品浸入PBS中30％的蔗糖中，然后将其冷冻在-20°C的异戊烷（Sigma-Aldrich）中。在前旋转水平上获得冠状切片（15 µm厚）进行免疫组织化学分析。将切片安装在SuperFrostplus载玻片（Thermo Scientific）上，并存储在-80°C中。

　　从50 mM EDTA管中抽取的心脏穿刺的小鼠静脉血液。之后，将样品在室温下以1,500克离心10分钟。分离血浆，转移到新的管子上，并再次以3,000克置于10分钟。然后仔细收集血浆，并在-80°C下立即冷冻直至进一步处理。

　　颈动脉（5 µM）冷冻切除术在100 µM的间隔内用山马妥蛋白和曙红（H＆E）染色。连续部分通过Picro Sirius红色染色（ABCAM）评估了总胶原蛋白含量。对于免疫荧光染色，用4％PFA固定冷冻切除术，然后使用含有1％BSA（Sigma），0.1％冷鱼皮明胶（Sigma-Aldrich），0.1％Triton X-100（Sigma）（Sigma）和0.05％Tweeen-20（Sigma）（Sigma）（Sigma-Aldrich）的2％山羊血清阻塞缓冲液进行抗原阻滞。Next, sections were incubated overnight at 4 °C with the following primary antibodies: rat anti-mouse CD68 (1:200; ab53444, Abcam), mouse anti-mouse smooth muscle actin (1:200; ab7817, Abcam), rabbit anti-mouse Ki67 (1:200; 9129S, Cell Signaling), mouse anti-mouse caspase-1 (1:200;AG-20B-0042-C100，脂肪生成），绵羊抗Von Willbrand因子（1：100; AB11713，ABCAM），大鼠抗CD31（1：200; BM4086，origene）和抗胶原I（1：250; AB279711，ABCAM）。After washing, sections were incubated with secondary antibodies as following: AF647 goat anti-rat (1:200; Invitrogen), Cy3 goat anti-mouse IgG H&L (1:200; Abcam), AF594 goat anti-rabbit (1:200; Invitrogen), AF488 goat anti-mouse (1:200; Invitrogen) and AF594 donkey anti-sheep（1：200; Invitrogen）。通过与DAPI孵育（1：5,000； Invitrogen）进行可视化核的可视化核。最后，将切片与荧光量介质（Sigma-Aldrich）安装。使用ZEN2软件（Blue Edition）使用共聚焦显微镜（LSM 880和LSM 980； Carl Zeiss）进行免疫荧光样品的显微照片。将组织学切片用落叶显微镜（Axio Imager M2，Carl Zeiss）成像，并使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）进行量化。

　　为了在对侧半球中可视化可疑的继发性梗塞病变，首先将脑切片（15 µM）染色用于氟玉C（FJC），以鉴定退化的神经元。根据制造商的说明，使用Fluoro-jade C现成的染色套件（TR-100-FJ，BioSensis）进行FJC染色。To confirm the secondary lesion, double staining of the microglia marker Iba-1 (1:200; FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) and terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling (TUNEL) staining was performed using the Click-iT Plus TUNEL Assay for In Situ Apoptosis Detection (Alexa Fluor 647 dye, C10619, Thermo Scientific) according to the制造商的说明。将脑样品在落叶显微镜（Zeiss Axiovert 200M，Carl Zeiss）和共聚焦显微镜（LSM880，Carl Zeiss）上拍摄。

　　如前所述15评估了斑块脆弱性。简而言之，在H＆E染色部分中分析了Intima，Intima，培养基和坏死区域。坏死芯被定义为在形成的纤维帽下方没有核的区域。在Picro Sirius红色染色部分上量化了胶原蛋白含量。将漏洞指数（VPI）计算为VPI =（DECROTIC CORE面积+％CD68面积）/（％平滑肌肌动蛋白面积+％胶原蛋白面积）。

　　将孤立的CCA样品与消化缓冲液混合，由XI型胶原酶（125 U ML-1，C7657），透明质酸酶1-S型（60 U ML-1，H3506），DNase I（60 U ML-1，D5319），DNase I（60 U mL-1，H3506），colagenase I型I型I（450 U ml-ML-ML-ML-1，C0;1×PBS40，在37°C下以750 rpm的速度消化30分钟。消化后，将CCA材料通过40 µM细胞过滤器匀浆，在4°C下以500g洗涤7分钟，并重悬于流式细胞仪染色缓冲液（00-4222-26，Thermo Scientific）中以产生单细胞悬架。将细胞悬浮液与流式细胞仪抗体一起孵育，并使用光谱流式细胞仪（Northern Light，Cytek）进行分析。或者，将细胞悬浮液与荧光抑制剂探针660-YVAD-FMK（＃9122，免疫化学技术）一起孵育，以在活细胞中标记活性caspase-1。补充表6的资源表中可用用于流式细胞仪分析的详细抗体列表。

　　对于中性粒细胞流式细胞术，将CCA单细胞悬浮液（见上文）或完整的EDTA血液与CD45特异性，CD11b特异性，LY6C特异性，LY6G特异性和Citrullatined组蛋白3（CITH3）（CITH3） - 特定于特异性抗体以及使用光谱流式流动仪分析的孵育。中性粒细胞定义为CD45+CD11b+Ly6ghigh细胞。通过CITH3检测来定义中性粒细胞激活。

　　补充图2中提供了单个流式细胞仪实验的代表性门控策略。

　　循环白细胞在中风手术前的静脉内施用抗CD45抗体41（Efluor450，克隆：30-F11，Ebioscience）。中风后二十四小时，为排除CCA中的血液污染，在安乐死前3分钟静脉注射了抗CD45抗体（APC – CY7，克隆：30-F11，Biolegend）。然后，CD45 Efluor450阳性但APC-CY7阴性人群被认为是“浸润的白细胞”人群。

　　仔细隔离同侧和对侧CCA材料，并在干冰上捕获。用RIPA裂解/提取缓冲液与添加蛋白酶/磷酸酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific）裂解整个冷冻CCA。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对总蛋白进行定量。通过SDS-PAGE分馏全组织裂解物，并转移到聚偏二氟乙烯膜（Bio-Rad）上。在含有4％皮肤英里粉末（Sigma）的TBS-T中阻塞1小时（TBS-T（TBS，具有0.1％Tween-20，pH 8.0），用TBS-T洗涤膜，并与以下抗体的主要抗体一起孵育：小鼠抗caspase-1（1：1,000，Invitrogen）。将膜用TBS-T洗涤3次，并在室温下与辣根过氧化物酶偶联的抗兔或抗小鼠二抗（1：5,000，Dako）一起孵育1小时。用TBS-T将膜洗涤3次，使用ECL底物（Millipore）开发，并通过Vilber Fusion FX7成像系统获得。

　　ASC寡聚进行了以前发表的42。详细说明，从小鼠中分离出骨髓，并用L929细胞调节培养基培养7天。分化后，将细胞在PBS中洗涤，并用100 ng ml -1的脂多糖（LPS）启动4小时。将细胞用250 µg ml -1净-DNA刺激将细胞启动或另外激活2小时。将细胞洗涤在PBS中，并通过刮擦在含有2 mM EDTA的PBS中脱离。离心后，将细胞颗粒重悬于0.5 mL冰冷的缓冲液中，并通过超声溶解。离心以去除大块核后，将20 µl裂解物作为输入存储在低聚之前。缓冲液A被添加到剩余的裂解物中；离心后，将上清液用CHAP缓冲液稀释，并通过进一步的离心液颗粒。将蛋白质在室温下交联30分钟，其中50 µL含有4毫米二甲酰二酰亚胺的CHAPS缓冲液。在离心颗粒中重悬于Laemmli缓冲液中，并在70°C煮沸10分钟。将样品加载到SDS-PAGE上，并在150 V处分离。在4°C下进行转移，100 V进行1小时，并用TBS-T中的4％BSA封闭膜。将膜与抗ASC抗体（AL177，脂肪生成）在4°C下孵育过夜，在TBS-T中洗涤3次，并在室温下与山羊抗RB辣根过氧化物酶抗体一起孵育1小时。洗涤和检测图像后，将膜与肌动蛋白 - 抗体在室温下重新孵育1小时，并通过洗涤，二抗和成像进行。

　　仔细隔离CCA组织样品，并在干冰上捕获冻结。整个冷冻CCA用细胞裂解缓冲液（＃895347，研发系统）裂解。然后，根据制造商的说明（MLB00C，R＆D系统），通过ELISA测量了总CCA裂解物中IL-1β的浓度。通过Imark微型读取器（Bio-Rad）测量450 nm处的吸光度。

　　根据制造商的说明，使用明胶Zymogroghy（Novex TM 10％Zymography Plus蛋白； Zy00100box，Thermo Scientific）分析CCA组织提取物。CCA组织用细胞裂解缓冲液裂解（＃895347，研发系统）。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对总蛋白进行定量。将适当稀释的组织提取物的等分试样以20 µL的总体积加载在凝胶上。电泳后，将凝胶在1×Zymogram Remogram Remogram Remogragry Ruffer（LC2670，Invitrogen）中孵育30分钟，并轻轻搅拌。之后，将Zymogram重新定性缓冲液倒入，并将1×Zymogram的发展缓冲液（LC2671，Invitrogen）添加到凝胶中。然后在室温下以轻轻的搅拌在室温下将凝胶平衡30分钟。用1×Zymogram开发缓冲液进行额外洗涤后，将凝胶在37°C下孵育过夜。用胶体蓝色染色试剂盒（LC6025，Invitrogen）染色，并在凝胶扫描仪上获得。收集BMDM培养基，并以总体积为25 µL，在明胶酶学凝胶上加载。使用与组织样品相同的方案分析BMDM培养基中的MMP活性。

　　如先前所述，对CCA切片进行了MMP2和MMP9的原位酶学8。将DQ-高素（D12054，Invitrogen）溶解在反应缓冲液中（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，5 mM CaCl2和200 mM叠氮化钠，pH 7.6）。将冷冻切片（5 µm）与含明胶的反应缓冲液一起在37°C下孵育2小时。将阴性对照切片与MMP抑制剂1,10-苯胺碱（Sigma）预孵育1小时。用DAPI染色核。用×20放大倍率（Carl Zeiss）的Axio观察者Z1显微镜检测MMP活性。数据显示为归一化的MMP强度（归一化的MMP区域= MMP+区域/Intima区域）。

　　嗜中性粒细胞是由胫骨和股骨产生的。在胫骨和股骨分离和解剖后，使用柱塞和1-ml注射器填充有无菌1×PBS的1-ml注射器，将骨髓从骨骼从骨骼冲洗出来。用PBS洗涤紧张的骨髓细胞，并用5％BSA重悬于1×无菌PBS中。之后，根据制造商的说明，使用中性粒细胞隔离试剂盒（130-097-658，Miltenyi）分离中性粒细胞。在RIPA 1640（GIBCO）中，将1×107的细胞铺在150毫米培养皿上，补充了10％FBS和1％青霉素 - 链霉素。

　　对于净-DNA的产生，将2×107细胞（有关隔离，请参见上文）在经过150毫米组织培养的菜肴中培养。然后用100 nm佛波尔12-饱和13-乙酸盐（PMA）刺激细胞过夜。第二天，将上清液从培养皿中取出，并通过一种离心协议处理，用于隔离网络– DNA。将细胞培养的上清液以500克离心10分钟，然后将上清液保存并以15,000克的速度再次离心10分钟。将上清液倒入，并将颗粒（Net-DNA）解析在50 µL无核酸酶的水中。然后按照制造商的说明，将Net -DNA用荧光DNA探针DRAQ5（Alexa 647; Thermo Fisher）标记。

　　对于中性粒细胞的体内血清刺激，将3×105细胞培养在12孔板中。然后将细胞用15％血清中的卒中或假手术小鼠处理4小时。作为阳性对照，使用了10 nm PMA。然后洗涤细胞，并立即用3.7％的PFA/蔗糖固定。然后用CITH3特异性抗体染色固定的中性粒细胞，并用1 µM Sytox绿色对NET-DNA染色。

　　在50 mM EDTA 2-ML收集管中抽出心脏穿刺的小鼠静脉血液。样品在长凳上的室温下最多休息15分钟。之后，将样品在4°C下以3,000克离心10分钟。分离血浆，转移到新的管子上，并再次以3,000克置于10分钟。然后仔细收集血浆，并在-80°C下立即冷冻直至进一步处理。我们使用500 µL血浆将CFDNA与柱基套件（血浆/血清无细胞循环DNA纯化试剂盒; 55100; Norgen Biotek）分离。在最后一步中，将DNA从色谱柱中用30 µL缓冲液洗脱。之后，用纳米体分光光度计测量总循环DNA和单链DNA（1000nd，PEQLAB）。使用特定的荧光染料结合DSDNA（HS DSDNA分析套件，Thermo Fisher Scientific），使用量子量2.0荧光计（Invitrogen）获得双链DNA（DSDNA）浓度。按照制造商的说明产生了稀释和标准。

　　使用自动凝胶电泳平台生物分析仪（Agilent）和高灵敏度DNA试剂盒（Agilent）获取DNA分离后循环CFDNA片段的长度分布。使用Bioanalyzer 2100专家软件（Bioanalyzer，Agilent）分析数据。图2H中的数据（鼠标，中风后2-72 h），图3G（中风后6小时），扩展数据图7D（鼠标，中风后24小时），扩展数据（鼠标，心肌梗死后的12或24小时）和扩展数据后的数据8a（静脉dna测量24 h）后，是在注射后生成的。

　　汉诺威医学院（Hannover Medical School）获得了来自无症状/有症状CCA（中风（人类; CCA样本））患者的人类样本（请参阅“颈动脉内膜切除术样本分析的患者队列”）。将全血样品（在EDTA收集管中取血）被运送到慕尼黑（4°C的180分钟或更长的运输时间）。到达后，将每个样品的3毫升以3,000克离心15分钟，并收集血浆并存储在-80°C下。我们使用500 µL血浆将CFDNA与柱基套件分离（血浆/血清无细胞循环DNA纯化试剂盒； 55100，Norgen Biotek）。在最后一步中，将DNA从色谱柱中用30 µL缓冲液洗脱。CFDNA隔离方案的详细信息在补充表4中。

　　在LMU医学中心（德国慕尼黑；“中风（人类; cfDNA甲基化）”）和技术大学医学中心（德国慕尼黑；“ MI（人类）”）收购的人类样品在15-30分钟后在室温下在室内的EDTA中收集。将人心肌梗死样品以1,600g离心30分钟，并收集血浆并在-80°C下储存，直到分离CfDNA。将人卒中样品以1,500克离心10分钟，并收集血浆并将其存储在–80°C下直至进一步加工。

　　用无核酸酶的水稀释小鼠血浆样品。将稀释度以16,500克离心20分钟，然后通过0.22 µm滤光片过滤上清液。然后将过滤后的上清液转移到超速离心液中，并以110,000克置于60分钟。上清液保存为“时期” DNA。重悬于沉淀并测量“囊泡” DNA浓度。

　　我们从17例缺血性中风患者（73.9岁的中值，65.8-87.2岁的65.8-87.2岁的中位数（58.8％）在急诊室入院前，在任何急性治疗或任何急性治疗或干预时（症状开始到症状开始到6.5 h 6.5 h.5 h，2.2-2-2-2-2-2），我们从17例缺血性中风患者（73.9岁的中值，65.8-87.2岁的65.8-87.2岁）收集了血小板血浆血浆（65.8-87.2岁）的血小板血浆。患者的梗塞体积中位数为57.4 mL（四分位间距为40.5–124.0 mL）。

　　从血浆中提取的CfDNA用硫酸盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并如前所述使用两步PCR方案进行扩增，然后进行下一代测序。分析了测序结果，以确定每个基因座的分子比例，该分子带有感兴趣的细胞类型的甲基化模式（通常是完全脱甲基化）。如前所述44，我们使用了脑标志物（神经元，少突胶质细胞和星形胶质细胞的甲基化标记）的鸡尾酒，以及另一个放大免疫和炎性细胞标记的鸡尾酒：中性粒细胞，单核细胞，单核细胞，嗜酸性粒细胞以及T细胞和B细胞45。DNA甲基化分析的原始值（GE ML -1和百分比）在补充表5中。

　　如前所述，分离并培养BMDM。简而言之，从胫骨和股骨发出的bmdms是特心灌注的WT小鼠的。经过仔细分离和解剖胫骨和股骨后，使用柱塞和装有无菌1×PBS的1-mL注射器将骨髓从骨骼中冲洗出40 µm的过滤器。用PBS洗涤应变的骨髓细胞，并重悬于DMEM+Glutamax-1（Gibco）中，补充了10％FBS和1％庆大霉素（Thermo Scientific）并计数。将5×107的细胞铺在150毫米培养皿上。在8-10天的过程中，将细胞分化为BMDM。在分离后的头几天，将细胞补充20％L929细胞条件培养基，作为M-CSF的来源。然后将培养物与5％CO2保持在37°C，直到它们达到90％或更多的汇合。

　　将BMDMS培养8-10天以进行全面分化。然后将细胞在平底组织培养的24孔板中以每孔为2×105个细胞的密度在500 µL的平底培养24孔板中收获，洗涤，计数和播种，然后将其培养至少16小时。然后用LPS（100 ng mL -1）刺激BMDM 4小时。之后，将细胞与中风手术或假手术的WT小鼠（手术后4小时）的血清孵育，总体积为25％，持续1小时。对照处理的BMDM仅接受含FBS的培养基。之后，将细胞裂解物收集在RIPA缓冲液中，并在-80°C下储存直至进一步加工。

　　对于MMP分泌，将上清液刺激后丢弃并用无菌PBS洗涤细胞，以确保细胞上没有剩余的血清。之后，将500 µL无血清DMEM添加到BMDM中，然后将其在37°C和5％CO2下孵育16小时。然后收集培养基以进行进一步分析。

　　如上所述，对ASC – CITRINE（B6.CG-GT（ROSA）26sortm1.1（CAG-PYCARD/MCITRINE*，-CD2*）DTG/J）BMDMS培养如上所述。然后将细胞收获并在配备15毫米盖玻片的12孔平底井板中播种。总共每孔接种总量为1 ml的总量3×105个细胞，然后培养至少16小时（37°C和5％CO2）。然后将BMDM用LPS（100 ng mL -1）启动4小时。之后，用250 ng的DRAQ5标记的Net-DNA刺激BMDM（请参见“中性粒细胞分离和刺激”部分），以进行1小时。然后用PBS洗涤BMDM，并用3.7％的PFA/蔗糖固定。然后从井板中取出含有BMDM的盖玻片，将细胞骨架染色用于β-微管蛋白（Thermo Fisher），并用HOECHST 33342（Immunoosochemistry.com）对核染色。

　　同侧和对侧CCA都仔细阐述，并且彻底修剪外脂脂肪和结扎节点。然后将CCA切开，开放，展开并固定在硅固体中，以在室温下在4％PFA中固定2小时。然后在5％BSA的室温下用0.3％Triton X-100（Sigma-Aldrich）将CCA洗涤1小时。之后，将CCA与兔抗因子XII（1：100; PA5-116703，Invitrogen）在4°C孵育过夜。在室温下用0.3％Triton X-100用0.3％Triton X-100洗涤1小时后，将CCAS与AF647山羊抗兔（1：100; Invitrogen）和DAPI在室温下孵育2小时。最后，用荧光量培养基（Sigma-Aldrich）安装CCA。显微照片是用共聚焦显微镜（LSM 980，Carl Zeiss）拍摄的。

　　为了评估纤维帽的胶原蛋白结构组织，拍摄了3至4个顺序段的20倍PSR图像。如前所述46,47进行了使用ImageJ软件进行定量分析。简而言之，在大约40μm的下皮纤维帽区域上进行了快速的傅立叶变换。然后，阈值快速傅立叶变换图像进行了椭圆形拟合，并计算了纵横比值，作为胶原纤维分布各向异性在纤维帽区域的量度。

　　使用GraphPad Prism版本6.0分析数据。除非另有说明，否则所有摘要数据均表示为平均值±标准偏差。使用Shapiro -Wilk正态性测试对所有数据集进行了测试。使用双向学生的t检验（针对两组）或ANOVA（对于两组以上）分析了包含正态分布独立数据的组。使用双向方差分析分析了正态分布的依赖数据。使用Mann-Whitney U检验（两组）或Kruskal-Wallis检验（H检验；对于两组以上）分析了其余数据。调整P值以使用Bonferroni校正或Dunn的多重比较测试比较多次比较。P <0.05被认为具有统计学意义。

　　使用FlowJo（Treestar）的集成TSNE平台进行了抗Ly6g骨髓骨髓的T-分布的随机邻居（扩展数据图8F）。每个样品使用一千CD45+细胞。该插件设置为250次迭代，并发价值为30。

　　使用RSTUDIO版本1.1.477进行主成分分析（扩展数据图3F）。z键z缩放了来自坏死核，平滑肌肌动蛋白，胶原蛋白，纤维帽厚度和CD68+巨噬细胞区域的绝对值，然后使用“ PRCOMP（）”命令（内置R Stats软件包）计算主要成分。箭头代表显示所有变量之间关系的变量相关性。主要组件是通过其解释方差（62.73％（PC1）和21.05％（PC2））的百分比选择的，并使用“ GGPLOT2”软件包（版本3.4.3; https：//ggplot2.tidyyverse.org）进行了可视化。使用“ Corrplot”软件包（0.92; https：//github.com/taiyun/corrplot）计算和可视化表示形式的相对贡献和质量。

　　所有体内实验均在3-5个独立的实验中进行。在一个独立的实验中，所有组都代表。所有体外实验均在2-4个独立的实验中进行。在每个独立实验中均表示体外测定的所有条件。图1D显示的实验数据，我代表三个独立的实验。图2C所示的实验数据表示三个独立的实验。图2F，I，K，M中的代表性图像显示了三个独立实验之一的结果。图3C中的代表性微照相仪显示了来自独立重复至少五次的实验的代表性图像。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。