HEK 293T（人类肾上皮，ATCC CRL-11268），Vero E6（Cercopithecus aethiops eethiops肾脏上皮，ATCC CRL-1586）和SVG-A（人类的天体天体，由T. Kirchhausen）在Dulbecco的Medem edge vib（T. Kirchhausen）提供的Medemed（T. Kirchhausen）提供的GIB（DM）中（DM）（DM），胎牛血清（FBS）和25 mM HEPE（Thermo Fisher Scientific）。Vero 81（C。aethiops肾上皮，ATCC CCL-81）细胞在DMEM高葡萄糖中培养，并补充了10％（v/v）FBS，1％（v/v）Penicillin-strepsycin，1 x非索引氨基酸（Neaa，Sigma），1倍（Neaa，Sigma）和1毫米毛酸盐。K562（人类慢性粒细胞性白血病，ATCC CCL-243）细胞被添加到rpmi1640（Thermo Fisher Scientific）中，这些细胞补充了10％（v/v）FBS，25 mM HEPES和1％（v/v）青霉素 - 链霉素。将SK-N-SH（人脑神经母细胞瘤，ATCC HTB-11）保持在Eagle的最小必需培养基（EMEM，Sigma）中，这些培养基（EMEM，SIGMA）补充了10％（v/v）FBS，25 mM HEPES和1％（V/V）青霉素 - 链霉素。Expi293F细胞（Thermo Fisher Scientific A14527）维持在Expi293表达培养基（Thermo Fisher Scientific）中。细胞系未经认证。通过使用E-Myco PCR检测试剂盒（Bulldog Bio 25234），通过常规的支原体测试证实了支原体的缺失。

　　Weev Fleming和Weev McMillan的全长感染克隆先前已描述了55，由W. Klimstra提供。将质粒转化为Top10大肠杆菌（Invitrogen），并根据制造商的方案（Qiagen）使用质粒加MIDI或最大试剂盒制备。用Noti-HF限制酶（NEB）实现了10 µg质粒的线性化，然后进行苯酚 - 氯仿提取。使用Mmessage Mmachine T7试剂盒（Invitrogen）用1 µg线性化质粒在体外转录WEEV RNA。RNA转录后，将两个Vero 81的T-150或T-175烧瓶（用于Fleming）或Vero E6（用于McMillan）细胞用0.25％胰蛋白酶-EDTA（Gibco）分离，并用Dulbecco的磷酸盐耐药盐（DPB）洗涤3次。最终洗涤后，将细胞重悬于DPB中，并与4 mM间隙比色杯中的全部抄录RNA结合在一起。将细胞和RNA在ECM 830平方波电穿孔系统（BTX）中以1 s的间隔（BTX）进行三个250 V，10 ms脉冲。将细胞在室温下休息约10分钟，然后在培养基降低的培养基存在下转移到T-75烧瓶中，并在37°C下以5％的二氧化碳保持在37°C。两天后两天的细胞质作用发作后，细胞碎片被离心颗粒，并在-80°C下收集病毒量并储存。

　　在哈佛医学院机构动物护理和使用委员会（协议编号IS00002530-3）和波士顿儿童医院机构动物护理和使用委员会（协议编号00001725）下，批准了小鼠实验。PCDH10-KNOCKOUT鼠标线保持在C57BL/6J背景21上。产后第0天或第1天通过基因组PCR进行基因分型，其中野生型等位基因的片段通过引物P1（5'-GCTCGCGCGCGCCGCCCGCCGTTGTGATTGATC-3''）扩增（NULL）通过底漆P1和底漆P3（5'-ActggTacCGCGCGCGACTGAAAAACAGTG-3'）扩增等位基因。解剖皮质神经元并使用改编自参考的方法从产后第1天或2个新生儿分离。56。简而言之，幼崽在冰上被麻醉，并通过斩首对安乐死。然后将皮质分离在冷HBS中，并在补充了20个单位ML -1的Papain（Worthington Biochemicals）和2000单位ML -1的DNase I（Roche）的HBS中分离。在解离过程中，首先在三次三次后在37°C下孵育5分钟。解离后，木瓜蛋白酶用HBSS中的10 mg ml -1卵球形抑制剂（沃辛顿生化物）中和。然后通过600g离心3分钟将细胞用神经质培养基洗涤一次，并在96孔板（Cellvis）中以每孔的100,000个细胞密度镀以20μgml-1的聚赖氨酸（SIGMA）和4μgml-1 laminin（热渔夫）。除非另有说明，否则将神经元保存在补充B27（Thermo Fisher）， - 谷氨酰胺和青霉素 - 链霉素的神经质量中，除非另有说明。镀以后的第1天（Day in Betro 1（Div 1）），将镀层神经元用3 µM胞嘧啶阿拉伯糖苷（ARAC）处理 Div 3减少非神经元细胞的生长。在DIV 4上，我们在37°C下，在含有5 µg ML-1聚甲烯的培养基中，在含有5 µg ML-1聚甲烯的培养基中，将WEEV或SFV RVP与100 µg ML-1转移蛋白或RAP进行预孵育。然后，我们将混合物添加到细胞中。使用Incyte S3 Live成像系统（Sartorius）使用Incucyte S3软件版本2022B Rev2（Sartorius）使用20倍物镜，每4小时对细胞进行一次成像24小时。使用顶帽背景减法方法，将GFP阳性神经元评分为具有阈值信号大于5绿色校准单元（GCU）的细胞。通过使用Incucyte S3软件分析相对比较图像，获得了每个图像中的神经元细胞体区域。为了计算感染后24小时的时间点计算阳性细胞的百分比，背景上方的GFP信号面积除以神经元细胞体覆盖的总面积，并乘以100。我们计算了相对感染，如下：相对感染（％）野生型神经元= GFP阳性野生型或RAP-prin-type-temaine typepepepe-typepe-typepe-typepe-type-typepe-typepepepepepepepepepepepepepepep/gfpp阳性型细胞的百分比（在没有转铁蛋白或RAP）×100的情况下野生型细胞；PCDH10 - / - 神经元的相对感染（％）=（在存在或不存在转铁蛋白或RAP的情况下GFP阳性PCDH10 - / - 细胞）/（不存在转铁蛋白或RAP的GFP阳性野生型细胞百分比）×100。

　　如前所述生成RVP。简而言之，我们使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）将两个质粒转染到HEK 293T细胞中：由R. Kuhn（Purdue University）提供的修改后的PRR64 ROSS RIVER病毒复制57（SP6启动子用CMV启动器代替，用CMV启动子代替E3 – E2 – E2 - e3 – e2 – e3 – e2 – e3 – e2 – e2 – e2 – e2 – e2 – e2 – e2 – e2 – e2 – e2 – e2 – e2 – e2 – e2 – e2 – e1 sequbl在猪Teschovirus-1 2 A自裂肽）和表达异源αE3– E2- E2-（6 K/TF）–e1蛋白的PCAGGS矢量。转染后4-6小时，我们用补充了5％（v/v）FBS，25 mM HEPES和5 mM丁酸钠的Opti-Mem（Thermo Fisher）代替培养基。我们在转染后2天收集了上清液，以4,000 rpm离心上清液5分钟，使用0.45 µm的滤光片对其进行过滤，然后在-80°C下冻结等分试样存储。

　　克隆到PCAGGS载体的αE3– E2–（6 k/tf） - E1编码序列包括：WEEV 71V1658（GenBank NC_003908.1），Weev菌株加利福尼亚州WEEV菌株，加利福尼亚州（Genbank KJ554965.1），genbank kj554965.1GQ287640.1), WEEV strain BFS932 (GenBank KJ554966.1), WEEV strain BFS2005 (GenBank GQ287644.1), WEEV strain Y62-33 (GenBank KT844544.1), WEEV strain Montana-64 (GenBank GQ287643.1), WEEV strainCU71-CPA（GenBank KT844545.1），WEEV菌株85-452NM（GenBank GQ287647.1），WEEV菌株PV012357A（GenBank KJ554987.1）GQ287641.1），SFV应变SFV4（GenBank AKC01668.1），EEEV菌株佛罗里达州91-469（GenBank Q4QXJ7.1），EEEV菌株PE6，PE6（GenBank AY722102.1），Genbank AY722102.1，Sinv stro toto toto toto toto toto1101 t6p144（genbank117594）INH-9813（GenBank KP282671.1）和Chikv菌株37997（GenBank AY726732.1）。

　　使用RVP库存的串行双重或十倍稀释，对在96孔板中播种的Vero E6细胞上进行了表达GFP的RVP的滴定。感染后24小时，使用荧光显微镜计数GFP阳性细胞的数量，并用于计算RVP滴滴滴定为每毫升感染单位（IU ML-1），假设在高稀释因子下，鉴于1 GFP阳性细胞= 1个感染单位，鉴于RVPS仅能感染一个周期。

　　补充表2包含针对单个指南RNA（SGRNA）库中的基因。如前所述4，该文库包括通过质谱法鉴定出在细胞表面上鉴定的蛋白质的基因，并且蛋白质在细胞表面上预测为生物信息上的蛋白质，或与内体，溶酶体，囊泡或细胞表面相关的细胞表面上的蛋白质，或者由uniprot通过uniprot（htttpps:///htttpps：/tttpps：/tttpps em niprot）。如前所述，我们将引导RNA克隆到Lentiguide-Puro61（由F. Zhang，Addgene＃52963提供）中，并在Endura电竞争性细胞中放大了库（Lucigen 60242），如前所述62。我们通过将质粒文库与PMD2.G（由D. Trono，Addgene＃12259提供）和PSPAX2（由D. Trono提供，Addgene＃12260提供）通过将质粒文库和PMD2.G（提供）包装到HEK 293T细胞中，将质粒文库与PMD2.G（提供）（由D. Trono，Addgene＃12259提供）通过pmd2.g（提供），将文库包装到慢跑病毒中。转染后1和2天收集上清液，通过离心（1,200 rpm 5分钟）进行合并，通过0.45 µm的膜过滤，并在-80°C下储存。

　　我们使用了先前描述的HEK 293T线，该线稳定地表达了链球菌CAS9（HEK 293T-CAS9）的CRISPR – CAS9屏幕4。我们用CRISPR sgrna慢病毒文库以0.3的MOI转导HEK 293T-CAS9细胞。变形后的一天，我们通过在1 µg mL-1中添加紫霉素开始选择SGRNA表达细胞。选拔后七到十天，我们用表达CD20的WEEV RVP感染了细胞（71V1658菌株），旨在与未经库中未经转导的HEK 293T-CAS9细胞相比，旨在80-90％感染的细胞，该细胞由抗CD20 APC偶联抗体（MiLtenyi-Miltenyi-Miltenyi-biotec clirition at At Atty At truition）监测。RVP感染后三天，我们使用抗CD20微粒（Miltenyi Biotec 130-091-104）耗尽感染细胞。为了提高信噪比，我们进行了两轮感染，WEEV RVP在未感染的细胞扩张后表达CD20。我们从未感染的细胞中提取了基因组DNA，并从尚未感染RVP感染的HEK 293T-CAS9细胞中提取了基因组DNA。我们使用Illumina Miseq上的下一代测序确定了SGRNA序列并确定了SGRNA含量。去除标签序列，并使用Mageck（版本0.5.6）20分析基因富集。

　　我们使用了先前描述的VLDLR-KNOCKOUT HEK 293T细胞4。为了使用CRISPR – CAS9破坏PCDH10，我们用靶向两个位点的SGRNA将HEK 293T细胞与Lenticas9-blast（addgene＃52962）一起转移到Lentiguide-Puro（Addgene＃52963）中。然后，我们使用克隆稀释来隔离单个克隆。我们通过用抗PCDH10抗体（ProteIntech 21859-1-AP）或抗VLDLR抗体（Genetex GTX79552）染色细胞，证实了敲除克隆中PCDH10或VLDLR缺乏细胞表面表达。克隆PCDH10敲除细胞通过PCR进行基因分型。

　　用于破坏PCDH10的前向引导RNA序列为：SGPCDH10-1，5'-CGTGACTGACCCGCGCGCGCGACTCAG-3';SGPCDH10-2，5'-TCGCATGGACTGGCGCACCG-3'。克隆PCDH10-KNOCKOUT HEK 293T细胞的基因分型引物序列为：正向，5'-CTACACGGGTACGGTACAGGAGGAGGAGC-3';反向，5'-CCAACGCGATGATGAGGAGGATG-3'。

　　我们转染编码CHIKV菌株3799763，WEEV菌株CBA87的结构多蛋白（CapSID – E3 – E2-（6 K/TF）–E1）的质粒，该菌株含有Capsid Protin.29的基因中，该基因中包含一个核位置突变，其中包含Capsid protin.197，OREEV Protin.29777777.根据制造商的规程，使用Expifectamine 293转染试剂盒（Thermo Fisher）进行293F细胞。转染后5天收集培养上清液，并通过3,000g离心20分钟来清除细胞碎片。在5 ml 35％（w/v）的蔗糖垫上放置澄清的上清液，在5 mL 70％（w/v）的蔗糖垫上，在4°C下以25,000 rpm的速度在25,000 rpm下进行超速离心。将VLP从35％和70％的蔗糖垫的界面合并，并在100 kDa Amicon滤光片（Sigma）中交换，以在1 mL的体积下将蔗糖浓度降低至小于20％。然后，我们将VLP置于20％–70％的连续蔗糖密度梯度和35,000 rpm的超速离心样品上，在4°C下1.5 h。收集了VLP频段。VLP在没有缓冲液交换的情况下存储在4°C下，而不会冷冻。我们证实了使用SDS -PAGE的粒子完整性和降解产物的不存在。VLP始终在纯化后的7天内使用，并在使用前立即根据应用进行交换。

　　纯化的VLP被缓冲液交换为0.1 M碳酸氢钠（pH 8.3），并稀释至1 mg ml -1。使用前，将Alexa Fluor 647（AF647）NHS酯（琥珀酰亚胺基酯）（Invitrogen A37573）溶解在二甲基亚氧化二甲基亚氧化二甲基（DMSO）中，最终浓度为1 mg Ml -1。我们将25 µg的AF647 NHS酯添加到1毫克的VLP中，并在室温下将混合物孵育30分钟。我们用Zeba旋转脱盐柱（Thermo Fisher）从溶液中除去了多余的染料，并将标记为VLP的缓冲液交换为PBS。将标记的VLP存储在4°C下，并在标记后12小时内用于共聚焦显微镜实验。

　　编码人类PCDH10（GenBank NM_032961.3）的cDNA，鼠标PCDH10（GenBank NM_001098170.1），人VLDLR（GenBank NP_003374.3），人Mxra8（GenBank NM_032348.3）和人类LDLR（GenBank NM_032348.3）和GENBAND888888888888888888888。The coding sequences of P. domesticus PCDH10 and P. domesticus MXRA8 were obtained by aligning the coding sequences of Passer montanus PCDH10 (GenBank XM_039733439.1) and P. montanus MXRA8 (GenBank XM_039727729.1) against the genome of P. domesticus (GenBank GCA_001700915.1) and assembling对齐碎片。在以下密码子优化的编码序列上合成基因块（IDT）：E。caballus pcdh10（GenBank XM_023636548.1），P.Sounderus pcdh10，P. for.ApoER2同工型2（GenBank NM_004631.5）。将标志标签（Dykdddk）放置在P. fordingus mxra8的N端，以监测表达。人类PCDH10的截断构建体如下：PCDH10（ΔEC1）是通过在PCDH10前体蛋白序列中删除EC1（Q19 -F122）生成的（编号包括信号肽序列）；通过在前体蛋白序列中删除Q19 – G690并在S696和G697之间添加标记标签来生成PCDH10茎– Flag；通过用EC1（Q19 – F122）或EC2（P123 – F250）在前体蛋白序列中替换Q19 – G690来产生PCDH10 EC1 – FLAG和EC2 -FLAG，并在S696和G697之间插入FLAG TAG；通过去除PCDH10的PCDH10（ΔCT）是通过去除前体蛋白序列中的细胞质结构域（Q741 – C1040）而产生的。通过用GPI锚定编码序列替换PCDH10 – GPI和VLDLR – GPI，通过替换PCDH10（L716 – C1040）（L716 – C1040）（L716 – C1040）的跨膜螺旋和细胞质结构域生成（5'-CCTAATAAGGGGCAGGCAGCACTTCAGGAACCACCAGCCAGCTGCTGTGCCCATGCCATGCTGCTTTACACTGACGACGGCGGTCTCTCTCCTGGGGCTGGGCTGGGCTGGTGGGTGGTGGTGCTGACTGACTGACTGACCC-3'）（pnkgsgttsgttrllsghtcftltgllgtlvtmgllt）。

　　将上述构建体克隆到凸透明 - 二元 - 甲状腺（Addgene＃52963）中。我们使用lipofectamine 3000（Thermo Fisher）将其与PSPAX2（Addgene＃12260）和PMD2.G（Addgene＃12259）一起转染了该矢量。转染后2天收集慢病毒，并用于转导K562细胞或克隆PCDH10-KNOCKOUT HEK 293T细胞。在2μgml -1和1μgml -1的情况下，选择成功转导的K562细胞和HEK 293T细胞。用荧光激活的细胞分选用抗PCDH10多克隆抗体（ProteIntech 21859-1-AP），将用Caballus PCDH10转导的K562细胞进一步分类，以分离阳性细胞的亚种群。证实细胞系通过细胞表面抗体染色表达转导的构建体。

　　使用前，将一抗在结合缓冲液（PBS中的2％（v/v）山羊血清）中稀释至10μgml -1。所使用的原始抗体包括多克隆抗PCDH10（ProteIntech 21859-1-AP），抗VLDLR（Genetex GTX79552），抗MXRA8（MBL国际W040-3），抗LDLR（R＆D Systems Mab2148），Rabbit Iggbit Isigect（Proteceecte）（protech 300-- proteceect and qup） -（BD Biosciences BDB557351）。将细胞在4°C的阻止缓冲液（PBS中的5％（V/V）山羊血清）中孵育30分钟，然后在结合缓冲液中与10 µg ml -1的一抗（2％（V/V）山羊血清在PBS中）孵育。将细胞在结合缓冲液中洗涤3次，然后与PE偶联的驴抗兔F（AB'）2片段（Jackson Immunoresearch 711-116-152）或PE结合的驴抗小鼠F（AB'）2片段（Jackson Immunoresearch 715-116-15-116-15）30分钟1：200。我们在结合缓冲液中两次洗涤细胞，并在PBS中两次洗涤细胞，并使用IQUE3 Screener Plus（IntellicyCyt）使用Forecyt（Sartorius）软件固定了2％（v/v）福尔马林的细胞，并检测到了细胞表面受体表达。使用FlowJo（版本10.6.2）可视化抗体染色。

　　对于表达标记标记构建体的细胞，我们将APC偶联的抗DykDDDK（FLAG）抗体（Biolegend 637307）或APC偶联的对照抗体（Biolegend 402306）稀释至5μgml-1，直接在使用之前使用。如上所述阻断细胞，在4°C的结合缓冲液中与一抗在结合缓冲液中孵育30分钟，并在结合缓冲液中洗涤两次，在PBS中两次。然后，我们使用Ique3 Screener Plus（Intellicyt）使用Intellicyt Forecyt标准版版本8.1.7524（Sartorius）软件检测到细胞表面受体表达。使用FlowJo（版本10.6.2）可视化抗体染色。

　　我们克隆了人类PCDH10 EC1（Q19 – F122，GenBank NP_116586.1），人MXRA8型eTodomain（V20 – H337，GenBank NP_001269511.1），人类VLDLR配体结合域（A31 – C35555555555555555555555555555555年）由A. Schmidt64提供的C-terminus在C末端编码人IgG1 FC作为融合蛋白。我们将全长人RAP（残基1-353，包括信号序列）（GenBank NP_002328）克隆到PCAGGS载体中。

　　为了生产PCDH10EC1 – FC和MXRA8ECT – FC，我们根据制造商的建议，使用Expifectamine 293转染试剂盒（Thermo Fisher）将PVRC载体转染到了调查293F细胞中。转染后5天，我们使用MabSelect确保LX蛋白A亲和力树脂（GE Healthcare）根据制造商的方案纯化FC融合蛋白，并使用SuperDex 200增加列来进一步通过尺寸排斥色谱法。同样生成对照IgG（C1A-H12抗SARS-COV-2峰值抗体65）。蛋白质存储在PBS中。除了用于质量控制目的的小等分试样外，用于体内实验的蛋白质没有进行大小排除色谱法。还测试了内毒素的存在，该毒素被测量为 <0.5 endotoxin units ml–1 using a Pierce Chromogenic Endotoxin Quantification Kit (Thermo Fisher Scientific).

　　To produce VLDLRLBD–Fc and RAP, we transfected the pVRC vector encoding VLDLRLBD–Fc and the pCAGGS vector encoding RAP into Expi 293F cells using the ExpiFectamine 293 Transfection Kit (Thermo Fisher) at a 1:1 ratio. 5 days post-transfection, culture supernatants were subjected to protein A affinity chromatography, during which VLDLRLBD–Fc bound by RAP was captured by the resin. We washed the resin with Tris-Buffered Saline (TBS) (20 mM Tris, 150 mM NaCl in water, pH 7.5) then eluted RAP with 300 column volumes of 10 mM EDTA in TBS overnight, then buffer exchanged RAP into TBS for storage. VLDLRLBD–Fc was refolded on the column by washing the resin with 100 column volumes of TBS containing 2 mM CaCl2 and subsequently eluted according to the manufacturer’s protocol. Proteins were further purified by size-exclusion chromatography using a Superdex 200 increase column. VLDLRLBD–Fc was buffered exchange into TBS containing 2 mM CaCl2 for storage.

　　We pre-incubated GFP-expressing alphavirus RVPs in the presence of recombinant proteins or antibodies and 5 µg ml−1 polybrene in culture medium for 30 min at 37 °C. The anti-PCDH10 antibodies and the control antibodies (anti-HLA-C polyclonal antibodies (Proteintech 15777-1-AP) and anti-HLA-ABC polyclonal antibodies (Proteintech 15240-1-AP) were first dialysed into PBS to remove azide preservatives. The mixtures were added to cells. 24 h post-infection, cells were washed twice in PBS and fixed in 2% (v/v) formalin. RVP entry was measured using an iQue3 Screener PLUS (Intellicyt) with IntelliCyt ForeCyt Standard Edition version 8.1.7524 (Sartorius) software. An example of the flow cytometry gating scheme used to quantify GFP expression after RVP infection is provided in Extended Data Fig. 2b. We calculated relative infection as follows: Relative infection (%) = (percentage of GFP-positive cells in the presence of recombinant proteins or antibodies)/(percentage of GFP-positive cells in the absence of recombinant proteins or antibodies) × 100.

　　A total of 107 K562 cells stably expressing human PCDH10 or MXRA8 were centrifuged at 1,000 rpm for 5 min and resuspended in a mixture of heparinases (heparinase I (R&D Systems 7897-GH) at 2 units ml−1, heparinase II (Sigma H8891) at 1 unit ml−1, heparinase III (R&D Systems 6145-GH) at 2 units ml−1). Cells were treated for 1 h at 37 °C. We then washed cells and resuspended cells to a density of 0.5 × 106 ml−1 in RPMI1640 supplemented with 2% (v/v) FBS and 25 mM HEPES. Twenty-five micrograms of labelled VLPs were added to 0.5 × 106 cells. For cells kept at 4 °C, cells were incubated on ice following addition of VLPs for 30 min. Cells were then washed once with cold PBS and kept on ice. Immediately before imaging, cells were treated with 500 µl Alexa Fluor 488-conjugated wheat germ agglutinin (WGA-AF488) (Invitrogen W11261) at 1 µg ml−1 in PBS, washed again with cold PBS, resuspended in 80 µl cold PBS, and placed in glass bottom microwell dishes (MatTek P35G-1.5-14-C) for imaging. Cells were imaged with a Yokogawa CSU-W1 single disk (50 µm pinhole size) spinning disk confocal unit attached to a Nikon Ti2 inverted microscope equipped with a Nikon linear-encoded motorized stage, an Andor Zyla 4.2 plus (6.5 µm photodiode size) sCMOS camera using a Nikon Plan Apo λS SR HP 100×C/1.45 Silicon DIC silicone immersion objective with Nikon Silicone oil. The final digital resolution of the image was 0.065 µm per pixel. Fluorescence from WGA-AF488 and VLPs conjugated to AF647 was collected by illuminating the sample with a solid state directly modulated 488 nm diode 100 mW (at the fibre tip) laser line or a solid state, directly modulated 640 nm diode 100 mW (laser tip) laser line in a Nikon LUNF XLlaser combiner, respectively. A hard-coated Semrock Di01-T405/488/568/647 multi-bandpass dichroic mirror was used for both channels. Signal from each channel was acquired sequentially with either a hard-coated Chroma ET525/36 m or Chroma ET700/75 m emission filters in a filter wheel placed within the scan unit, respectively. z-stacks were set by determining the top and bottom of the cell, using WGA-AF488 fluorescence as a reference. The approximate volume was ~20 µm, and the step size was set to 0.2 µm (approximating 80 z-slices in total), using the piezo stage insert (Mad City Labs, 500 µm). The exposure times were optimized to fill ~1/2–2/3 of the camera dynamic range and then kept consistent for one image set (individual exposure times are found in the image metadata and image legend where applicable). Fluorescence from each fluorophore was acquired sequentially at each z-step of the confocal to improve the axial precision of the measurements. Nikon NIS-Elements Advanced Research (AR) 5.02 acquisition software was used to acquire the data, and the files were exported in ND2 file format. Figures were generated using Fiji66. A Gaussian filter of σ = 1 was applied to the image to smooth single pixel noise before adjustment of brightness and contrast. Max intensity projection (MPI) renderings were created by using the 3D projection function (Stacks>3D项目）以10°的增量和插值选择以平滑3D渲染。

　　使用Arivis 4DFusion 4.0分析软件内置的自定义管道进行3D图像分析。我们通过颗粒增强的直径0.6 µm的滤光过滤器检测到VLP，然后检测到直径0.13 µm的扩张形态过滤器（球形）。然后，我们应用了直径为0.52 µm的斑点查找器分割滤波器，概率阈值21.24％，分裂灵敏度为50％。我们首先在膜检测操作中施加增强边缘滤波器，对细胞室进行了分割，膜宽度为0.9 µm，间隙尺寸为0.6 µm，以增强AF488信号。然后施加一个离散的高斯脱氧直径0.2 µm的过滤器。基于膜的分割操作，分裂灵敏度为30％，最大直径为50 µm，以分割处理后的图像，并通过球形> 0.58的其他特征过滤器> 0.58和体积> 20 µm3获得了整个细胞掩模。细胞质面膜是通过用两个像素侵蚀细胞面膜来创建的。膜 +细胞质面膜是通过通过三个像素扩张细胞面膜来产生的，并通过用细胞质掩模减去膜 +细胞质掩码来获得膜面膜。最后，为了删除基于成像体积边缘切断的细胞以及被分割为独立细胞的细胞的细胞创建的片段，我们应用了一个体积滤波器来排除其体积<500 µm3的细胞质段以及相应的膜段。然后通过组合所有掩码来计算每个隔室中的VLP数量。

　　使用octet Red96e（Sartorius）进行Biolayer干涉法，并使用Fortebio数据分析分析数据HT版本12.0.1.55软件。将PCDH10EC1 – FC，VLDLRLBD – FC和对照IgG（C1A-H12）65加载到抗人类IgG FC捕获（AHC）生物传感器（Sartorius 18-5063）上，在Kinetic Buffer中以100 nm的速度（包含2 mm CACL2和0.1％的TBS）（tbs）（tbs）（均为0.1％）（W）（W）（w）。将涂层的传感器尖端浸入动力学缓冲液中，以进行60 s的基线测量，然后将100 nm的WEEV VLP浸入300 s（CBA87 VLP）或600 s（McMillan VLP）的溶液中，最后在动力学缓冲液中以300 s（CBA87 VLP）或600 s（MCMILLAN）（MCMILLAN）（MCMILLAN）在动力学缓冲液中。在Weev Mcmillan VLP的情况下，将控制IgG（C1A-H12）65替换为MXRA8ECT – FC作为对照。

　　使用内置肌肉算法67对编码44个WEEV菌株的结构多蛋白（C – E3 – E2–（6 K/TF）–E1）的序列在MEGA11中排列在MEGA11中。使用Tamura 3参数核苷酸替代模型的对齐序列构建了最大的样系统发育树。Bootstrap方法用于测试1000个自举复制的系统发育。

　　用空的小叶酮 - 二旋载体转导的K562细胞（2.5×106），或通过在450g的450g偏心剂中固定2分钟。将培养基被丢弃，并将细胞颗粒轻轻悬浮在1 ml的溶液中，其中含有WEEV（菌株McMillan或Fleming）在维护培养基中稀释至2.5×104 pfu/ml（rpmi1640（rpmi1640），补充了2％（v/v）FBS，25 mm Hepes，1％（V/v/v/v/v/v/v/v）的0％（V/v/v/v/v/v/v）。允许感染在37°C下用5％CO2进行1小时。感染后，将细胞用上述离心用5 mL DPB（Sigma）洗涤3次。最后，将细胞重悬于5 mL维持培养基中。最终的重悬于后，感染后6、12、24和48小时再次从每个样品中收集500 µL上清液，并存储在-80°C下。除去的体积被500 µL新鲜的维护介质代替，并将样品返回到孵化器中。样品滴度通过对Vero E6细胞上的斑块测定确定。

　　在补充2％（v/v）FBS的DPB中，含有WEEV（菌株McMillan或Fleming）的培养上清液串行稀释。允许稀释的样品在12孔板中感染Vero E6细胞的汇合单层，在37°C下用5％CO2感染1小时。感染后，单层被补充了2％（v/v）FBS，1％（v/v）谷氨酸（Gibco），1％碳酸氢钠（7.5％溶液）（7.5％溶液）（GIBCO），1％青霉素 - 抗蛋白 - 抗霉素和0.4％le agga（prome）（PROME）（PROME）（PROME）（PROME）（PROME）。在用10％缓冲的福尔马林（Thermo Fisher）固定之前，将感染的覆盖板与37°C的5％CO2在37°C下孵育两天。用1％（v/v）晶体紫（Sigma）对单层染色，并在灯箱的帮助下可视化斑块。

　　对于具有感染性WEEV（菌株MCMILLAN）的斑块中和测定，PCDH10EC1 – FC或MXRA8ECT -FC融合蛋白在补充2％（V/V）FBS的PBS中串联稀释至150-0.073 µg ML -1。将稀释的蛋白质（或单独用作对照）与含有大约30 PFU WEEV McMillan的病毒相等。将蛋白质和病毒的混合物与5％CO2在37°C下孵育一小时。孵育后，按照牙菌斑测定的描述处理样品。中和的％计算如下：％中和=（1 - （实验井/平均稀释剂控制井中的斑块数量））×100％）×100％。

　　小鼠研究得到了德克萨斯大学医学分公司机构动物护理委员会（协议编号1708051）的批准，并根据NIH的实验动物的护理和使用指南。给小鼠喂食19％的蛋白质饮食（Teklad，2919，辐照），光周期为12小时：黑暗周期（06：00–18：00），并将其安置在维持在20至26°C的设施中，湿度为30％至70％。随意提供食物和水。基于先前发表的类似体内实验的结果确定小鼠研究的样本量4。6周龄的CD1 IGS小鼠（Charles River）随机分配了混合性群体（n = 5个雌性和n = 5雄）接受了50 mg kg-1剂量的PCDH10EC1 – FC，对照IgG（C1A-H12抗SARS-SARS-COV-COV-2 SPIKE-2 SPIKE-2尖峰抗体）通过内层途径65或PBS。六个小时后，所有小鼠均通过左后脚垫的皮下路线感染了1,000个PFU Weev McMillan。记录重量，并在感染后每天进行14天的健康检查。出于安全原因，我们并没有对小鼠的治疗或感染状况视而不见，因为WEEV会导致人类严重疾病。

　　当P值使用GraphPad Prism的版本10 <0.05时，数据具有统计学意义。通过单向或双向ANOVA分析实验，具有多重比较校正，或通过GraphPad Prism中的对数秩（Mantel – Cox）测试进行分析。p值在每个图中指示。统计方法不用于预先确定样本量。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。