编码小鼠和人类野生型和正交IL-2和野生型IL-9的DNA被克隆到昆虫表达载体pACGP67-A中，其中包括C端8×其亲和力纯化的标签。DNA编码小鼠血清白蛋白（MSA）的DNA购自集成DNA技术（IDT），并将其作为N末端融合作为PACGP67-A克隆。Insect expression DNA constructs were transfected into Trichoplusia ni (High Five) cells (Invitrogen) using the BaculoGold baculovirus expression system (BD Biosciences) for secretion and purified from the clarified supernatant by Ni-NTA followed by size-exclusion chromatography with a Superdex-200 column and formulated in sterile phosphate-buffered saline (PBS) for injection.根据制造商的建议（Vivaproducts），使用Proteus Noendo HC自旋柱试剂盒去除内毒素，并使用Pierce LAL成色内毒素定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific）确认内毒素去除。将蛋白质浓缩并储存在-80°C，直到准备使用。

　　编码小鼠正交IL-2Rβ的cDNA和基因嵌段cDNA编码IL-4R，IL-7R，IL-9R和IL-21R（IDT）的小鼠ICD的cDNA被PCR和等温组件（ITA）克隆到逆转录病毒载体PMSCV-MCS-ires-yfp中。类似地将人正交IL-2Rβ（HO2R）和嵌合正交IL-2Rβ-ECD – IL-9R-ICD（HO9R）克隆到PMSCV载体中。

　　小鼠被安置在经过评估和认证实验室护理协会批准的动物设施中，并根据加州大学，洛杉矶分校（UCLA），宾夕法尼亚大学和斯坦福大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案使用。对于在UCLA进行的实验，将C57BL/6J小鼠饲养并保存在辐射肿瘤学中。从杰克逊实验室获得了C57BL/6背景上的PMEL-1 TCR/THY1.1转基因小鼠（PMEL小鼠）。对于在宾夕法尼亚大学进行的实验，C57BL/6J和B6 CD45.1“ Pepboy”小鼠是从杰克逊实验室购买的。对于在斯坦福大学进行的实验，从杰克逊实验室购买了C57BL/6J小鼠。

　　B16 -F10小鼠黑色素瘤细胞系购自ATCC，并用RPMI 1640培养，含有10％胎牛血清（FBS，Omega Scientific），青霉素（100 U ML -1，100 U ML -1，Omega Scientific），Omega Scientific），链霉菌（Omega Scientific），链霉菌菌（100 umg MML -ML -ML -ML -ML -ML GA），BEMGAN -1，YOMGA BBER BOMGA BBERIFICICAN（100 u ML -1），含有10％胎牛血清（FBS，Omega Scientific）的RPMI 1640（Thermo Fisher科学）。（0.25μgml -1，欧米茄科学）。在KPC（LSL-KRASG12D/+; LSL-TRP53R172H/+; PDX-1-CRE）小鼠中产生的自发肿瘤的小鼠胰腺癌细胞系维持在RPMI 1640培养基中，并补充了10％FBS和1％Penicicillin – Stroptscomillin – Stroptoptomcilin。在UCLA IRB批准的11–003254下，从患者活检中建立了人类黑色素瘤细胞系M407和M263，并在RPMI 1640培养基中维持，并补充了10％FBS和1％青霉素 - 链霉素；M407细胞被稳定转导向表达核RFP（NRFP）用于活细胞成像测定51。在RPMI 1640中培养源自C57BL/6或PMEL转基因小鼠的T细胞，并补充了10％海克隆FBS（Cytiva），抗生素，50μM2-甲醇（GIBCO），1％非注重氨基氨酸，1％sodiuim periuim pyiuim pyruve和Hepeshepesshepesshepesshepes。除非2-羟乙醇，否则将原代人T细胞培养。HEK293T细胞购自ATCC，并将其维持在DMEM中，并补充了10％FBS，1×谷歌（Gibco）和青霉素 - 链霉素。定期对细胞系进行身份验证，并使用支原体检测试剂盒（Biotool）定期测试了支原体感染。

　　先前已经描述了编码正交细胞因子受体的逆转录病毒的产生9。简而言之，将HEK293T细胞以每10厘米组织培养盘的3×106细胞接种，并允许粘附过夜。使用X-Tremegene HP（Roche），Turbofect（Thermo Fisher Scientific）或Transit Reagent（Thermo Fisher Scientific），用PMSCV逆转录病毒载体与PCL-ECO包装载体的1.5：1比率转染细胞，并在5％的DMEM中培养过夜。24小时后，将培养基用新鲜的DMEM替换为5％FB，并培养24小时。收集培养基，通过离心和在液氮中进行闪光液，以在-80°C下储存。将细胞用新鲜的DMEM与5％FBS补充，并培养24小时，并按照所述收集逆转录病毒上清液并存储。为了产生用于转导PMEL和人T细胞的逆转录病毒，与以下变化一起使用相同的过程：转染后18小时，将培养基用DMEM替换为10％FBS，其中含有20 mM HEPES和10 mM HEPES和10 mM丁酸钠，并孵育8小时。然后将培养基替换为DMEM，含有20毫米肝素的10％FB，没有丁酸钠并在一夜之间孵育。第二天，收集培养基并通过0.45μm滤波器过滤。如果未立即使用，则将病毒在-80°C下冷冻以供以后使用。如前所述，产生编码嵌合抗原受体的逆转录病毒。简而言之，使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific），用PMSGV载体（Thermo Fisher Scientific）转染Plat-E包装细胞（细胞Biolabs）。24小时后更换培养基，并在24小时后收集培养基，通过离心阐明，并通过0.45μm滤波器在-80°C储存之前通过0.45μm滤波器。

　　使用Adeasy XL XL腺病毒矢量系统（Agilent）构建了缺乏复制的E1/E3缺失腺病毒矢量AD5-CMV-OIL-2（AD-OIL-2）和AD5-CMV-NULL（AD-NULL）。将小鼠正交IL-2克隆3A10 cDNA与5'kpni和3'hindiii限制位点合成（Genscript），并将其亚克隆到Pshuttle-CMV（addgene）的多个克隆位点中。含Padeasy-1的BJ5183-AD-1大肠杆菌细胞用PMEI-Linearized Pshuttle-CMV-oil-2转化，以进行同源重组。在PACI线性化和转染中，对所得的重组AD质粒进行了序列验证并扩展在XL10高功能的细胞中。多发弹药后，通过氯化丘（CSCL2）梯度离心纯化腺病毒。CSCL2用Amicon Ultra-15离心滤波器（Millipore）交换为A195 Buffer53。通过分光光度法确定病毒滴定（每毫升VP）（Nanodrop，Thermo Fisher Scientific）。

　　在HEK293T细胞中产生了用于人T细胞转导的慢病毒载体。用于抗人类抗中皮素M5 CAR（先前描述的50）和人类正交受体（HO2R或HO9R）的慢病毒质粒以及包装质粒与包装质粒一起使用LipoFofectamine 3000（Hek293t细胞），使用Lipofectamine 3000（HOH2R或HO9R）以及包装质粒将其转染到HEK293T细胞中。进行超速离心以在转染后24小时或48小时内收集的慢病毒上清液，并将浓缩病毒储存在-80°C下。

　　先前描述了C57BL/6衍生的小鼠T细胞的病毒转导9。简而言之，将12孔组织培养板与无菌PBS中的抗小鼠CD3ε（克隆145-2C11，Biolegend）的2.5μgml-1溶液涂覆过夜。通过通过70μm细胞滤网解离，然后在ACK裂解缓冲液（GIBCO）中解离，从脾脏和6-8周龄C57BL/6J小鼠的淋巴结制备单细胞悬浮液。将细胞重悬于含有100 IU ML-1重组小鼠IL-2（MIL-2）的小鼠T细胞培养基中，并用板结合的抗小鼠CD3ε和可溶性抗小鼠CD28（5μgml-1，克隆37.51，Bioxcell）激活24小时。活化的小鼠T细胞在32°C下使用含有聚甲烯（10μgml-1）的逆转录式上清液（10μgml-1）和100 IU ML-1 MIL-2转导活化小鼠T细胞在32°C下转导。病毒上清液被含有100 IU ML-1 MIL-2的新鲜小鼠T细胞培养基代替，并培养24小时。通过轻柔的移液收集细胞，并在包含100 IU ML-1 MIL-2的新鲜T细胞培养基中以每毫升1×106的速度重悬于，并在37°C下膨胀过夜，然后再下游细胞分析。

　　对于PMEL T细胞的逆转录病毒转导，在转导前一到三天收集了从五至十周龄的PMEL小鼠的脾细胞，并用50 U ML-1 MIL-2（PEPROTECH）和1μgml-1 ML-1 ML-1小鼠GP100小鼠GP100肽（ANASPEC）激活。转导前一天，将六孔组织培养板涂上后脑蛋白（Takara），并将其放置在4°C的冰箱中过夜。第二天，将板用PBS中的0.5％FBS阻塞30分钟，并用PBS洗涤。将病毒上清液（2 mL）添加到每个孔中，并以2,000克旋转两个小时。将活化的PMEL T细胞（3×106）与50 U ML-1小鼠IL-2一起添加到每个孔中，并在2,000g旋转10分钟，然后在37°C培养18–24 h。然后，根据YFP的表达和使用ARIA II II细胞分选蛋白（BD Biosciences）的7-AAD排除对生存的转导细胞进行分选，并在使用下游的体外或体内测定之前过夜过夜。先前描述了小鼠汽车T细胞的逆转录病毒转导52。简而言之，通过磁珠分离（Stemcell Technologies），将初级供体CD45.1小鼠脾细胞（来自4-6周龄的女性CD45.1 B6.SJL-PTPRCA PEPCB/BOYJ小鼠）富含CD3+细胞。在存在50 U ML-1重组人IL-2（Peprotech）的情况下，用小鼠CD3/CD28 Dynabeads（Thermo Fisher Scientific）激活T细胞，在旋转蛋白涂层（Takara Bio）板上旋转之前，将T细胞激活48小时。旋转两天后，收集细胞进行体外测定或静脉注射。

　　通过白细胞移植从健康的人类供体中分离的原发性人外周血单核细胞（PBMC）被解冻并过夜，然后用抗人CD3/28磁性磁磁体（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific）和人IL-2（500 U ML-1）激活两天。通过旋转，将T细胞在涂有转染蛋白（Takara）的6孔板上共转导48小时，并通过旋转通过旋转来加载每个逆转录病毒（编码HO2R和NYESO1-TCR克隆1G4或NYESO1-TCR克隆1G4）的每孔1 ml。收集活化的细胞和转导的细胞，并通过将EasySep细胞分离磁体放置两分钟来去除珠子。用抗人Vβ13.1PE抗体染色（Beckman Coulter，识别NYESO1-TCR克隆1G4的β链），并根据YFP，Vβ13.1的表达和使用Aria II Cellia Biosce（BD Biosce）（BD Bioscience（BD）的排除，基于YFP，Vβ13.1的表达，在细胞分类之前进行7-AAD活/死染料。

　　为了用抗中皮素M5 CAR和人骨受体转导人T细胞，将新鲜分离的CD4+和CD8+ T细胞以1：1的比例混合，并以3：1的粒子比例用CD3/CD28磁性驱动器激活。24小时后与编码M5 CAR和HO2R-GFP或HO9R-GFP的慢病毒载体共转移T细胞。在第5天，将珠子从文化中取出。将T细胞保持在每毫升0.8×106的状态，直到使用MultiSizer 4 Coulter Counter（Beckman）确定的细胞大小达到静止状态，然后冷冻保存。为了进行M5 CAR-HO2R-GFP和M5 CAR-HO9R-GFP双阳性T细胞的流动分选，将共转导的T细胞解冻并休息过夜，然后用抗人类IgG F（AB’）2（ABSSON IMPINOResearch）（杰克逊免疫earcearch）用于M5 CAR和M5 CAR和DEADE/DEADER/DEADER/DEADER/DEADER/DEADER/DEADE AQUA，以供Dead-Cell Excluition。GFP是HO2R和HO9R的替代标记。分类是在BD Facsaria Fusion（BD Biosciences）上进行的。

　　在信号测定之前，将积极生长的原代小鼠或人T细胞静止在缺乏IL-2的RPMI-C中。将细胞铺在50μl温暖的RPMI-C培养基中的超低结合96孔圆底板上。通过在37°C下添加重组细胞因子20分钟来刺激细胞，并在室温下用1.5％多聚甲醛（PFA）固定反应15分钟。将细胞洗涤并用冰冷的100％甲醇在冰上透化60分钟，或在-80°C下储存过夜。在用PSTAT抗体（补充表5）染色之前，用FACS缓冲液洗涤细胞，在黑暗中4°C下1小时。将细胞洗涤并在细胞动物（Beckman Coulter）上进行分析。数据代表平均荧光强度（MFI），使用Prism 8.4（GraphPad），点与原木（激动剂）与剂量反应模型拟合。有关门控策略，请参见补充图2。

　　用细胞因子刺激IL-2和FBS饥饿的CAR T细胞20分钟，并用补充蛋白酶/磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Halt，Thermo Fisher Scientific）的冰冷的RIPA缓冲液裂解以提取蛋白质。将总蛋白的三十微克加载到SDS-PAGE凝胶（Nupage Bis-Tris，Thermo Fisher Scientific）中，然后转移到PVDF膜（Immobilon-FL，Millipore）中。对PSTAT1，PSTAT3，PSTAT5和GAPDH的检测进行了相应的原代抗体，然后是IRDYE标记的二级抗体或HRP连接的二抗。在奥德赛CLX（Li-Cor Biosciences）上成像膜。

　　在用CellTracer Violet（CTV，Thermo Fisher Scientific）标记之前，将积极生长的小鼠T细胞静止在缺乏IL-2的RPMI-C中。在96孔圆底板中，将标记的细胞以每孔50,000 t细胞的形式播种。在MSA-OIL-2的系列稀释液中培养细胞两天。在第2天补充细胞因子。在第4天，通过使用CytoFlex通过荧光激活的细胞分选（FACS）评估CTV标记的细胞增殖。活电池大门基于FSC和SSC。在MSA-OIL-2或MSA-IL-2的存在下，通过在圆底96孔板中每孔播种50,000个细胞来评估CAR T细胞增殖。在第2天，将细胞喂入新鲜的培养基和细胞因子。每日细胞计数是通过染色钙钙染色体染料（Thermo Fisher Scientific）的细胞等分试样获得的，并在Celigo图像细胞仪（Nexcelom Bioscience）上进行了分析。

　　对于Luminex分析，将转导的CAR T细胞在圆底96孔板（每孔50,000个细胞）中孵育四天，持续四天，然后使用TH1/TH2/TH9/TH9/TH17/TH17/TH22/TREG细胞因子17-斑鼠小鼠Pastareplex PaneLecific（Thermo fishericific）分析上网。根据制造商的说明，使用细胞因子珠阵列（BD生物科学）从B16-F10共培养物与PMEL T细胞的上清液中单独测量IFNγ。通过小鼠IL-2 ELISA（ABCAM）在细胞培养上清液中评估了PDA7940B细胞（每孔10,000个细胞，96孔板）中的油-2表达，并在用AD-NULL或AD-NULL或AD-OIL-2（每个细胞100 VP）感染后的各个时间点中评估了细胞培养上清液。通过将PBS，AD-NULL或AD-OIL-2（每个肿瘤1×109 VP）注射到PDA7940B肿瘤中，并在72小时后收集到体内表达。通过三个冻融周期分离肿瘤，并通过ELISA分析了小鼠IL-2的匀浆。通过心脏穿刺收集末期血液，并通过离心加工至血清。将IL-2浓度标准化为总蛋白质含量。

　　PDA7940B肿瘤细胞在96孔Xcelligence e-plate（Agilent）中以10,000个细胞接种。二十四小时后，以2：1的比例添加了在油-2的存在下预孵育48小时的转导的CAR T细胞，并在实时细胞分析（RTCA）分析仪（Agilent）中每15分钟记录目标细胞指数每15分钟。先前描述了用核位置RFP转导的B16-F10细胞系的T细胞杀死54。简而言之，将用100 ng ml-1IFNγ脉冲18 h脉冲的B16-F10-RFP+细胞在平底96孔板中以每孔5,000细胞为单位，以进行incucyte Live细胞分析（Essen Bioscience）。PMEL T细胞（O2R或O9R，用MSA-IL-2或MSA-IOL-2预处理48 h）以2：1 E：T比添加每两个小时，使用Incucyte Live Imaging系统每两个小时获得每个井的荧光对比度和荧光图像，并按百分比汇合度量化。还使用incucyte活细胞分析进行了人类TCR T细胞重复杀伤测定法。在6孔板中，将人类黑色素瘤细胞（NRFP-M407，5×105）铺板。在以1：1 e：t的比例中添加了未转导或共转导的人T细胞（与HO2R-NYESO1-TCR或HO9R-NYESO1-TCR共转染，并预孵育48小时48小时。每72小时，黑色素瘤细胞（NRFP-M407，5×105）被添加到每个孔中；在每次肿瘤补给前24小时补充正交细胞因子（MSA-Hoil-2）。

　　使用Xcelligence分析仪进行了人类汽车T细胞重复杀死测定法。将ASPC-1人胰腺肿瘤细胞以每孔10,000细胞的形式播种在96孔Xcelligence电子板上。二十四小时后，在以1：1 e：t的比率下，将M5 CAR – HO2R或M5 CAR-HO9R细胞与MSA-Hoil-2（1 µM）预孵育48小时。每48小时，收集，洗涤，洗涤，重悬于新鲜的MSA-HOIL-2中，并在前一天添加在用肿瘤细胞（10,000孔）的电子板上添加到新的井中。在最后一轮重新刺激之后，收集T细胞通过流式细胞仪进行表型。

　　对于体内B16-F10肿瘤生长实验，使用了早期通用细胞系（少于10段）。将B16-F10细胞（5×105）皮下注入6-10周龄雌性C57BL/6小鼠的右侧。在指示的情况下，将小鼠在ACT前一天用500 CGY的全身照射的500 CGY进行了淋巴管。T细胞（源自雌性小鼠）在肿瘤接种后大约七天或肿瘤可触及时，将T细胞（源自雌性小鼠）传递。具体而言，将5×106的T细胞重悬于每只小鼠的50μlPBS中，并通过恢复注射剂给药。如有指示，小鼠接受了细胞因子的治疗：小鼠血清白蛋白（MSA） - 结合小鼠IL-2（MSA-IL-2）或MSA正交IL-2（MSA-IL-2）（每天2.5×104个单位，腹膜腹膜）连续五天（或连续五天）（或者在何处（或者）开始在Act的比赛中开始。用卡尺进行三次监测肿瘤大小（长度×宽度），并计算体积为（长度×width2）/2）。在从尾静脉的指定时间点收集外周血（10μL），以通过流式细胞仪定量采用转移的PMEL T细胞。根据IACUC指南，当总肿瘤量超过2,000 mm3时，将小鼠安乐死。

　　先前已经描述了同步PDA肿瘤模型52。简而言之，用对照病毒AD-NULL（每次注射1×109 VP）或AD-FIL-2（每次注射1×109 VP）在雌性C57BL/6小鼠中皮下确定的PDA7940B肿瘤在肿瘤内治疗，每天通过50μlPBS（每天）在50μlPBS（每天0和4。200μlPBS。通过腹膜内注射（120 mg kg-1）在第-1天进行基于环磷酰胺的调节化疗。用数字卡尺测量肿瘤尺寸，并计算出如下：体积=（长度x width2）/2。通过皮下注射到相对的侧面，用PDA7940B细胞重新固化小鼠，并在24天后通过卡尺测量记录肿瘤大小。年龄匹配的天真小鼠被同样注射，并作为肿瘤生长的对照。

　　为了在正交 - 环境受体转导的T细胞的体外免疫表型中，将排序的T细胞用一致的一式三份板条板镀干的T细胞。48小时后，收集T细胞并进行表面染色。对于体内评估，通过在指定的时间点进行尾静脉抽样获得外周血。在尸检时，将脾脏压碎，并用PBS在70μm细胞滤网上洗涤以收集脾细胞。在抗体染色之前，用ACK裂解缓冲液处理脾细胞和外周血样品。

　　使用小鼠肿瘤解离试剂盒（Miltenyi Biotec）和Gentlemacs Octo分离剂（Miltenyi Biotec）将B16肿瘤切碎并解离。然后将细胞重悬于PBS中，并通过70μm细胞滤网过滤以获得单细胞悬浮液。在FACS缓冲液中用抗体在4°C下用抗体染色30分钟。补充表5列出了抗体。7-AAD生存力染料用于区分活细胞和死细胞。使用LSRFortessA（BD Biosciences）通过流式细胞仪分析细胞，并使用BD FACSDIVA（v.6.1.2）收集数据。使用FlowJo软件（V.10，BD Biosciences）分析数据。切除PDA7940B肿瘤，称重，用手术刀切碎，并使用由透明质酸酶（2.5 U ML -1），DNase（50 U ML -1）组成的酶鸡尾酒解离，DNase（50 U ML -1），I型I/II/IV（75 U ML -ML -1，35 U ML -ML -ML -ML -ML -1，75 U ML -1，75 U ML -1，75 U ML -ML -1，inp1％青霉素 - 链霉素。根据制造商的说明（Miltenyi Biotec），将CD45阳性细胞从单细胞肿瘤悬浮液中分离出，并存储在液氮中。使用Countbright珠（Thermo Fisher Scientific）对肿瘤浸润的汽车T细胞进行定量，并标准化为肿瘤重量。有关门控策略，请参见补充图3。

　　对于质量细胞仪，首先在室温下用1.6％PFA固定细胞五分钟。用10 mL MaxPar细胞染色缓冲液（流体）洗涤细胞，并在4°C下以970g旋转10分钟。接下来，将细胞在室温下重悬于表面抗体鸡尾酒中30分钟。用5 mL PBS洗涤细胞，并在冰上重悬于1 ml冰冷的甲醇中15分钟。在室温下，再次用Maxpar细胞染色缓冲液再次洗涤细胞，并用细胞内抗体鸡尾酒染色30分钟。最后，用10 mL MaxPar细胞染色缓冲液洗涤细胞，并用互化溶液（Cell-ID Intercalator-ir，201192b）在MaxPar固定中以1：6,000稀释剂进行染色，并用1.6％PFA（FluidiDigm，201067）在4°C下用1.6％PFA（FluidiDigm，201067）染色。使用Fluidigm Helios质量细胞仪获取数据。使用基于Arcsinh尺寸的数据进行的OMIQ进行分析，该数据在Live，Singlet CD45+白细胞或CD8+ T细胞上进行了分析（有关门控策略，请参见补充图4）。使用OPT-SNE将细胞嵌入二维可视化中，并使用Euclidean距离将流量与肘元群集聚类。使用p值显着性阈值为0.05的EDGER确定差异丰富的簇，并且对数转换的倍数变化≥1。使用R包GPLOT生成图。

　　在最近的肿瘤挑战后72小时，在培养基中补充正交细胞因子后24小时，在重复的肿瘤挑战共培养物中收集了人共转导的T细胞（HO2R-NYESO1-TCR或HO9R-NYESO1-TCR）。将T细胞（1×105）培养在96孔板中，在brefeldin a和monensin的情况下，在1：1 E：T比（NRFP-M407或M263）的抗人CD3/CD28 Dynabeads（Thermo Fisher Scientific）或黑色素瘤细胞以1：1 E：T比（NRFP-M407或M263）培养。四个小时后，将细胞在室温下表面染色30分钟，固定并在室温下进行透化以进行细胞内细胞因子染色30分钟。对于来自PDA740B肿瘤的富含CD45+肿瘤的白细胞的细胞内细胞因子染色，用细胞活化鸡尾酒（用Brefeldin A）（Biolegend）（Biolegend）（Biolegend）刺激细胞六个小时，固定/在Cyto-Fix-Fix/Perm Permer Buffer Set（Biole-pery）中（Biole-percy）和ant-ant ant and patififif-and ant-and ant and and and。使用LSRII（BD Biosciences）通过流式细胞仪洗涤细胞并分析细胞。使用FlowJo软件（V.10，BD Biosciences）分析数据。

　　将福尔马林固定的和石蜡包裹的肿瘤标本切成4μm厚的截面上的载玻片，以进行染色。在本研究中使用了基于泰米酰胺信号扩增（TSA）的蛋白石方法进行免疫荧光染色（Opal Polaris 7颜色自动化IHC Kit； Akoya Biosciences; NEL871001KT）。根据制造商的建议，蛋白石荧光团以150稀释度的稀释度使用。为每个生物标志物进行荧光单质子膜，并将其与适当的成色单质子质质量进行比较以评估染色性能。一旦每个目标用单重染色优化，蛋白石6多路复用测定将用于执行载玻片的多重染色。我们将原代抗体应用于小鼠脾样本，作为以前确定用于对照组织的单重染色的优化浓度的对照。使用Bond RX系统（Leica Biosystems）进行染色。多重染色的抗体序列为：FOXP3（OPAL 480），CD4（OPAL 520），PD-1（OPAL570），CD8（OPAL 620）和CD3（OPAL 690）。使用键表位检索溶液2（Leica Biosystems）进行热诱导的抗原检索20分钟后，进行染色。抗体在补充表5中列出，并以1：200的稀释度使用一个小时的孵育。所有荧光标记的载玻片用DAPI对其进行了反染色，并使用适当的曝光时间以×20放大倍率在Vectra Polaris（Akoya Biosciences）上扫描。通过成像信息软件（Akoya Biosciences）分析了来自多光谱摄像机的数据，并使用Halo Image Analysis软件（Indica Labs）进行了量化。

　　小鼠通过二氧化碳窒息而安乐死。死亡后，立即通过心脏穿刺收集血液（每组n = 3只小鼠），进入微型小管（SARSTEDT），并在室温下凝结30分钟，然后以12,000g离心10分钟。分析前将血​​清保存在-80°C下。用小鼠25-PLEX细胞因子面板（IDEXX Bioanalytics）测量血清中的细胞因子水平。用自定义的临床化学面板（IDEXX Bioanalytics）测量Ca，P，K和尿酸的血清水平。

　　对所有小鼠进行了宏观验尸检查的完整尸检。根据RITA指南（https://reni.item.fraunhofer.de/reni/reni/trimming/）修剪福尔马林磨损的组织样品，然后定期处理石蜡嵌入，切片，截切，肝素和eo蛋白（H＆e）（H＆E）。通过对实验设计的董事会认证的兽医病理学家分析所得的载玻片。

　　通过多重荧光RNA ISH（RNASCOPE多重荧光测定，ACD BIO），包括针对针对用CAR和Ortho-Receptors转导T细胞的小鼠逆转录病毒设计的自定义探针的多重荧光RNA ISH（RNASCOPE多重荧光测定，ACD BIO），研究了间皮蛋白表达和CAR T细胞在脑膜中的分布。该测定是在福尔马林固定和石蜡包裹的脑切片上进行的。使用Aperio versa 200幻灯片扫描仪（Leica Biosystems）对所得荧光标记的部分进行了全面的成像。最终使用Aperio ImageScope软件（Leica Biosystems）中包含的对象计数工具对CAR T细胞和间皮蛋白阳性细胞进行计数。

　　对于图2和相关补充材料中描述的体外实验，用5μMOil-2或0.05μm油-2刺激O2R和O9R PMEL T细胞48小时。使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取RNA。根据制造商的建议，使用KAPA mRNA滞留的图书馆制备套件制备RNA-Seq库。在Illumina HISEQ3000平台（50 bp的单端读取）上汇总并进行了排序。使用HISAT2（v.2.0.4）（参考文献55），将读取与小鼠参考基因组（MM9/GRCM38）对齐。使用HTSEQ计数（V.0.6.1）（参考文献56）对基因表达进行定量。使用DESEQ2（参考文献57）进行差异表达分析，然后使用FGSEA（参考文献58）和MSIGDBR（Ref。59）R包进行了随后的基因集富集分析，特别是在注释的基因Set60上，并使用GGPLOT2 R套件进行了可视化。将差异表达的基因过滤至具有小于0.01的调整后P值的基因，并且使用归一化的基因表达（使用deSeq2的RLOG转换计算并通过行缩放）使用pheatmap r rage来可视化基因表达≥1。主成分分析和样品对样品热图分别使用R函数PRCOMP和DIST生成。

　　对于图3中描述的体外实验，用MSA-OIL-2或MSA-IL-2刺激CAR-O2R和CAR-O9R细胞48小时，并使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN）提取总RNA。使用NCounter小鼠免疫学面板（纳米串技术）分析RNA表达。如上所述进行分析。

　　所有未配对的t检验都是双面的。补充表6中提供了精确的p值。对于框和晶须图（图2J），框图代表中位数，第一和第三四分位数，晶须延伸至minima和maxima。除非另有说明，否则n是指生物学而不是技术复制。对于小鼠肿瘤的生长和生存实验，使用相应的ACT模型（B16-PMEL和PDA7940B-膜皮素汽车）选择样本量。治疗前具有相等大小的肿瘤的小鼠是随机的。肿瘤以盲目的方式进行测量。图1B -F中的数据代表了三个独立实验。图2B，E，G中的数据代表了两个独立实验。在图2b中，每组n = 6只小鼠，除了pmel+msa-il-2的n = 5，pmel+msa-il-2的n = 4，淋巴结螺旋。在图2C中，每组n = 6只小鼠，除了BL6 T细胞+MSA-IL-2和PMEL+MSA-IL-2的n = 5。在图2d中，每组n = 6只小鼠，除了PMEL+MSA-IL-2和PMEL+MSA-IL-2（淋巴结螺旋）的n = 5，而BL6 T细胞+MSA-IL-2的n = 3。图2C，D中的数据代表了三个独立实验。图2F中的数据代表了两个独立的实验，结论是通过使用流式细胞术（图2F），质量细胞仪（图2H）和免疫荧光（扩展数据图5G）来证实的。图3A中的数据C – E代表了两个独立实验。图3B中的数据代表了三个独立实验。功效实验（图3i，j）代表了两个独立实验。图4A中的数据代表了两个独立实验。图4B – D中的数据代表了三个独立实验。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。