根据2013年赫尔辛基宣言（3Kenkenken-466），这项研究中的病毒隔离程序得到了东京大都会公共卫生机构审查委员会的批准。京都大学（G0697）的机构审查委员会（G0697）和东京大学医学学院（2021-1-1-0416）审查并批准了京都大学招募的人类题材标本的所有方案。所有人类参与者均提供了书面知情同意。所有使用仓鼠的实验均根据日本科学委员会的适当进行动物实验进行。该方案得到了北海道大学（20-0123）的机构动物护理和使用委员会的批准，以及东京大学医学研究所的动物实验委员会（PA19-75）。

　　第二次接种BNT162B2（Pfizer-Biontech）在第二次疫苗接种后四周收集外周血，并从19个疫苗的外周血中分离出血清（平均年龄，38岁；范围28-59； 26％的男性）。将血清在56°C下灭活30分钟，并在-80°C下储存直至使用。

　　HEK293细胞（人类胚胎肾细胞系； ATCC CRL-1573），HEK293T细胞（人类胚胎肾细胞系； ATCC CRL-3216）和HOS​​细胞（人类骨肉瘤细胞系； ATCC CRL-1543）在dulbecco的Medified Medified Medied中（atcc crl-1543）（atcc crl-1543）（atcc crl-1543）（atccco crl-1543）（高glofied的培养基）（flucco的培养基7）（flucco的培养基）（flucco）的培养基。含有10％的胎牛血清（FBS）和1％青霉素 - 链霉素（PS）。Vero细胞（非洲绿色猴子（Chlorocebus sabaeus）肾细胞系； JCRB0111）在Eagle的最低必需培养基（Wako，051-07615）中保持了，其中包含10％FBS和1％PS。VEOE6/TMPRSS2细胞（非洲绿色猴子（c。sabaeus）肾细胞系； JCRB1819）29在Dulbecco的修改后的Eagle培养基（低葡萄糖）（Wako，041-29775）中保持了，其中包含10％FBS，G418（G418（G418）（1 mm g418）（1 mml-ml-1％）;PS。Calu-3细胞（人肺上皮细胞系； ATCC HTB-55）保存在Eagle的最小必需培养基（Sigma-Aldrich，M4655-500ML）中，其中包含10％FCS和1％PS。如前所述30,31，制备了HOS-ACE2/TMPRSS2细胞，稳定表达人ACE2和TMPRESS2的HOS细胞。HEK293-C34细胞，IFNAR1-KO HEK293细胞通过强力霉素处理表达人ACE2和TMPRSS2 32在Dulbecco修改后的Eagle（高葡萄糖）（高葡萄糖）（Sigma-Aldrich，Sigma-Aldrich，R8758-500ML）中，含有10％FBS，10％fbs的杂物（SIGMA-ALDRICH）（SIGMA-ALDRICH）（SIGMA-ALDRICH）（sigma-Aldrich）和10 µG ML，（1％PS。原发性人鼻上皮细胞（EP01，MD0436）购自上皮，并根据制造商的程序维护。

　　叙利亚仓鼠（男性，4周龄）购自日本SLC。在感染前测量基线体重。对于图2C中的病毒感染实验，h仓鼠通过肌肉内注射0.15 mg kg -1盐酸盐酸盐（Domitor，Nippon Zenyaku kogyo Domitor）的混合物安乐死，hamsters，2.0 mg kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -1二唑仑（Dormicum，maruishi pranmerical，maruishi and cakani caganie and aruishi and cakani and cakani and cakani and cak an and nippon zenyaku kogyo）。（Vetorphale，Meiji Seika Pharma）。B.1.1或B.1.167.2/Delta病毒（100 µL中的105 TCID50）在麻醉下被鼻内感染。测量体重，并在麻醉下用异氟烷（Sumitomo dainippon Pharma）收集口服拭子。对于图4中的病毒感染，在异氟烷麻醉下，每组四个仓鼠在鼻内接种了D614G或D614G/P681R病毒（104 tCID50 in30μl）。每天监测体重7天。为了进行病毒学检查，每组四个仓鼠被室内感染D614G或D614G/P681R病毒（104 TCID50在30μl中）；在3和7 d.p.i.时，仓鼠被安乐死，并收集鼻涡和肺。通过VEOE6/TMPRSS2细胞中的斑块测定确定鼻涡轮和肺中的病毒滴度。

　　在PBS中用4％多聚甲醛固定切除的动物组织，并加工用于石蜡嵌入。将石蜡块与厚的3 µm切片，然后安装在硅烷涂层的载玻片上（MAS-GP，Matsunami）。根据标准方案进行H＆E染色。为了进行免疫组织化学分析（扩展数据图5C），使用了自动稳定器链接48（DAKO）。将脱蜡的切片暴露于Envision Flex靶检索溶液高pH（安捷伦，K8004）在97°C下进行20分钟以激活，并使用了小鼠抗SARS-COV-2 N单克隆抗体（1：400稀释； R＆D Systems； R＆D Systems，1035111，MAB10474-SP）。使用Envision Flex（Agilent）对切片进行15分钟的敏感性，并通过基于过氧化物酶的酶促反应与3,3'-二氨基苯胺四氢氯化物作为底物进行5分钟。

　　病理特征，包括支气管炎或支气管炎，出血或充血，肺泡损伤，肺泡损伤和上皮凋亡和巨噬细胞浸润，II型肺细胞的存在以及大型II型肺细胞的存在的面积（图2F和扩展的数据）是固定的。四层系统为0（负），1（弱），2（中度）和3（严重）。尤其是，为了评估5 d.p.i.大型II型肺炎细胞的面积，对5个以上的II型肺炎细胞的存在划定了，核直径超过10μm / 0.04 mm2的面积超过10μm，并使用fiji软件V.2.2.0在Imagej V.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.2.0。

　　根据制造商的说明，使用全身多物理学系统（PrimeBioscience）测量呼吸参数。简而言之，将仓鼠放在不受限制的散布室中，并允许适应1分钟，然后使用FinePointe v.2.8.0.12146（数据科学国际）在3分钟内获取数据。

　　通过使用体内微切扫描仪（Cosmoscan gxii; Rigaku）在7 d.p.i.使用体内微切扫描仪（Cosmoscan gxii; Rigaku）成像，在7 d.p.i.进行了呼吸器官。在氯胺酮 - 二甲苯和异氟烷下，用于诱导和维持麻醉，将仓鼠放在成像室中，并在90 kV，88μa，Fov 45 mm和像素尺寸90.0μm时扫描4分钟。扫描后，使用Cosmoscan数据库软件v.3.3.27.100（Rigaku）对肺图像进行了重建和分析。

　　肺的定性和半定量视觉图像分析是在三个未感染的叙利亚仓鼠中进行的，并在7 d.p.i.时在7 d.p.i的病毒中感染了D614G（n = 4）或D614G/P681R（n = 4）病毒的仓鼠（n = 4）或D614G/P681R（n = 4）病毒根据人类评分系统进行了调整的CT严重程度评分（扩展数据图10b）用于对肺部异常的严重程度进行评分33。分析每个肺叶的参与度，并根据严重程度从0-4进行评分：0（无，0％），1（最小值，1％–25％），2（轻度，26％–50％），3（中度，51％–75％）或4（严重，4（严重，76％–100 –100％）。总结了五个肺叶的得分，以获得0-20的总严重程度得分，这反映了两个受感染组的异常严重程度。图像是匿名和随机的；得分手对小组分配视而不见。

　　本研究中使用的所有SARS-COV-2基因组序列和注释信息均从2021年5月31日（1,761,037序列）下载。我们首先排除了从非人类宿主收集的病毒的基因组。我们获得了基于Pango注释属于B.1.617谱系的SARS-COV-2变体（即Sublineages B.1.617.1，B.1.617.2/delta或B.1.617.3），用于Gisaid metadata中的每个序列。在分析中未使用一种属于B.1.617谱系（Gisaid ID：EPI_ISL_15444002，在印度隔离）的变体（epi_isl_105444002），因为该变体未分配给三个sublineages中的任何一个，可能是由于212未确定的基因组中的未确定的核苷酸。为了推断B.1.617谱系的流行病学（图1b – d），我们排除了不可用的采样日期信息的基因组。我们分析了属于B.1.617.1，B.1.617.2/delta和B.1.617.3 Sublineages的2,855、13,821和83个序列。

　　2020年8月10日在美国德克萨斯州隔离的SARS-COV-2变体（Gisaid ID：EPI_ISL_2220643）也属于B.1.617.1。但是，该病毒序列的S蛋白（Gisaid ID：EPI_ISL_2220643）既没有L452R和P681R突变，这两种均是B.1.617谱系的特征。因此，在美国分离的EPI_ISL_ISL_ISL_ISL_ISL_2220643序列可能不是当前B.1.617.1谱系的祖先，并且在印度获得的EPI_ISL_ISL_1372093序列可以被认为是B.1.617 Lineage的最古老的例子。

　　为了推断B.1.617 sublineages的系统发育，我们通过去除编码区域中含有未确定核苷酸的基因组来筛选SARS-COV-2基因组。由于属于Sublineages B.1.617.1和B.1.617.2/delta的基因组数量很大（分别为894和6152序列），我们为每个Sublineage使用了150个随机选择的序列。对于B.1.617.3 sublineage，使用了32个基因组。我们使用了2019年12月31日在中国分离的Wuhan-Hu-1菌株（GenBank：NC_045512.2和Gisaid ID：EPI_ISL_402125）和LOM-ASST-CDG1在意大利分离的LOM-ASST-CDG1菌株，于2020年2月20日在意大利分离出（Gisaid ID ID：EPI_ISL_ISL_412973）。接下来，我们收集了334个代表性的SARS-COV-2序列，并使用MAFFT Suite（V.7.407）34中的FFT-NS-1程序对齐整个基因组序列。除去对齐中有间隙的所有位点，并且比对的总长度为29,085个核苷酸。使用IQ-Tree 2 v.2.1.3生成了最大似然树，并使用1,000个引导35生成。基于BIC标准使用GTR+G替代模型。

　　A B.1.617.2/delta分离株（菌株TKYTK1734; GISAID ID：epi_isl_2378732）和含D614G的含D614G b.1.1孤立（菌株TKYE610670; gisaID ID：epi_isl_479681）与sars-cov-2-sars-cov-2 sers-cossive sysement sy。简而言之，将从SARS-COV-2阳性个体获得的100μl鼻咽拭子接种到3级生物安全3级实验室中的VEROE6/TMPRSS2细胞中。在37°C孵育15分钟后，补充了Eagle的最低必需培养基（Fujifilm Wako Pure Chemical，056-08385），含有2％FBS和1％PS，并添加了1％PS，并在5％CO2下以37°C培养细胞。在倒置显微镜（Nikon）下观察证实了细胞质效应（CPE），并且通过RT – QPCR证实了观察到CPE的培养上清液的病毒载量。为了确定病毒基因组序列，使用Qiaamp病毒RNA迷你试剂盒从培养上清液中提取RNA（Qiagen，52906）。使用NEB使用NEB的Illumina（New England Biolab，E7530）制备cDNA库，并由Miseq（Illumina）进行全基因组测序。

　　为了制备工作病毒量，将100μl种子病毒接种到VEROE6/TMPRSS2细胞中（T-75烧瓶中的5×106细胞）。然后，感染后1小时，将培养基替换为Dulbecco改良的Eagle培养基（低葡萄糖）（Wako，041-29775），其中含有2％FBS和1％PS。在2–3 D.P.I.时，收集培养基并离心，并收集上清液作为工作病毒库存。

　　制备的工作病毒的滴定被测量为50％的组织培养感染剂量（TCID50）。简而言之，在感染前1天，将VEOE6/TMPRSS2细胞（每孔10,000个细胞）接种到96孔板中。将连续稀释的病毒量接种到细胞中，并在37°C下孵育3天。在显微镜下观察细胞以判断CPE外观。使用Reed -Muench方法36计算TCID50的值。

　　A B.1.1.7/Alpha分离株（应变QHN001； GISID ID：EPI_ISL_804007）和B.1.351/beta分离株（菌株Ty8-612; GisaID ID：EPI_ISL_1123289）由国立国立感染性疾病研究所提供。如上所述制备这些分离株的工作病毒。

　　感染前一天，将Vero细胞（10,000个细胞），Veroe6/TMPRSS2细胞（10,000个细胞）和Calu-3细胞（10,000个细胞）播种到96孔板中。接种SARS-COV-2并在37°C下孵育1小时。洗涤感染的细胞，并加入180 µL培养基。在指定的时间点收集培养上清液（10 µL），并使用RT – QPCR来量化病毒RNA拷贝数（见下文）。为了监测感染细胞培养的合胞体形成，使用Eclipse TS2（Nikon）获得了明亮场照片。使用Photoshop 2020 v.21.0.2（Adobe）中的“快速选择工具”（Adobe）中的“快速选择工具”作为像素测量浮动合成的尺寸，并根据像素值计算浮动合成的区域。对于表达GFP的重组病毒（扩展数据图6C），使用BZ-X800 Analyzer V.1.1.1.1.2.4（Keyence）分析了使用一为荧光显微镜BZ-X800（键）（键）（键）（键盘），在指定的时间点上获得明亮场和绿色荧光图像。

　　对于感染实验原代人鼻上皮细胞（扩展数据图7b），用Opti-MEM稀释了工作病毒（Thermo Fisher Scientific，11058021）。将稀释的病毒（1,000 TCID50在100μl中）接种到培养物的顶端，并在37°C下孵育1小时。去除接种病毒并用Opti-MEM洗涤两次。为了在培养物的顶端收集病毒，将100μLOpti-MEM应用于培养物的顶端，并在37°C下孵育10分钟。使用Eclipse TS2（Nikon）获得了明亮场和绿色荧光图像。收集了施加的Opti-MEM，我们使用RT-QPCR来量化病毒RNA拷贝数（见下文）。

　　感染前一天，将VEOE6/TMPRSS2细胞（10,000个细胞）接种到96孔玻璃底黑板中，并用SARS-COV-2（100 TCID50）感染。在24 H.P.I.时，在4°C时，将细胞用4％多聚甲醛（PBS）（Nacalai Tesque，09154-85）固定4％。将固定细胞用0.2％Triton X-100在PBS中透化1小时，在4°C下用PBS中的10％FBS封闭1小时。然后使用兔抗SARS-COV-2 N多克隆抗体（Genetex，GTX135570）染色固定细胞。用PBS洗涤3次后，将细胞与Alexa 488偶联的抗兔IgG抗体（Thermo Fisher Scientific，A-111008）孵育1小时。用DAPI染色（Thermo Fisher Scientific，62248）。荧光显微镜在多合一的荧光显微镜BZ-X800（键）上进行。

　　如前所述37进行了斑块测定（扩展数据图2A，C）。简而言之，在感染前一天，将200,000个VEOE6/TMPRSS2细胞接种到12孔板中。用无血清的Dulbecco改良的Eagle培养基（低葡萄糖）（Wako，041-29775）稀释该病毒，其中含有1％PS和20 mM HEPES。去除培养基后，在37°C下用500μl稀释的病毒感染细胞。在2 H.P.I.时，含有3％FC和1.5％羧甲基纤维素（Sigma-Aldrich，C9481-500G）的1 ml安装溶液被覆盖，然后在37°C下孵育。在3 d.p.i.时，除去培养基，并用含有0.9 mm氯化钙和0.5 mm氯化镁的PBS洗涤细胞3次，并用10％甲醛中性缓冲液（Nacalai Tesque，37152-51）固定。用自来水洗涤固定的细胞，用染色溶液（2％晶体紫（Nacalai Tesque，09804-52）在水中干燥并染色30分钟。用自来水洗涤染色的细胞并干燥，并使用ImageJ测量斑块的大小。

　　重组SARS-COV-2是通过圆形聚合酶扩展反应（CPER）产生的，如前所述32,37。简而言之，使用Prirestar GXL GXL DNA聚合酶（Takara，R05050A）制备了编码SARS-COV-2（菌株WK-521，Pango Lineage A; Gisaid ID：epi_isl_408667）29的九个DNA片段。PCR还通过PCR制备了编码肝炎病毒核酶，牛生长激素信号和巨细胞病毒启动子的接头片段。补充表3中提供了相应的SARS-COV-2基因组区域以及用于此过程的PCR模板和引物。混合了十个获得的DNA片段并用于CPER32。为了准备表达GFP复制能力的重组SARS-COV-2，我们使用了片段9，其中GFP基因被插入ORF7A框架中，而不是真实的F9 Fragment32（补充表3）。

　　为了产生重组SARS-COV-2，根据制造商的协议，使用Transit-LT1（Takara，Mir2300）将CPER产物转染到HEK293-C34细胞中。转染后的1天，将培养基替换为Dulbecco改良的Eagle的培养基（高葡萄糖）（Sigma-Aldrich，R8758-500ML），其中含有2％FCS，1％PS和强力霉素（1μgml-1;1μgml-1; Takara; Takara，1311n）。转染后6天，收集培养基并离心，并收集上清液作为种子病毒。为了去除CPER产物（即SARS-COV-2相关DNA），用2μl涡轮DNase（Thermo Fisher Scientific，AM2238）处理1 mL种子病毒，并在37°C孵育1小时。通过PCR验证了从种子病毒中完全去除CPER产物（即SARS-COV-2相关DNA）。如上所述，从种子病毒中制备了工作病毒量。

　　为了产生重组SARS-COV-2突变体，使用Geneart位置定向的诱变系统（Thermo Fisher Scientific，A13312）插入片段8（补充表3），根据制造商的方案，该方案具有以下引物：片段8_s D614G远期，5'-CCAGGTTGCTGTTCTTTTTATCAGGGTGTTAACTGCACAGAAGTCCCTG-3';片段8_s d614g反向，5'-cagggacttgcagtgcagttaacccctgataaagaagaagaacagaagcaacctgg-3';片段8_s p681r向前，5'-agactcagactaattcgtcgggcgggcaCgCACGCACGTAGTGTA-3';根据制造商的协议，片段8_s P681R反向，5'-tacactacgccgccgccgccgcgcgcgagaattagtctgagtct-3'。通过DNA测序服务（FASMAC）测定核苷酸序列，并使用Sequencher v.5.1（基因代码）分析测序数据。使用突变的片段8而不是父母片段8进行SARS-COV-2突变体制备CPER。随后的实验程序与上述父母SARS-COV-2制剂相同。为了验证将突变插入工作病毒中的插入，使用QIAAMP病毒RNA Mini试剂盒（Qiagen，52906）提取病毒RNA，并使用超级标题III逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，18080085）进行反转录，根据制造商的协议。使用Prirestar GXL DNA聚合酶（Takara，r050a）和以下引物通过RT-PCR获得包括插入的突变的DNA片段：WK-521 23339-23364前进，5'-GGGTGGTGGTGGTGGTGTGTGTGTGTGTGTGTTATATATAACACACACACACACCAGGG-3'''''';;和WK-521 24089-24114反向，5'-caaatgagggtctctctagcagcaatatc-3'。如上所述确认了核苷酸序列，并使用Web应用程序Tracy（https://www.gear-genomics.com/teal/）可视化序列色谱图（扩展数据图2B）。

　　通过病毒RNA测序分析验证了工作病毒的序列。使用Qiaamp病毒RNA迷你试剂盒（Qiagen，52906）提取病毒RNA。使用NEB下一个超级RNA库预备套件（新英格兰Biolabs，E7530）制备了用于总RNA测序的测序库。使用Miseq Reagent Kit v3（Illumina，MS-102-3001）进行配对端，150 bp测序。使用FASTP（V.0.21.0）39修剪测序读取，然后映射到谱系A分离物的病毒基因组序列（菌株WK-521； Gisiad; Gisiad ID：EPI_ISL_408667）29或使用GFP插入的WK-521（Ref。32）（V.32）。使用SamTool（V.1.9）41和SNPEFF（V.5.0E）42进行变体调用，过滤和注释。对于临床分离株（b.1.617.2/delta分离株（菌株TKYTK1734； GISAID ID：EPI_ISL_2378732）和D614G含B.1.1分离株分离株（菌株TKYE610670; gisaid ID; gisaid ID：epi_isl_isl_479681），该序列均为序列。补充表4总结了有关突变的信息，并且原始数据沉积在基因表达综合（GSE182738）中。

　　如前所述37,43进行RT – QPCR。简而言之，将5μl的5μl培养上清液与5μL的2×RNA裂解缓冲液（2％Triton X-100，50 mm KCl，100 mM Tris-HCl（pH 7.4），40％甘油，0.8UμL-1甘油，0.8UμL-1重组RNase抑制剂（Takara，2313b）和90分别为10分。添加了稀释的样品（2.5μl）作为RT – QPCR的模板，该模板是根据制造商的协议使用一个步骤TB Green Primescript加RT-PCR套件（Takara，RRRR096A）和以下底漆的：5'-CCGCCATTGCCAGCCATTC-3'。或7500实时PCR系统（应用生物系统）。

　　表达父母D614G（PC-SARS2-S2-S D614G）的SARS-COV-2 S蛋白，B.1.1.7/Alpha（PC-SARS2-S2-S Alpha），B.1.351/Beta（PC-SARS2-BETA）和B.1.617.2/delta（PC-SARS 2 DELTA）的4.4.351/beta（pc-sars2-beta）。一种表达SARS-COV-2 S D614G/P681R突变体的质粒是通过位置定向的诱变PCR使用PC-SARS2-SARS2-S 2614G31作为模板和以下引物产生的：P681R FW，5'-CCCAGACACACACACACACACACACACGAGGGGGGGGGAGGGGAGGGAGGGAGGGGGTCT-3''和P6815'-agaccttgcctcctcctcggtgtgtgtgtctgg-3'。用KPNI和NOTI消化所得的PCR片段，并插入PCAGGS Vector45的KPNI-Noti位点。

　　如前所述31,32,37进行假病毒测定。简而言之，用SARS-COV-2 S蛋白及其衍生物HEK293T细胞（1×106个细胞）对基于SARS-COV-2 S蛋白（1×106个细胞）伪造的表达荧光素酶的报道病毒，用1μgPspax2-In/hibit46，1μg的1μg-pwpi f os cotrandist cotrandist cotrandist cotrancy根据制造商的协议，使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific，L3000015）或PEI MAX（POLYSCIENCES，24765-1）的父母S或其衍生物。转染后2天，收集培养上清液并离心。如前所述31,46，使用HIBIT测定法对制备的假病毒量进行了定量。制备的假病毒储存在-80°C直至使用。在实验中，将HOS-ACE2细胞和HOS-ACE2/TMPRSS2细胞（每50μl10,000个细胞）播种在96孔板中，并以四种不同剂量制备的100μL假病毒感染。在2 d.p.i.时，将感染的细胞用一个GLO荧光素酶测定系统（Promega，E6130）裂解，并使用Centroxs3板读取器（Berthold Technologies）或Glomax Explorer多模型微层读取器3500（Promega）测量发光信号。

　　如前所述47,48,49进行蛋白质印迹。为了量化细胞中切割的S2蛋白水平，将收集的细胞洗涤并裂解在裂解缓冲液中（25 mM HEPES（pH 7.2），20％甘油，125 mM NaCl，1％NonIDET P40替代品（Nacalai Tesque，Nacalai Tesque，Nacalai Tesque，185558-54），蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白3（NACAIR）nacai cocktail（Nacai）nAcai cocktail（nacai）nacai cocktail（nacal）the 3-2-2。通过蛋白质测定染料（Bio-Rad，5000006）对总蛋白进行定量后，用2x样品缓冲液（100 mM Tris-HCl（pH 6.8），4％SDS，12％β-甲醇，20％甘油，20％甘油，20％的甘油，0.05％Bromophenol蓝色），将裂解物稀释，并煮沸10分钟。然后，使用蛋白质印迹分析了10μl样品（50μg总蛋白）。为了量化病毒体中切割的S2蛋白的水平，将含有假病毒的900μL培养基分层在PBS中的500μl20％蔗糖中，并在4°C下以20,000g离心2小时。将沉淀的病毒体重悬于1×Nupage LDS样品缓冲液（Thermo Fisher Scientific，NP0007）中，其中含有2％β-甲醇，并使用蛋白质印迹分析了裂解的病毒体。For protein detection, the following antibodies were used: mouse anti-SARS-CoV-2 S monoclonal antibody (1A9, GeneTex, GTX632604), rabbit anti-ACTB monoclonal antibody (13E5, Cell Signalling, 4970), mouse anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody (183-H12-5C, obtained from the HIV Reagent Program,NIH, ARP-3537), horseradish peroxidase (HRP)-conjugated donkey anti-rabbit IgG polyclonal antibody (Jackson ImmunoResearch, 711-035-152) and HRP-conjugated donkey anti-mouse IgG polyclonal antibody (Jackson ImmunoResearch, 715-035-150).根据制造商的说明，使用SuperSignal West Fem Tem Tem Tem Temto最大敏感性底物（Thermo Fisher Scientific，34095）或Western Blot超敏感的HRP底物（Takara，T7104A）根据制造商的说明。使用Amersham Imager 600（GE Healthcare）对频段进行可视化，并使用Image Studio Lite V.5.2（Li-Cor Biosciences）对条带强度进行定量。 或ImageJ v.2.2.0。

　　如前所述37进行了SARS-COV-2 S基融合测定。该测定法使用编码肾荧光素酶（RL）和GFP基因的双重分蛋白（DSP）。通过转染48,50在效应子和靶细胞中表达各自的分裂蛋白DSP1-7和DSP8-11。简而言之，在第1天，在六孔板中以0.6-0.8×106个细胞的密度制备了效应细胞（即表达S表达ACE2的细胞）（即表达ACE2的细胞）。为了制备效应细胞，使用Transit-LT1（Takara，miR2300）将HEK293细胞与400 ng的S表达质粒和400 ng PDSP1-7共转染。为了制备靶细胞，将HEK293细胞用PC-ACE2（0 ng，200 ng或1,000 ng）和PDSP8-11（400 ng）共转染。除上述质粒外，还将选定井中的靶细胞与PC-TMPRSS2（40 ng）共转染。在第3天（转染后24小时），将16,000个效应细胞分离并重新播放到96孔黑板中（Perkinelmer，6005225），并在六孔板中以每2毫升的每2毫升1,000,000个细胞的密度回收靶细胞。在第4天（转染后48小时），将靶细胞与耐元活细胞底物（Promega，E6481）孵育3 h，然后分离，然后将32,000个靶细胞添加到带有效应细胞的96孔板中。使用Centro XS3 LB960（Berthhold Technologies）在指定的时间点上测量RL活性。用兔抗SARS-COV-2 S单克隆抗体（HL6，Genetex，GTX635654）或兔抗SARS-COV-2 S S1/S2 S1/S2多克隆抗体（Thermo Fisher Scientific，PA5-PA5-112048）用兔抗SARS-COV-2 S单克隆抗体（HL6，Genetex，GTX635654）染色的S蛋白被染色。正常的兔IgG（SouthernBiotech，0111-01）用作阴性对照，APC偶联的山羊抗兔IgG IgG多克隆抗体（Jackson Immunoresearch，111-136-144）用作二级抗体。使用FACS CANTO II（BD Biosciences）和FlowJo V.10.7.1分析表面S蛋白的表达水平 （BD生物科学）。将RL活性标准化为表面S蛋白的平均荧光强度，并显示为融合活性。

　　将以下立方多项式回归模型拟合到每个时间序列数据集（图3E）：

　　从拟合的立方曲线的衍生物估计细胞融合的初始速度。

　　使用表达荧光素酶的SARS-COV-2 S假病毒在HOS-ACE2/TMPRSS2细胞上进行了中和测定（请参阅“伪病毒测定”部分）。用D614G S或D614G/p681r S对染色的病毒颗粒与热灭活的人血清样品或三个受体结合 - 结合域中中和的中和抗体的串行稀释孵育（8A5，8A5，ELABSCIENCEElabscience，E-AB-V1028）在37°C下1小时。还包括没有血清的假病毒和中和抗体。然后将80μl假病毒和血清/中和抗体的混合物添加到96孔白板中的HOS-ACE2/TMPRSS2细胞（每50μL10,000个细胞）中，并如上所述测量发光（请参见“ Pseudovirus Assay”部分）。使用Prism 9软件v.9.1.1（GraphPad软件）计算50％中和滴度（NT50）。

　　在使用仓鼠（图2C，D，F，4A，B）的时间表实验中，进行了两种类型的统计检验。首先，为了通过所有时间点评估实验条件之间的差异，将包括实验条件（作为解释变量和时间点）作为定性控制变量，包括实验条件。使用双面WALD测试计算P值。在图2F中，使用HOLM方法计算家庭错误率。其次，为了评估每个时间点的两个条件之间的差异，进行了双面学生的t检验。使用Excel V.16.16.8（Microsoft）或Prism 9 V.9.1.1（GraphPad软件）分析数据。

　　在图5和扩展数据图5中，所示的照片是每个时间点使用3个仓鼠（6个肺）的两个独立实验的代表区域。在扩展数据图3中，进行了四倍的测定。显示的照片代表了每个样本的40个视野。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。