全长大鼠Gluk2（GenBank CAA77778.1）的DNA，在位置567，位置571和位置621处的c处为v（q/r位点）（Q/R位点），然后使用PCR扩增，然后插入PEG Bacmam Vector54。该矢量包括C-terminus，EGFP和链霉亲和蛋白亲和力标签（WSHPQFEK）的凝血酶裂解位点（LVPRG）。使用标准方法54在27°C的SF-900 III SFM培养基（GIBCO）中培养的SF9细胞（Gibco）中产生了芽孢杆菌病毒和杆菌病毒。重组大鼠Gluk2在HEK 293F细胞（ATCC）中表达，在30°C和6％CO2的自由泳293表达培养基（Gibco）中表达。对于贴片钳实验，在Dulbecco的改良Eagle的培养基中使用HEK 293F细胞在37°C和6％CO2中维持，并补充了10％的胎牛血清。

　　重组GLUK2的纯化遵循先前建立的程序，并进行了轻微的修改17。简而言之，将SF9细胞中产生的P2病毒引入HEK 293F细胞（Gibco，R79007），并在37°C下与6％CO2孵育。转导后12-15小时后，将10 mM丁酸钠添加到细胞中，然后将温度降低至30°C。通过低速离心（5,500G，10分钟）收集培养的细胞72小时，然后用1×PBS pH 7.4和另一种离心（5,500G，15分钟）洗涤。将所得的细胞沉淀重悬于50 mL冰冷的裂解缓冲液中，由150 mM NaCl，20 mM Tris-HCl pH 8.0，1mMβ-甲醇，0.8μm的蛋白酶，2μgml-1 lipeptin，2μgml-1 liupeptin，2μmpepstatin a和1mmMMMMMETHYLFONE）floforyyylsylyylsylsylsylyylsylylfonyylm-Alffory（通过超声处理3分钟（15 s开，15 s）裂解细胞。将细胞裂解物离心（9,900g，15分钟）以去除细胞碎屑，并对所得的上清液进行超速切除（186,000g，1小时）以分离细胞膜。在由150 mM NaCl，20 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mMβ-巯基乙醇和1％Digitononin（Cayman Chemical Company，14952）组成的缓冲液中，将获得的细胞膜机械化并溶解2-3小时。另一轮超速离心（186,000克，1小时）去除了不溶性的材料。将上清液与预校准的链霉亲和素连接树脂（2 mL）结合，并在4°C下旋转10-14 h。随后，将结合蛋白质的树脂用30-35 mL缓冲液洗涤，其中含有150 mM NaCl，20 mM Tris-HCl pH 8.0和0.05％的digitonin。将蛋白质在补充2.5 mM Desthiobiotin的12-15 mL相同缓冲液中洗脱。将洗脱蛋白浓缩并在22°C下进行凝血酶消化（1：200 w/w）90分钟，以去除EGFP和链霉亲和素亲和标签。然后将摘要反应注入超糖6 10/300 GL尺寸 - 排斥色谱柱（GE Healthcare） 用含有150 mM NaCl，20 mM Tris-HCl pH 8.0和0.05％digitonin的缓冲液进行预衡。合并对应于四聚体Gluk2的峰值级分，浓缩至6-6.5 mg ml-1（〜60μm），并用于冷冻EM样品制备。除非另有说明，否则所有程序均在4°C下进行。

　　我们利用了用于快速电网制备的内部玻璃化系统（扩展数据图10）。该系统是使用与先前描述的玻璃化设备相似的操作原理构建的43,44。我们分别将Kuhnke HD8286-R-F-24VDC和T Tulead 12 V DC用作下降和印迹电磁阀。螺线管支架，磁锁，印迹纸架和镊子支架在搅拌机3.1.2中使用先前设计的零件43,44作为模板，并使用表格3（FormLabs）3D打印机打印。我们用来组装玻璃化系统的所有零件都从胸部购买了光学表上。设计并在内部设计并组装了电磁驾驶员电路板。螺线管由60 V（跌落）和12 V（印迹）直流电源源提供动力。印迹和撞击螺线管的性能由轴突Digidata 1440控制由夹具10.7软件操作的数字化器。

　　对于冷冻EM电网制备，我们采用了Ultraufoil R 1.2/1.3，300-MESH GOLD GRIDS（EMS）。在施用样品之前，将网格在Pelco EasyGlow清洁系统（Ted Pella，25 S，15 MA）中进行处理，以使其表面亲水性。将纯化的GLUK2蛋白在60 µm的浓度下与500 µM BPAM344孵育20-30分钟。随后，将90 µm的琥珀酰化丙它蛋白A迅速添加到GLUK2 -BPAM混合物中，并迅速将1.5 µL的蛋白质样品应用于网格的两侧。此后，将0.5 µL的谷氨酸在10 mm处施加到网格的一侧，距另一侧1.5 s，并立即用液体氮冷却的液体乙烷中。GLU应用和暴跌冻结之间的总时间小于3 s。从添加CONA到GLUK2 -BPAM混合物到玻璃化开始，整个过程在40-45 s中完成。使用Titan Krios透射电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）在300 kV的情况下对网格进行成像，并配备了列后GIF量子能量滤波器（SLIT宽度设置为20 eV）和Gatan K3 Direct Direct Electron检测摄像机。在-1.0至-2.0 µm的散焦范围内，以计数模式收集了22,990张图像的总数，像素大小为0.83Å。通过在50帧的2.5 s暴露时间内使用〜16 e像素-1s-1的剂量速率，达到了〜58 e-Å-2的总剂量。

　　数据是在CryoSparc v4.4.155中处理的（扩展数据图1）。使用贴片运动校正算法对齐电影帧。使用Patch CTF估计进行对比传递函数（CTF）估计。经过CTF估计后，对显微照片进行了手动检查，并且在散焦值，冰厚度和散光的异常值以及具有较低预测的CTF相关分辨率的显微照片中被排除在进一步的处理之外（每个参数相对于整体分布进行单独评估）。大约有5,000个显微照片用于斑点拾取和颗粒提取，然后进行多轮2D分类，以创建模板拾取和训练TOPAZ Model56。删除重复项后，使用模板拾取器和Topaz的结果从完整的显微照片中挑选了8,660,229个颗粒的总数，并用416像素盒的尺寸提取，然后将其固定在128像素盒尺寸中。经过几轮无参考的2D分类和异质的改进，使用了一个使用Ab litible重建创建的一个参考类别和三个自动生成的“垃圾”类，最佳的746,323个颗粒的最佳套件被对四个类别进行异质改进。目前，我们观察了两类具有CONA结合的类（419,597个颗粒）和两个没有CONA密度的类（326,726个颗粒）。分别对结合CONA结合的和CONA-UNBOUND类进行了基于参考的运动校正，并将带有416像素盒大小的颗粒池降低到256像素盒尺寸（或1.34ÅPixel-1），并在整个剩余的处理步骤中使用。

　　代表无圆锥形GLUK2的颗粒对没有施加的对称限制（C1）进行了不均匀的细化，并使用无参考的3D分类算法分类为3类。最佳两个类别的颗粒使用不均匀的细化进行了细化。该过程包括对施加的C2对称性（80,612个颗粒）的改进，导致3.36-Å重建（Gluk2Glu-4倍）和将近四倍的LBD层的重建（GLUK2GLU-4倍），或者在3.84-ammetiment-asshtrulientim Insiment（Gluke）中，并不强加于对称的LBD层，或者没有实施的对称性（C1，72,375个颗粒）。结构。

　　代表具有CONA结合的Gluk2的颗粒进行了不均匀的细化，而无需应用对称约束（C1）。随后，创建了ATD，CONA和LBD – TMD周围的聚焦掩模，并将其用于相应区域的局部改进。与聚焦面膜的局部改进导致ATD区域的3.50-Å重建（C2），CONA二聚体的3.69-Å重建（C1）和LBD – TMD区域的3.40-Å重建（C1）。

　　此外，使用异质的细化将所有CONA结合的粒子分类为五个类别，从而产生具有不同模式的Cona结合与全长Gluk2四聚体的GLUK2类：三个具有两个CONA二聚体和两个类别具有单个CONA二聚体的类。在这五个类别中，有两个人口最多的细化，导致6.66-Å重建（C1，77,587个颗粒）具有单个CONA二聚体结合，而4.29-Å重建（C2，109,827颗粒）与两个Cona Dimer结合。

　　随后，使用Phenix实施的联合算法算法用于创建与一个或两个CONA二聚体结合的GLUK2的复合图，具有4.29-Å和6.66-Å分辨率，以及本地精制的ATD，CONA，CONA和LBD-TMD – TMD区域（输入）。使用傅立叶壳相关性（FSC）= 0.143标准的金标准傅立叶壳相关性估计了在CryoSparc中估计最终图的分辨率。使用FSC = 0.5标准在CryoSparc中计算局部分辨率。使用UCSF Chimerax57可视化冷冻EM密度。该项目中使用的结构生物学应用程序遵守并通过SBGRID配置。

　　最初，GLUK2-CONA模型是在COOT58中使用Cryo-Em密度与GLUK2全长冷冻EM结构（PDB ID：8FWQ）和CONA（PDB ID：PDB ID：PDB ID：3ENR）的坐标构建的。Gluk2和Cona的模型被停靠到Chimera59中的Gluk2 -Cona图中。视觉检查确保了一般的拟合度，并在Coot中进行了手动模型构建。地图的分辨率和质量促进了模型构建的明确完成。为了检查过度拟合，在Phenix60中，对模型进行了0.5Å（使用Shake）的坐标偏移。每个摇动模型都针对相应的未过滤的半图进行了完善，并从嵌合体中产生的模型产生密度。最终的模型在苯金石中进行了真实空间的细化，并在嵌合体或Pymol（Pymol Molecular图形系统，2.0版，Schrödinger）中进行了可视化。在扩展数据表1中总结了模型的验证统计信息。使用dyndom服务器（http://dyndom.cmp.uea.ac.uk/dyndom/）确定域旋转。使用孔61计算孔半径。

　　将编码GLUK2的DNA（在“质粒和菌株”中进行了描述）被引入PIRES质粒中，以在真核细胞中表达，这些细胞是通过下游内部核糖体进入SITE设计的，该真核细胞设计为生产绿色荧光蛋白53。使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）将HEK 293个细胞（ATCC，CRL-1573）在35毫米菜肴中生长的35毫米菜单上生长的HEK 293个细胞（ATCC，CRL-1573）。在室温下转染后24至48小时记录。使用Axopatch 200B放大器（分子设备）记录了来自全细胞的电流，通常以–60 mV的势为电势，在5 kHz处过滤，并使用低噪声数据采集系统Digidata 1440 A和PCLAMP 10.2 10.2 10.2软件（分子设备）在10 kHz下进行了数字化。外部溶液包含（以毫米为单位）：150 NaCl，2.4 kCl，4 CaCl2、4 mgCl2和10 HEPES pH 7.3；将7 mM NaCl添加到包含3 mM GLU的细胞外激活溶液中，以改善两管Theta玻璃移液器的两种溶液之间的边框可视化，从而使其更精确的位置调节以进行更快的溶液交换。内部溶液包含（以毫米为单位）：150 CSF，10 NaCl，10 EGTA，20 HEPES pH 7.3。用由压电转换器控制的两桶Theta玻璃移液器实现快速溶液交换。典型的10–90％上升时间为200–300 µs，如录音后在贴片移液器的开口尖端的连接电位中测量。使用Clampfit 10.3和Origin 2023软件（OriginLab Corporation）进行数据分析。

　　GLUK2BPA​​M（PDB ID：8FWS）和GLUK2GLU -CONA – BPAM的结构用作分子动力学模拟的初始原子坐标。GLUK2BPA​​M结构包括LBD，TMD和它们之间的连接器，并包括残基R431至A850。同样，分子动力学模拟中使用的GLUK2GLU – CONA – BPAM结构包括从LBD中的S429开始，并在TMD中以R874结尾。对于GLUK2BPA​​M的分子动力学系统，我们将蛋白质，Na+离子和BPAM分子从冷冻EM结构中保留，并去除所有其他分子。对于GLUK2GLU – CONA-BPAM系统，我们将蛋白质，BPAM，GLU和胆固醇分子从冷冻EM结构中保留下来，并去除所有其他分子。每个模拟盒都是通过将蛋白质插入POPC双层中的Charmm-GUI膜构建器中构建的62,63，并用TIP3P水分子和150 mM KCl溶解它。使用Ambertools20 Package64的“ TLEAP”模块为分子动力学模拟设置了系统。使用通用琥珀色场（GAFF2）65进行所有配体的参数化。GLUK2BPA​​M系统中最终模拟框中的原子总数为304,680，而GLUK2GLU – CONA – BPAM系统的原子总数为313,937。这些盒子包含69,896个用于GLUK2BPA​​M的水分子，Gluk2Glu – Cona – BPAM中的水分子为72,667。GLUK2BPA​​M系统包含6 Na+，207 K+和189个Cl -ions，而Gluk2Glu -Cona -BPAM系统包含212 K+和196 Cl -ions。GLUK2BPA​​M的脂质分子的数量为507，Gluk2Glu -Cona – BPAM的数量为504。

　　Amber20分子动力学软件包的PMEMD.CUDA程序用于所有分子动力学模拟64。Amber FF99SB – ULDN66力场参数用于蛋白质和离子，水的TIP3P模型以及脂质的Lipid14力场67参数。所有平衡和生产模拟均以300 K温度和1条压力的压力在NPT集合中进行。使用Langevin恒温器控制温度，碰撞频率为1 PS -1，并使用Berendsen Barostat控制压力，其松弛时间为1 ps，如Amber20所实现。使用Shake算法68限制所有涉及氢原子的共价键，而整合时间步长为2 fs。使用粒子网埃瓦尔德方法69近似远程静电相互作用，非键相互作用的截止半径为10Å。周期性边界条件均在各个方向上应用。

　　将每个系统最小化，同时保持对蛋白质Cα和配体重原子的约束。接下来，随着温度从0逐渐升高到300 k，水和离子在恒定体积分子动力学模拟下进行平衡，所有蛋白质，配体和脂质重原子在能量最小化位置以40 kcal mol –1Å -2的力量最小化的位置谐音。然后将系统在恒压下的100 ns平衡，逐渐释放出蛋白质和配体的约束，至0.5 kcal mol –1Å -2。对200 ns进行了生产模拟，对孔形成螺旋或非螺旋结构进行了任何限制。

　　使用Ambertools20和VMD 1.9.471的CPPTRAJ70模块对轨迹进行后处理和分析。VMD 1.9.4用于可视化轨迹并生成模拟视频，Pymol用于生成模拟快照图。

　　使用Origin 2023进行统计分析。使用两样本t检验计算统计显着性，如果p <0.05，则假定具有显着性。在所有图中，n代表独立生物学重复的数量。所有定量数据均表示为平均值±S.E.M.

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。