S. Aureus Blar1（Uniprot：Q00419）;MRSA菌株USA300（RefSeq：WP_001096381.1;残基1-585）的残基1-585）或Blar1被用C-末端六位化固醇标签（使用限制性六链球固定的限制性连锁54）。在补充了10 µg ML-1氯霉素的LB培养基中，在大肠杆菌MC1061中进行了克隆和位于位置的诱变。验证DNA序列后，使用标准技术将质粒转化为乳酸乳杆菌55。

　　Blar1构建体在乳酸乳杆菌PNZ9000中使用Nisin控制的基因表达System25表达。在补充10 µg ML -1氯霉素和10 g L -1葡萄糖的DIFCO M17肉汤（BD）中生长表达菌株种子培养。在M17 Blar1表达培养基（M17BEM）中，在30°C的发酵罐（应用）中进行大规模蛋白表达，并在1：100（v/v）比中接种了种子培养。M17BEM是基于M17培养基的BLAR1蛋白表达开发的（补充表2）。灭菌后，将培养基补充10 µg ml -1氯霉素和100 µm硫酸盐。加入氢氧化铵时，在发酵过程中将培养基维持在pH 7。将细胞在600 nm的光密度生长在约1.5左右的光密度，然后将尼日糖添加到5 ng ml -1的最终浓度。在通过离心收集之前，将蛋白质表达2-3小时，然后将细胞冷冻在液氮中，并储存在-80°C下。

　　将冷冻的细胞沉淀重悬于裂解缓冲液（150 mM氯化钠； 50 mM HEPES，pH 7.5）中，并用5 mg ML -1溶菌酶（BIO碱）和20 µg ML -1 DNase I（Roche）（Roche）（Roche）（Roche），并在37°C下孵育1小时。然后将细胞在冰浴中冷却，然后使用约25,000 psi的法国压榨机（Thermo Fisher Scientific）与单个通行证裂解。所有后续步骤均在4°C下进行。将裂解液以18,600克离心30分钟。收集上清液，并以445型Ti转子（Beckman Coulter）的40,000 rpm离心1小时，以颗粒。将膜重悬于裂解缓冲液中，然后使用玻璃Teflon Dounce均匀均匀剂，然后将其冷冻在液氮中，并将其储存在-80°C下直至需要。

　　将膜解冻并在裂解缓冲液中重悬于1％（w/v）N-二烷基-β-麦尔替酰胺糖苷（DDM）1小时以提取膜。这里使用的所有洗涤剂都是从Anatrace获得的。将提取的膜以40,000 rpm在45型Ti转子（Beckman Coulter）中离心45分钟，以使颗粒不透析的膜。The supernatant was then filtered through a 0.45 µm membrane and imidazole at pH 7.5 was added to 20 mM before being loaded onto a 1 ml HisTrap HP (GE healthcare) equilibrated in buffer A (150 mM sodium chloride; 20 mM HEPES, pH 7.5; 0.016% (w/v) Anagrade DDM or 0.01% (w/v) lauryl maltose在0.5 mL min -1时补充了20 mM咪唑的新烯基乙二醇（LMNG））。然后，用20 mM咪唑，15 mL缓冲液A依次洗涤该色谱柱，并用100 mM咪唑洗涤，并用325 mM咪唑在缓冲液中洗脱。然后将蛋白质立即用XK-26色谱柱（Amersham Biosciences）脱盐添加到带有Sephadex G-25培养基（GE Healthcare）的XK-26柱（Amersham Biosciences）中。然后使用搅拌细胞浓缩剂浓缩蛋白质，并在液氮中持续纯化或闪存冻结，然后在-80°C中储存，然后再纯化或闪存冻结，然后在-80°C储存之前，将蛋白质浓缩。使用理论灭绝系数为106,245 m -1 cm -1，通过在280 nm处的吸光度在280 nm处确定Blar1浓度，该浓度使用Expasy57计算得出。

　　在BLAR1的纯化过程中，在SDS-PAGE凝胶上观察到主要全长带下方的条带（扩展数据图2E）。Edman N-terminal sequencing revealed cleavage was occurring between BlaR1 residues Ser72 and Lys73, corresponding to an exposed region of EL1 and loss of transmembrane helices 1 and 2. As this minor cleavage product has not to our knowledge been observed in BlaR1 expressed in S. aureus we expect that this cleavage is due to proteases originating in the L. lactis expression system used.我们没有在我们的冷冻EM子类或重建中看到这种切割产品的任何证据。

　　对于低温EM，使用Grader58速率Zonal超速离心方法进一步纯化LMNG中的BLAR1样品。具体而言，5-25％（v/v）甘油梯度（灯缓冲：5％（v/v）甘油，150毫米氯化钠，20 mm HEPES，pH 7.5，pH 7.5，有或没有0.01％LMNG洗涤剂；重型缓冲液；重型缓冲：25％（V/V）甘油，使用150毫米级别的pH pH，是20毫米。（BioComp仪器）59。对于氨苄青霉素的样品，将BLAR1（F284A）用1 mM氨苄青霉素在冰上孵育约15分钟，然后用250 µM氨苄青霉素制成所有后续缓冲液。将150–250 µL的蛋白质样品叠加到甘油梯度上后，在4°C下，在SW 55 Ti转子（Beckman Coulter）中，它们在55,000 rpm处立即离心8小时。然后使用梯度分级器（BioComp仪器）对梯度进行分级。使用Amicon Ultra Ultra Ultra Ultra分子质量切割离心过滤器（Merck Millipore）以6,000g和4°C的浓度浓缩相关的馏分，然后使用微生物旋转P-30色谱柱（Bio-Rad Laboratories）脱盐到缓冲液中（150 mm sodium sodium sodium chorium chorilide and ph 7.5）。对SDS -PAGE凝胶检查了纯度。对于某些凝胶，将BLAR1与最终浓度为50 µm Bocillin FL27在室温下约5分钟孵育，然后再添加载荷染料以荧光标记传感器结构域。

　　在转移到聚乙烯二氟化物膜之前，将Edman N末端测序的样品分离在SDS-PAGE凝胶上，并使用Coomassie染色。Edman N末端测序是在Spark BioCentre进行的。

　　使用无限制克隆54将来自金黄色链球菌的全长Blai基因（Uniprot：P0A042）用N端T7-TAG克隆到PET21A中。该质粒转化为电竞争性大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞。在补充100 µg ML -1氨苄青霉素的LB培养基中，在37°C下生长转化的细胞。通过添加异丙基β-D-1-硫代乙型甲酰胺糖苷（IPTG），诱导了蛋白表达约0.6-0.8的OD600，并将温度降低至20°C。允许细胞在收集之前过夜表达蛋白质，在液氮中闪烁冰冻，并在-80°C下储存。

　　在4°C下进行蛋白质纯化，并从先前的方案中进行适应60。将细胞重悬于缓冲液2A（50 mM HEPES，pH 7.0）中，其中1个完整的无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Roche），DNase I至〜20 µg ml-1，并在法国压力机中以16,000–25,000 psi裂解。然后，通过硫酸铵沉淀纯化BLAI，顺序添加硫酸铵至50％，60％，70％和80％饱和度。每次添加硫酸铵后，将裂解物与反转孵育15分钟，然后离心以颗粒颗粒。将来自70％和80％饱和硫酸铵溶液的蛋白质颗粒重悬于缓冲液2a中，并在缓冲液2B（50 mM HEPES，pH 7.0; 5％甘油）中透析过夜。然后将蛋白质加载在5 ml肝素柱（GE Healthcare）上，在1 mL min -1的缓冲液2B中平衡。用缓冲液2b洗涤色谱柱，直到稳定下的吸光度为280 nm。用线性梯度的缓冲液2B到缓冲液2C（50 mM HEPES，pH 7.0； 5％甘油； 2 m氯化钠）在60分钟内以2 ml min -1的流量在60分钟内从色谱柱洗脱蛋白。感兴趣的分数集中在10 kDa分子质量切割离心滤波器（Merck Millipore）上，并将其加载到超级档75 10/300柱（GE Healthcare）上，该柱（GE Healthcare）在缓冲液2D中平衡（20 mm HEPES，pH 7.0; 500 mm氯化钠； 500 mm氯化钠； 5％glycerol）。纯化的蛋白质像以前一样浓缩至4 mg ml -1（如在280 nm处的吸光度确定，并使用理论灭绝系数19,940 M -1 cm -1校正使用Expasy Server计算得出的19,940 m -1 cm -1）57，然后在液氮中冷冻并存储在-80°C下，直到需要。

　　Blar1（WT），Blar1（F284a）或Blar1（USA300）在室温下在测定缓冲液（150 mM氯化钠，20 mM HEPES，pH 7.5，0.016％DDM）中与Blai孵育4小时。孵育期后，用SDS载荷缓冲液淬灭反应，并使用蛋白质印迹分析样品。用抗T7-TAG抗体HRP结合物（Novagen）探测蛋白质印迹在TTBS（20 mM Tris，150 mM NaCl，0.1％Tween-20）和3％的非FAT脱脂奶粉中稀释1：15,000。使用西部化学发光HRP底物（Immobilon）开发印迹，并使用Chemi Genius 2 Bio成像系统（Syngene）成像。

　　为了帮助EDMAN N末端测序，将Blai-麦芽糖结合蛋白（MBP）融合构建体与Gly-Ser-Ser接头一起克隆到Blai的C末端。将3 kDa片段转移到聚偏二氟化物膜上的初步尝试失败了，但是当与MBP融合时，转移是微不足道的。BLAI-MBP构建体是使用N末端Decahistidine标签设计的，并将其克隆到具有无限制克隆的PGEX-6P-1表达质粒中。54。

　　如描述的T7标记的BLAI构建体进行表达，并像以前一样在缓冲液3A（25 mM Tris，pH 8和100 mm氯化钠）中裂解，并使用1个完整的EDTA无EDTA无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Roche）和DNase I（Roche）至〜20 µg ml-ml-ml-1。将细胞裂解物以40,000 rpm的45型Ti转子（Beckman Coulter）在4°C下离心45分钟。将上清液通过0.45 µm滤波器过滤，并在将样品加载到1 ml Histrap HP（GE Healthcare）上，将咪唑添加到10 mm中，以0.75 mL min -1平衡的缓冲液3A。然后，用10 CV的2％缓冲液3B（50 mM Tris pH 8，500 mM咪唑和100 mM氯化钠洗涤），然后以40分钟的梯度在40分钟内以1 ml min -1的流量洗脱。含有感兴趣蛋白质的分数集中在Amicon Ultra 30 kDa分子质量切除离心过滤器（Merck Millipore）上。将浓缩蛋白加载到缓冲液3C（25 mm Tris，pH 8.0，100 mm氯化钠）中平衡的SuperDex 75 10/300柱（GE Healthcare）。像以前一样浓缩纯化的蛋白质，将其冷冻在液氮中，并在-80°C下储存直至需要。

　　在LMNG中使用固定的金属亲和色谱在LMNG中纯化BLAR1（F284A），然后在缓冲液B中浓缩并纯化B蛋白和缓冲液样品在1％HNO3中以45SC（100 ppb）作为内标。使用配备有SC-2 DX AutoSampler，DXI-FAST微栖息的泵，气旋喷雾室，三重锥界面，三重锥界面，Quadrupole iion deviplector和通用电池技术，使用Nexion 300D（Perkin Elmer）系统进行了电感耦合等离子体质谱法，以确定锌浓度。使用IV-Stock-4校准标准（无机企业）进行校准。所有元素均以氨的反应模式（使用动态反应细胞技术）作为反应气体运行，以去除潜在的多原子干扰。确定66ZN的检测极限为0.765 ppb。

　　对于所有低温EM数据集，在280 nm的0.27–0.35处将3 µL蛋白质样品施加3 µL蛋白质样品之前，将C-Flat（1.2/1.3）300个网格（原子芯）发出发光。使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）在4°C和100％湿度下将网格印迹1-2 s，然后浸入液态乙烷。将网格转移到液氮中进行存储直至成像。

　　在不列颠哥伦比亚大学（Thermo Fisher Scientific）透射电子显微镜（Thermo Fisher fisherific ande epu Fisherification）的高分辨率大分子冷冻电子显微镜设施上，在不列颠哥伦比亚大学（Thermo Fisher Scientific）透射电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）透射电子显微镜（Thermo Fisher 3摄像头）使用EPU（Thermo Fisher Scientific）软件套件的高分辨率大分子冷冻电子显微镜设施进行了筛选。

　　BLAR1（WT）数据集是在不列颠哥伦比亚大学的高分辨率大分子冷冻电子显微镜设施上收集的，使用300 kV Titan Krios（Thermo Fisher Scientific）透射式高温电子显微镜，配备了配备了Falcon 4i（Thermo Fisher Scientific）直接电子探测器（Thermo Fisher Scientific）的电源（Thermo Scientific）persectific optialitific and persectific fistector（Thermo Scientific）。图像以电子计数模式收集，校准放大倍数为×165,000，对应于每个物理像素0.77Å。在EER视频格式中，在875帧上输送到网格的总剂量为50 e -Å2。使用EPU（Thermo Fisher Scientific）进行全自动数据收集，其名义置换范围为0.5至3.0μm。

　　BLAR1（F284A）不含配体数据集是使用300 kV Titan Krios（Thermo Fisher Scientific）传输低温电子显微镜（配备GIF量子能量过滤器（GATAN; GATAN; GATAN; 20 KEV）操作）和K3 Summit（Gatan（Gatan）Director nirecon Detector。图像以81,000x的校准放大倍率以超分辨率模式收集，对应于每个物理像素（每个超分辨率像素0.5295Å）1.059Å。总剂量为33 e -Å2被输送到51帧以上的网格。使用Serialem进行全自动数据收集，其标称散热范围设置为1.5至3.5μm（参考文献61）。

　　BLAR1（F284A） - 氨基林数据集是在HHMI Janelia Research校园中收集的，使用300 kV Titan Krios（Thermo Fisher Scientific）传输低温电子显微镜，配备了球形像差校正器，GIF量子能量过滤器（GATAN）在20 Kev和K3 Sumpit（Gatan）（GATAN）（GATAN）（GATAN）指示（GATAN）指令（G​​ATAN）。以校准的放大倍数为×64,000，以超分辨率模式收集图像，对应于每个物理像素（每位超分辨率像素0.5325Å）1.065Å。在60帧上输送到网格的总剂量为60 e -Å -2。使用Serialem进行全自动数据收集，其标称散热范围设置为1.0至2.0μm（参考文献61）。

　　对于BLAR1（WT）样本，以每个像素为0.77Å的像素大小收集16,599个视频。使用MotionCOR262进行运动校正，并使用CTFFIND463确定了求和和剂量加权显微照片的对比度转移函数（CTF）。手动选择了大约2,000个粒子以在Relion64中生成无参考的2D类平均值。代表性的2D类用作摘要的7,508,828个颗粒的关系（v.3.1和v.4）的自动粒子采摘模板。使用CryoSparc（V.3.2和V.3.3.2）65进行2D分类，导致4,286,427个颗粒向前进行进一步处理。生成了三个初始体积并处理多轮异质细化。最佳体积通过NU-RIFENECT进一步完善，并用C2对称性施加并用作额外的异质细化弹的初始模型，以恢复以前在2D分类步骤中丢弃的良好颗粒。在PYEM66软件包中，将286,692个颗粒的粒子数据集转回了与CS2Star相关，并处理了多个3D分类的多个回合。将与最佳体积相关的颗粒分组，精制并用于贝叶斯抛光67和CTF修补68。部分信号减法用于去除胶束密度。使用C2对称性的重建是从143,227个颗粒产生的，到4.2Å的分辨率为4.2Å，使用Gold-Standard Repinement Propedure（FSC为0.143）和高分辨率噪声替换以纠正软膜效应69。对称膨胀，然后使用覆盖传感器域的掩模进行进一步的3D分类，而无需对齐。一个代表性的类别具有最多的EL1区域的代表性类别包含23,797个独特的颗粒，并精制到4.9Å分辨率，没有使用对称性（C1）。再次在143,227个颗粒上进行了信号减法以去除传感器结构域密度，然后再次进行对称扩展和3D分类而没有对齐，导致66,347个独特的颗粒，这些颗粒精制到3.8Å分辨率，无需对称（C1）（C1）（C1）（C1）（扩展数据表1和扩展数据图图。图3和4）。

　　对于BLAR1（F284A）样品，以每个像素为0.5295Å的超分辨率模式收集了11,844个视频序列，并在MotionCor262进行运动校正期间将每个像素的归纳为1.059Å。使用CTFFIND463确定了总和加权显微照片的CTF。如上所述，使用4,181,855个颗粒自动采摘，进行粒子拾取。在CryoSparc65中进行了无参考的2D分类，导致534,610个良好的颗粒用于进一步处理。如上所述进行了进一步的粒子分类，并将221,007个颗粒转移回到偏爱中，并进行多个回合的3D分类，并将与最佳体积相关的颗粒分组，精制并用于贝叶斯抛光67和CTF细化68，以及胶束密度通过部分信号来取消。进行了一轮3D分类，而无需对齐，并将属于最佳体积的颗粒进行了分组和完善。通过C2对称平均应用，后处理后产生的体积达到了4.3Å的分辨率（扩展数据图3）。扩展数据中包括一个示例数据处理概述图5。

　　对于BLAR1（F284A） - 培根样品，以每像素为0.5325Å的超分辨率模式收集了10,872个视频系列，并在使用MotionCor262进行的运动校正过程中以每像素为1.065Å。使用CTFFIND463确定了总和加权显微照片的CTF。如上所述进行粒子拾取，并自动采摘5,613,933个颗粒。无参考的2D分类在CryoSparc65中进行，导致216,832个好颗粒。如上所述，使用异质细化进行了进一步的粒子分类，并将245,700个颗粒转移回到相关。进行了多个回合的3D分类，并使用与贝叶斯抛光67和CTF细化的最佳体积，精制，精制，使用的最佳体积相关的粒子进行了多个回合，并通过部分信号减法去除胶束密度。进行了一轮3D分类，而无需对齐，并将属于最佳体积的颗粒进行了分组和完善。后处理后所产生的体积达到了4.6Å的分辨率，C2对称性平均应用（扩展数据图3）。

　　使用BLAR1（WT）跨膜重建到3.8Å分辨率的模型构建的跨膜和BLAR1结构的跨膜和催化区域的预测。删除了不正确的区域，并在COOT72，PHENIX REAL.SPACE PREFINE73中进行了迭代模型构建和改进，并在Symmetry39中进行了密度引导的Rosetta改进。对于传感器结构域，使用phenix dock_in_map自动将S.金黄色葡萄球菌传感器结构域（PDB：1XA7）的X射线晶体结构自动拟合到4.2ÅC2重建中。尽管该区域的本地分辨率较低（扩展数据图3），但清晰的二级结构功能启用了自信位置（扩展数据图7a – c）。残基52-96形成细胞外环EL1的残基并未清楚地解决。Alphafold2（在初始模型建设时不可用）可重复地，确立地预测该环的C末端区域是与传感器 - 域β-内酰胺结合凹槽结合的，该凹槽由重建中的低分辨率特征支持（扩展数据图6G – I）。将Alphafold2的残基87-97的EL1环构象纳入了最终模型，并在Rosetta和Phenix Real.space Preatine中受到广泛密度约束的细化。由于链冲突，传感器域环路413–427被省略。对于具有移动传感器域位置的Blar1（WT）C1（4.9Å）重建，残基413–427没有冲突并包括在内。对于Blar1（F284a）（4.3Å）和Blar1（F284a） - 氨基霉素（4.6Å）重建，将跨膜/催化区域和传感器域停靠在密度中。传感器和跨膜结构域之间的相对距离在BLAR1（WT）（最远），BLAR1（F284A）和BLAR1（F284A）（F284A） - ampicillin（最接近）（最接近的）（残基332-345）之间，与两个采用不同的相对位置相连。对于blar1（f284a）， 最终模型由残基1-55和87–585，对于Blar1（F284a） - 氨基霉素，残基1-55、97-412和428–585（EL1残基87-96和传感器 - 域残基413-427被省略）。两种情况中都包含了两个活性位点锌（扩展数据表1和扩展数据图3、4和6）。

　　使用Phenix75,76中实现的霉菌进行模型验证。使用Pymol（Schrödinger），UCSF Chimera77，UCSF Chimerax78和Adobe Illustrator 2021（Adobe）创建数字。将BLAR1插入与魅力膜膜建造器生成的膜中79。使用默认参数80使用PISA服务器进行蛋白质接口分析。使用Consurf Server81分析了序列保护。

　　在180 rpm的37°C下，将测定中使用的金黄色葡萄球菌菌株（补充表3）培养在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中。SF8300的天然质粒（USA300菌株）包含Blar1-Blai调节基因（PUSA300HOUMR）作为PCR扩增的模板。Blar1-Blai构建体的不同变体是通过剪接重叠PCR产生的，并将其克隆到组成型表达的载体PTXΔ82中。然后通过电穿孔将质粒转化为RN4220。序列验证后，使用噬菌体φ11将质粒引入SF8300ERS（红霉素灵敏的SF8300）中。通过通过TSB中的SF8300串行驱逐PUSA300HOUMR并选择红霉素敏感的菌落83，可以通过驱逐PUSA300HOUMR获得SF8300ERM。PUSA300HOUMR除了包含Blaz及其对照元件（Blar1-Blai）外，还含有红霉素抗性基因84。因此，SF8300Ers缺乏β-内酰胺酶及其对照元件（Blaz-Blar1-blai）。该测定法中使用的质粒和引物的列表分别在补充表4和5中提供。生长含有PTXδ质粒的菌株并将其维持在12.5 µg ML -1四环素中。blar1和blai是用质粒表达的，进而控制了染色体编码的MECA的表达。为此，将Blar1（F284a）-blai克隆到组成型表达的质粒中，并转导至缺乏含有blaz及其调节元件的天然质粒（PUSA300HOUMR）的SF8300ERMS（BLAR1-BLAI）。用相同的质粒转导的SF8300ERms用空载体，功能齐全的blar1-blai或功能减弱的blar1（null）-blaI-blar1（null）-blai（null）-blai（null）构建体用作对照。通过将Blar1和Blai的蛋氨酸起始密码子突变为苏氨酸来创建无效突变体 导致这些蛋白质缺乏菌株。在不存在或存在Nafcillin的情况下，评估了这样产生的等源性菌株的生长特性，Nafcillin是一种易于使用的β-内酰胺抗生素，与甲氧西林在结构上相似。

　　使用Bioscreen C Pro系统（美国生长曲线）进行生长测定。在含有2 µg ML -1 Nafcillin或NO Nafcillin的TSB中，将初始细菌OD600调整为0.1，将这些混合物的200 µL添加到三次三份中的蜂蜜Comcomb微孔板（生长曲线）中。包括没有任何抗生素的TSB的井作为对照。每30分钟记录读数在600 nm的24小时。温度设置为37°C。定居时间设置为30 s，摇动时间为15 s。使用DNASTAR软件进行DNA序列分析。除测序以外的所有实验至少重复两次。本研究中描述的所有质粒构建体和点突变的保真度均通过Sanger测序验证。

　　金黄色葡萄球菌MRSA252 SPSB的基因（Uniprot：Q6GIC3）使用NDEI和XHOI位点克隆到表达载体PET28A+（Novagen）中。表达的蛋白质具有N末端六位碱标签，其次是凝血酶裂解位点（MGSSHHHHHHHSSGLVPRGSHM）。质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3）。用50 mL的过夜培养物接种了补充卡纳米霉素（0.05 mg ML -1）的一升LB培养基。将细胞在37°C下以摇动（250 rpm）生长，直到OD600为0.6，此时将IPTG的1 mM添加到培养物中以诱导蛋白质表达。诱导后将细胞生长4小时，然后通过离心（6,000g，在4°C下5分钟）颗粒。然后，将5 g的细胞沉淀重悬于25 mL的缓冲液A（20 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl）中，然后使用声音爆炸器500型（Thermo Fisher Scientific）进行超声处理，并具有15 s的脉冲和30 s的休息周期，在30％的振幅中，通过冰和裂解，通过5 min py a emuls cilter（通过Emuls imuls pyine）（通过Emulsiflix-C3）进行了3次循环。通过离心（在4°C下35,000克）阐明所得的细胞裂解物。将颗粒重悬于25 mL的缓冲液中，并以0.1％的triton X-100重悬，然后散发50次离心（在4°C下35,000克30分钟）。然后将澄清的上清液进行Ni2+-NTA亲和色谱纯化。将包含HIS标签的SPSB的澄清的上清液倒在含有3 mL Ni2+带电的树脂（QIAGEN）的柱上，该树脂（Qiagen）用动力学缓冲液（含0.01％DDM的缓冲液A）预取平。将色谱柱用30毫升的动力缓冲液洗涤两次，其中包含前10毫米，然后洗涤20毫米咪唑。接下来，用阶梯梯度洗脱了His标记的SPSB，该梯度由6毫升的动力学缓冲液创建，其中含有咪唑的100至500毫米咪唑的浓度增加。使用Amicon Ultrycentrifugal滤波器（Millipore）将含有纯化SPSB的分数浓缩至1 mL 用3 kDa截止，并在4°C下透析1 L的动力学缓冲液过夜。蛋白质浓度由BCA测定法（Thermo Fisher Scientific）根据制造商的规程确定。

　　分析反应缓冲液（150 mm氯化钠； 20 mm HEPES，pH 7.5，0.5，0.01％（w/v）LMNG）中的SPSB介导的BLAR1裂解，BLAR1（WT）或BLAR1（WT）或BLAR1（G331K）（G331K）。在SDS-PAGE之前，将所得的样品与Bocillin-FL27孵育5分钟。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。