所选样品量与该领域所使用的样品量相似：n = 4-5个样品用于评估血清76,77，细胞10,78，Tissues 10,16,78,79，Nematodes80,81,81,82和Flies83,84,85;n = 4–5个样品，以确定组织中的OCR 78,86和线虫87,88,89;n = 3–4个样品以确定特定基因的mRNA水平；n = 2–6个样品，以确定特定蛋白质11的表达水平和磷酸化水平；n = 20–33个细胞，以确定轴易位和溶酶体pH10,12；n = 4重复以确定SIRT1活动30,90；n = 200蠕虫，以确定寿命91,92,93；n = 60蠕虫，以确定HealthSpan94,95,96；n = 200蝇，男性或女性，以确定寿命97,98,99；n = 60蝇，男性或女性，以确定HealthSpan100,101,102；n = 4–8小鼠的能量消耗（EE）和呼吸商（RQ）计算78；n = 5小鼠，用于身体成分anaylses78;n = 6小鼠肌肉纤维型分析74,103,104;n = 10–11只小鼠，用于运行持续时间分析12,78;n = 35–38小鼠用于抓握强度分析78。没有使用统计方法来预先确定样本量。所有实验发现均如图传奇中所述重复，所有其他复制尝试都是成功的。对于动物实验，将小鼠，线虫和苍蝇放置在相同的情况或位置。对于细胞实验，将每种基因型的细胞培养在同一CO2孵化器中，并并行接种。设计和执行每个实验以及适当的对照，并在相同条件下收集和分析了用于比较的样品。尽可能地应用随机化。例如，在MS分析（对于代谢物和蛋白质）中，对样品进行处理和分析。对于动物实验，将每种基因型中的性别匹配（对于小鼠和苍蝇）和年龄匹配的同窝动物随机分配给LCA或车辆治疗。在细胞实验中， 每种基因型的细胞平行地种子并随机分配给不同的治疗方法。否则，不会进行随机化。例如，执行IB时，需要按特定顺序加载样品才能生成最终数字。尽可能地使用盲。例如，样品收集和处理过程中的样品，笼子或琼脂板或小瓶被标记为代码名称，后来被挑选和处理动物或细胞的个人揭示了，但在评估结果之前没有参与样品收集或处理。同样，在显微镜数据收集和统计分析期间，观点是随机选择的，并且经常由不同的操作员进行，从而防止了所需表型的潜在偏见选择。否则，不会进行盲目，例如在体外测量OCR和SIRT1活性，因为为特定反应添加了不同的试剂。

　　从杰克逊实验室获得了WT C57BL/6J小鼠（000664）。如先前所述，生成并验证了Axinf/f（Axin1f/f）和LAMTOR1F/F小鼠。AMPKA1F/F（014141）和AMPKA2F/F小鼠（014142）从S. Morrison提供的Jackson实验室获得，由R. Huganir提供。AXIN2F/F小鼠（T008456）购自上海模型生物中心。肌肉特异性Lamtor1-敲除（LAMTOR1-MKO）小鼠和肝脏特异性LAMTOR1-KNOCKOUT（LAMTOR1-LKO）小鼠是通过交叉的LAMTOR1F/F小鼠与McK-CRE和Alb-CRE小鼠的交叉和ALB-CRE小鼠的交叉和验证的Axin-lkko MITE的交叉和axin-lkko kaxin生成的lamtor1f/f小鼠的生成（在参考文献13中进行了验证），AXIN1/2-MKO小鼠是通过将AXIN1/2F/F小鼠与HSA-Creert2小鼠（025750; Jackson Laboratory）交叉的。AXIN1和AXIN2从AXIN1/2F/F中，通过腹膜内将小鼠以200 mg kg – 1，每周4次，从肌肉中去除HSA-Creert2小鼠，从肌肉中移出。TULP3F/F小鼠（S-CKO-17725）购自Cyagen。

　　WT V1E1或V1E1（3KR）通过ROSA26-LSL（LOXP-Stop-Stop-loxp）System105引入AMPKA1/2F/F小鼠的肌肉，然后与HSA-Creert2小鼠交叉。在引入V1E1和V1E1（3KR）（触发引入V1E1的表达）之前，肌肉AMPK基因的去除和LSL盒的去除是通过腹膜内肠内向他的他莫昔芬注射小鼠来实现的。将V1E1或V1E1（3KR）引入AMPKA1/2F/F小鼠中，将编码V1E1或V1E1（3KR）的cDNA片段插入Rosa26-Ctv Vector106中，然后使用CSCL密度梯度梯度梯度梯度超级替代方法纯化质粒。接下来，将100μg质粒用500μl二二驱动的水稀释，然后在室温下以14,000g的浓度在30 kDa截止过滤器（UFC503096，Millipore）下以14,000g的浓度浓缩到50μl溶液。将溶液用450μl二耗水的水稀释，然后再进行两轮稀释 - 浓度循环。然后将质粒与50μl二二氧化水混合到最终体积100μl，然后与10μl乙酸钠溶液混合（3 m库存浓度，pH 5.2）。然后将该样品与275μl乙醇混合，然后在室温下孵育30分钟以沉淀质粒。通过在室温下以16,000克离心10分钟来收集沉淀的质粒，然后用800μl的75％（v/v）乙醇（在Di di-Diestled水）洗涤两次。通过将质粒置于酒精燃烧器灯旁边10分钟来蒸发乙醇后，将质粒溶解在100μl无核酸酶的水中。将质粒以及针对小鼠ROSA26基因座的SPCAS9 mRNA和SGRNA进行了显微注射AMPKA1/2F/F小鼠的体外受精（IVF）胚胎。为了产生SPCAS9 mRNA，1 ng pCDNA3.3-HCAS9质粒（通过插入从Addgene 41815（参考文献107）释放的Cas9片段构建，将其稀释到1ngμl– 1）中 使用在热循环仪（T100，Bio-Rad）上使用以下程序进行的高保真DNA聚合酶试剂盒进行扩增：在98°C下进行30 s的预污染；在98°C下定位10 s，在68°C下退火25 s，然后在每个周期在72°C下延伸2分钟；最后在72°C延伸2分钟；循环编号：33。使用以下底漆对：5'-cacccgactgagctccttaag-3'和5'-tagtcaagcttccatggctcgaga-3'。然后按照制造商的说明使用Minelute PCR纯化套件纯化PCR产品。纯化的SPCAS9 PCR产物通过制造商的说明（带有少量修改），使用Mmassage Mmachine T7转录套件进行体外转录。简而言之，将5.5μL（300ngμl-1）的SPCAS9 PCR产物与10μL的2×NTP/ARCA溶液，2μl的10×T7反应缓冲液，0.5μLRNaseRNase抑制剂，2μLT7酶混合物和4.5μl-Fiffub-Fib-Fibe fy Hypation混合了2μL的10×T7反应缓冲液，2μLRNaseRNase抑制剂，2μLT7酶抑制剂。然后将该样品与1μl涡轮DNase混合，然后在37°C下孵育20分钟以消化模板。然后将样品与20μl的5×E-PAP缓冲液，10μl25 mM MNCL2，10μl10mM ATP，4μLE-PAP酶和36μl无核酸酶的水混合，然后在37°C下在37°C下孵育20 min，以使Poly（A）尾巴孵化。然后按照制造商的说明（带有少量修改），使用巨型转录清理套件纯化尾部产品。简而言之，将20μl尾巴的RNA与20μl洗脱溶液混合，然后与350μl结合溶液浓缩物混合。接下来，将250μl乙醇添加到混合物中，然后将其通过过滤器盒，并用250μl洗涤溶液洗涤两次。然后将RNA用50μL预热（在90°C）洗脱溶液洗脱。为SPCAS9 mRNA制备准备了SGRNA，除了GRNA克隆载体（Addgene，41824，Ref。107）用作模板， 并使用了以下程序：在98°C下进行预贬值30 s；在98°C下定位10 s，在60°C下退火25 s，然后在每个周期中在72°C下延伸20 s；最后在72°C延伸2分钟；循环编号：33。使用以下引物：5'-GAATATAATAATAATACCACTATAGGCCCATCTCTCTCTCTAGAAAGAAGAAGACGTTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'和5'-AAAAAAAAGCACCCCCCCCGACTCGACTCGGCGGCGCC-3'。In addition, in vitro transcription was performed using a MEGAshortscript T7 Transcription kit, in which a mixture containing 7.5 μl (100 ng μl–1) purified PCR product, 2 μl T7 10× T7 reaction buffer, 2 μl T7 ATP solution, 2 μl T7 CTP solution, 2 μl T7 GTP solution, 2 μl T7 UTP solution, 0.5 μl RNase抑制剂，制备2μLT7酶混合物和7.5μl无核酸酶的水。另外，没有执行poly（a）尾巴测定法。

　　然后从AMPKA1/2F/F小鼠中将制备的ROSA26-CTV-V1E1，SPCAS9 mRNA和ROSA26 SGRNA质粒显微注射到每个zygote中。为了制备Zygotes，Ampka1/2f/f小鼠（根据参考文献108，修改）首先受到IVF的约束。简而言之，在腹膜内注射孕妇的血清促性腺营养素（PMSG），以每只小鼠的剂量为10 U，将4周大的AMPKA1/2F/F雌性小鼠注射。PMSG注射后46小时，对人绒毛膜促性腺营养素（HCG）的每只小鼠进行了10 U腹膜内注射。在HCG注射后12小时，分离出来自雌性小鼠的输卵管的卵母细胞，以及来自16周龄的16周大的cauda depididymides和Vasa延期的精子，分离出16周大的，已久经考验的Ampka1/2f/f雄性小鼠。为了分离卵母细胞，短暂放在滤纸上，然后在IVF盘中孵育在人体输注液培养基（HTF） - GSH下降（通过将200μlHTF溶液补充，在35毫米的液滴上涂上量的液滴，以供应量的5％gsh，以覆盖油脂的速度，并在液滴下煮​​熟，并在滴水中加入125毫米GSH，并在油脂中凝固，并散发出量的螺旋，并在油脂中凝固，并在油脂中凝固，并在矿床上进行刺激，并散发出量的蜂鸣器，并在油脂中凝固，并在矿物质上散发出量的刺激性，该溶液均匀地刺激了矿物质，该杂物均匀地凝固，并在油脂中进行刺激。使用前37°C持续0.5 h）。然后用镊子撕下植物，并收集内部的卵母细胞并转移到另一个HTF – GSH液滴中。为了隔离精子，短暂地将Cauda附子抑制剂和Vasa延期放在滤纸上，然后在Cauda附子酰胺上穿透26 g针5次。Sperm were then released onto a HTF drop on a sperm capacitation dish (prepared by placing 200 μl HTF solution on a 35-mm dish to form a drop, followed by covering the drop with mineral oil and pre-balancing in a humidified incubator containing 5% CO2 at 37 °C for 12 h before use) by slightly pressing or squeezing the cauda epididymides, followed by incubation in a humidified incubator在37°C下含5％CO2 0.5 h。然后收集电容的运动精子（位于每个HTF滴的边缘），然后收集 然后将它们添加到浸泡在HTF -GSH滴中的卵母细胞中，每滴8μl。The IVF dishes containing oocyte masses and sperm were then cultured in a humidified incubator containing 5% CO2 at 37 °C for 4 h, followed by collecting and washing oocytes in a KSOM drop (freshly prepared by placing 20 μl KSOM medium on a 35-mm dish to form a drop, followed by covering the drop with mineral oil and pre-balancing in a humidified incubator containing 5% CO2在37°C下0.5 h）两次。然后将卵母细胞在IVF碟上的HTF – GSH滴中培养，在37°C下含有5％CO2的加湿孵化器中再培养12小时。然后捡起推定的合子（可以观察到两个原核和一个挤出的第二极体）。接下来，将10个含有ROSA26-CTV-V1E1质粒的PL DNA混合物（20ngμl-1终浓度），SPCAS9 mRNA（120ngμl-1最终浓度）和rosa26 sgRNA（100ngμl-1）（100ngμl-1）对Zygotes和ZygoteS中的每个杂物进行了重新注射，并注入了Anymed中。5％CO2持续16小时。Zygotes (20 per mouse) at the 2-cell stage were picked and transplanted into pseudopregnant ICR female mice (8–10 weeks old, >26 g; prepared by breeding the in-oestrus female with a 14-week-old, vasectomized male at 1 day before the transplantation), and offspring carrying the LSL-V1E1 or LSL-V1E1(3KR) allele were further在与HSA-Creert2小鼠越过之前，将6次杂交到C57BL/6只小鼠。通过基因分型验证小鼠。对于ROSA26基因座的基因分型，使用了以下程序：在98°C下进行预贬持续300 s；在95°C下定位30 s，在64°C下退火30 s，然后在每个周期在72°C下延伸45 s，持续5个周期；在95°C下定位30 s，在61°C下退火30 s，然后在每个周期在72°C下延伸45 s，进行5个周期；在95°C下贬低30 s，在58°C下退火30 s，然后在每个周期在72°C下延伸45 s，进行5个周期；在95°C下贬低30 s， 在55°C下退火30 s，然后在每个循环中在72°C下延伸45 s，进行5个周期；最后在72°C延伸10分钟。对于基因分型的其他基因和元素，使用了以下程序：在95°C下进行300 s的预污染；在95°C下定位30 s，在58°C下退火40 s，然后在每个周期在72°C下延伸30 s；最后在72°C延伸10分钟；循环编号：35。使用以下引物：HSA-CRE用于5'-cagggggggggggaggagtgtgg-3'和5'-tttgcccccccccctcctcctcatataaca-3'；5'-agtggcctcttccttccagaaatg-3'和5'-tgcgactgtgtctgatttcc-3'用于控制HSA-CRE；5'-CCCACCATCACTCCATCT-3'和5'-AGCCTGCTTGGCACACTTAT-3''用于Prkaa1，5'-GCAGGCGAATTTCTCTGAGTTC-3''和5'-TCCCCTTGAACAAGAGCATACC-3'5'-aagaccgcgcgcgcgcgaagtttgtc-3'和5'-atgctctgtctgggggtgtggtggtgg-3''对于Rosa26，5'- cccacacaggcataggtgtct-3'和5'-tttgcacaagccgaccgcgaccttc-3'ROSA26-V1E1重组）和Rosa26-V1e1的3'末端的5'-CTCCACAGGCATAGAGTGT-3'和5'-TTGCACAAGCCCGACCTTTCT-3'5'-CTTCCATGGCTCGAGGTCCAAAAACATTCCTGTGTGGC-3'生成用于测序V1E1的PCR产品。

　　为了生成用肌肉敲除Tulp3的小鼠，并重新引入了Tulp3或Tulp3（4G），将MYC标记的Tulp3或Tulp3或Tulp3（4G）引入了Rosa26-LSL系统下的Tulp3F/F小鼠，如上所述，随后与HSA-Creert2小鼠交叉，然后使用HSA-Creert2小鼠进行交叉，并进入了Tamecection Interection Intropection Intropection tamecection tamecectif thamoxfif thamoxfif thamoxfife thamexife tamemox for tamemox for tamemox。通过使用上述程序和底漆进行基因分型验证小鼠，除了底漆5'-ttaaActaAccaggggtctcactgt-3''和5'-gttccagtacaatggaaaggaaagggg-3'用于tulp3，5'- ccacacacaggcataggcataggcatagaggtgtgtctct-3''Agcttagcctgtcgcatctt-3'用于ROSA26-TULP3，5'- agagaattcggatcgatccatggcatggcttcgcgcgctgcgc-3''和5'- cttccatggctcgagtcgagttcacacgcacgcagccagccagcttacttactgt-3'用于生成pcr产品。

　　所有小鼠实验的方案均由Xiamen University的机构动物护理和动物委员会（XMULAC20180028和XMULAC20220050）批准。除非另有说明，否则在特定的无病原体条件下，将小鼠自由获取水和标准饮食（65％碳水化合物，11％脂肪，24％蛋白质）。光线从8:00到20:00，温度保持在21–24°C，湿度为40–70％。研究中仅使用雄性小鼠，并且整个过程中都使用了雄性同窝对照。

　　每次治疗前将小鼠单独笼子1周。为了禁食，饮食在17:00时从笼子中撤出，而在颈椎脱位指示的时间点杀死小鼠。对于CR，每天17:00喂食每只小鼠的标准饮食2.5 g标准饮食（大约4个月以上的小鼠摄入量的70％）。

　　使用以下年龄的小鼠进行分析：（1）用于IB和腺苷酸盐的测量，WT小鼠年龄为5周（用LCA治疗1周，从4周龄开始），Axin-Lko，Axin-Lko，Axin-Mko，Lamtor1-lko和Lamtor1-lko and Lamtor1-Mko小鼠为7周的lca（从6周）（从6周）开始，开始了1周（从6周开始）(2) for immunohistochemistry (IHC), V1E1(3KR)-expressing mice and WT V1E1-expressing mice aged 18 months (into which tamoxifen was injected at 16 months old, and treated with LCA for 1 month starting from 17 months old), and TULP3(4G)-expressing mice and WT TULP3-expressing mice aged 20.5 months (into which他莫昔芬在16个月大时被注射，并从17个月大的时间开始接受CR 3.5个月）；（3）为了确定LCA在小鼠中的复兴作用，V1E1（3KR）表达小鼠和WT V1E1表达18个月的表达小鼠（在16个月中注射了他莫昔芬在16个月大时用LCA治疗，并从17个月开始用LCA治疗1个月，从17个月开始，从17个月开始），并表达了20个月（4G），并表达了2个（4G），并表达了Mece and tecress and-tecress and tecress and tecress and tecress and tecress and tecress and the-tecress and the-texpress-texpress-texpress-texpress-texpress-texpress-wtrp3。（在16个月大时，向他莫昔芬注入了该莫昔芬，并从17个月大的时间开始进行CR 3.5个月）；（4）对于所有其他实验，小鼠年龄为4周。

　　如前所述1。简而言之，对于基于细胞的实验，将LCA粉末溶解在DMSO中，浓度为500 mm，并在-20°C下等分并储存。将溶液放在室温下10分钟（直到可见沉淀），然后再添加到培养基中。请注意，不允许任何冻结循环避免在储备溶液中重新结合LCA（其他形成类似于薄板的，不溶性的晶体）。

　　对于小鼠实验，将LCA与（2-羟基丙基）-β-环糊精在给予动物之前覆盖。To coat LCA, LCA powder was dissolved in 100 ml methanol to a concentration of 0.01 g ml–1, followed by mixing with 308 ml (2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin solution (by dissolving (2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin in 30% (v/v, in water) methanol to 0.04 g ml–1, followed by a超声处理30分钟）。类似地制备了对照车辆，但没有LCA添加到（2-羟基丙基）-β-环糊精溶液中。在50°C和90 R.P.M.在旋转蒸发器（旋转器R-300，真空泵V-300，Buchi）中，将涂层的粉末储存在4°C下不超过2周，并在给小鼠之前刚将饮用水溶解至1 g L – 1。

　　For nematode experiments, LCA at desired concentrations was freshly dissolved in DMSO and was added to warm (cooled to approximately 60 °C after autoclaving) nematode growth medium109 (NGM; containing 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) bacteriological peptone, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mMKH2PO4-K2HPO4，pH 6.0，0.02％（w/v）链霉素和5μgml– 1胆固醇）。该培养基用于通过添加1.7％（w/v）琼脂来制造NGM板。将板在20°C下存放不超过3天。

　　对于Fly实验，将LCA涂覆并溶解在水中，以进行小鼠实验，并将其添加到Bloomington果蝇储备中心（BDSC）标准玉米面培养基（用于常规培养物）。如前所述，制备BDSC标准玉米面培养基，但修改次要。110。简而言之，将60.5克干酵母，35克大豆粉，255.5克玉米面，20 g琼脂和270毫升玉米糖浆与汤锅中的3500毫升水混合。使用长柄汤匙彻底搅拌混合物，然后煮沸，在此期间，用勺子的背面压实了团块。冷却至大约60°C后，将16.8 mL丙酸加入培养基，然后用勺子搅拌。然后将培养基分配到培养基中（每个6毫升）。培养基的小瓶被单层纱布覆盖，然后在室温下用风扇在室温下轻轻吹过空气。接下来，将100μLLCA溶液（溶解在所需浓度的（2-羟基丙基）-β-环糊精与小鼠中）然后在每个小瓶的培养基表面上分层（添加）在每个小瓶的表面上，然后在室温下用风扇从风扇中吹8小时。实验前，将培养基的小瓶保持在4°C（不超过3天）。

　　如先前所述的12,111，但进行了较小的修改，确定了最大运行能力。简而言之，在正常的光线周期中，对啮齿动物跑步机NG（Ugo Basile，47300）进行了3天的训练，并在黑暗时期进行了测试。在实验之前，将小鼠禁食2小时。跑步机设置为5°倾斜，跑步机的速度设置为坡道模式（以5 m min – 1的速度开始，然后在120分钟内提高到25 m min -1的最终速度）。在连续2分钟内，将小鼠视为耗尽的小鼠并从跑步机上取出5（0.1 mA）。距离旅行的距离被记录为跑步能力。

　　使用先前描述的协议96使用握力强度计（Ugo Basile，47200）确定握力强度。简而言之，小鼠被其尾巴握住，并降低（“降落”），直到前肢或所有四肢都抓住了连接到数字力量规的T型杆。将小鼠进一步降低，以至于身体是水平到设备的程度，然后缓慢地从T -bar中稳步地抽出，直到前肢或所有四肢从钢筋中移除，这导致了克的峰值力。每只小鼠在测量之间用5分钟的间隔进行5次测试。

　　如前所述78，使用定量磁共振（Echomri-100H分析仪； Echo Medical Systems）测量瘦体重和脂肪体重。简而言之，在测量之前，使用油标准对系统进行校准。将小鼠分别称重并插入约束管中，并通过轻轻插入柱塞来固定。然后将鼠标放置，使其像甜甜圈一样curl缩起来，头部靠在管的末端。用三个重复的运行测量每只小鼠的身体组成，并取出平均值进行进一步分析。

　　如前所述，使用代谢笼系统（Promethion Line，CAB-16-1-EU； Sable Systems International）确定小鼠EE。简而言之，该系统的状况与住房小鼠相同。16笼系统中的每个代谢笼子都由一个笼子组成，该笼子带有标准床上用品，食物料斗和连接到负载电池的水瓶进行连续监测。为了最大程度地减少对新环境的压力，在数据收集之前，将小鼠适应（通过气体校准室中的单个住房）1周。用LCA或媒介物控制处理的小鼠被随机分配并容纳，以防止测量中的系统错误。体重和小鼠的体重和脂肪比例是在适应周期之前和之后确定的，每天测量食物摄入和摄入量。从研究中除去了不适应代谢笼的小鼠（例如，它们抵抗饮食）。使用metascreen软件（V.2.3.15.12，Sable Systems）进行数据采集（每个笼子中的5分钟间隔）和仪器控制，并使用宏解释器（V.2.32，Sable Systems）处理原始数据。使用XYZ梁阵列监测卧床活动和位置，梁间距为0.25 cm（梁断裂），并相应地计算了在笼子内行走的鼠标距离。使用配备拉动模式，负压系统的GA-3气体分析仪（Sable Systems）测量呼吸气体。使用FR-8（可见的系统）测量和控制气流，设定流速为2,000 ml min – 1。氧气消耗（VO2）和二氧化碳的产生（VCO2）在ML MIN – 1值中报道。连续测量水蒸气，其对O2和CO2的稀释作用在分析流中数学补偿。使用KCAL H – 1 = 60×（0.003941×VO2+0.001106×VCO2）计算EE（堰方程）。通过使用体重作为协方差分析协方差，分析了平均EE的差异。RQ计算为VCO2/VO2。

　　如前所述74,113确定肌肉纤维类型。简而言之，切除肌肉组织样品，然后在异苯烷中冷冻（用液氮预冰）持续2分钟（直到它们出现白垩白）。然后将组织样品迅速转移到嵌入含有OCT化合物的霉菌中，并在液氮中冷冻10分钟。然后，使用CM1950低温恒温器（Leica）将嵌入的组织样品切成6μm切片，然后将4％多聚甲醛固定10分钟，然后在室温下用自来水清洗5分钟。与PBST（补充5％（v/v）Triton X-100）孵育10分钟后，将切片用BSA溶液（PBS含有5％（M/V）BSA）在室温下阻塞30分钟。用针对MHCIIB的抗体（6μgml -1，在BSA溶液中稀释）在4°C下染色，然后在室温下用PBS 3次5分钟，在4°C下进行过夜。然后将各切片与Alexa Fluor 488偶联的，山羊抗小鼠IgM抗体（1：200在BSA溶液中稀释1：200）在室温下在一个深色加湿的室内在室温下孵育1小时，然后用PBS洗涤PBS 3次，每根5分钟，每次5分钟，在4％的Parahyde paraformaldede中孵化2分钟，然后将其全部洗涤，然后全天候pbs pless twse，然后全部洗涤，然后全部洗涤，并在整个室中洗涤，并在5分钟的温度下洗涤，并孵化。然后将切片用抗MHCI的抗体（6μgml-1，在BSA溶液中稀释，在室温下稀释）3小时，在黑暗的潮湿室中，然后在室温下用PBS缓冲液洗涤3次，然后在室温下进行5分钟，然后用Alexa fluor 594固定的goat anti Antiby（goat anti antiby）固定（goat anti antiby in Antibib inty prody）antiby and antiby（goat anti antiby）antiby（goat anti antibib inty for One）（1）。在室温下，在一个黑暗的加湿室中，然后在室温下用PBS缓冲液洗涤3次，每个5分钟。将4％多聚甲醛固定2分钟，并用PBS两次洗涤，每个PBS在室温下进行5分钟，将切片与针对MHCIIA的抗体一起孵育（6μgml– 1， 在室温下在一个深色湿的室内稀释3小时），然后用PBS缓冲液洗涤3次，在室温下每个5分钟，然后在室温下孵育，然后在Alexa Fluor 647偶联的山羊抗小鼠IgG1抗体中孵育3 h，在室温下，在室温下稀释1小时，在室温下稀释1 h，在室温下进行3分钟，然后在室温下进行5分钟，然后在室温下进行5分钟，然后在室温下进行5分钟，然后在室温下进行5分钟，然后在室温下进行5分钟，然后在室温下进行5分。将组织切片安装在90％的甘油中，并在LSM980显微镜（Zeiss）上可视化。使用ZEN 3.4软件（Zeiss）对图像进行处理和分析，并使用Photoshop 2023软件（Adobe）格式化。

　　线虫（Hermaphrodites）保持在NGM板上，以大肠杆菌OP50作为标准食品扩散。所有蠕虫均在20°C培养。WT（N2 Bristol）和SIR-2.1（VC199）菌株是从Caenorhabditis遗传学中心获得的，SIR-2.2（TM2673）来自国家生物库项目。在实验之前，所有突变菌株均超过六次到N2。除非另有说明，否则将蠕虫保持在NGM板上，以大肠杆菌OP50作为标准食品扩散。LCA的给药是在L4阶段开始的。

　　SIR-2.1/SIR-2.2双敲除菌株是通过将SIR-2.1敲除SIR-2.2敲除菌株击倒而产生的。在越过之前，SIR-2.1敲除雌雄同体进行了同步。用15 ml M9缓冲液（22.1 mM KH2PO4，46.9 mM Na2HPO4，85.5 mM NaCl和1 mM MGSO4）从琼脂板中洗净蠕虫，补充了0.05％（v/v）Triton X-100，每盘，然后是1,000g的1,000克，均为每盘X-100。将蠕虫沉积物用6毫升M9缓冲液悬挂，其中含有50％同步漂白溶液（通过混合25 ml NaClo溶液（5％活性氯），8.3 ml的25％（w/v）NaOH和66.7 ml M9 M9缓冲液，总计100 mL），然后进行2分钟和中心的剧烈摇动2分钟。用12 mL M9缓冲液洗涤沉积物两次，然后用6 mL M9缓冲液悬浮，然后在20°C旋转30 R.P.M.持续12小时。然后将同步蠕虫转移到NGM板上并培养为L4阶段，然后在28°C下进行热震12小时。然后在20°C培养热蠕虫4天，然后将雄性与Sir-2.1敲除雌雄同体交配，再持续36小时。交配的雌雄同体被转移到新的NGM板上，并允许在20°C下再生4天的Sir-2.1敲除雄性。然后将SIR-2.1淘汰男性与Sir-2.2淘汰雌雄同体以1：2的比例（例如，在10 cm NGM板上的4个男性和8个雌雄同体）在20°C下进行36 h，在20°C上交配36 h，并在20°C上交配，并在交配的Hermaphrodites（Sir-2.2淘汰赛）上进行培养，以供另一项2天进行培养。然后采摘后代，并在35毫米NGM板上单独培养，然后在产卵后单独进行基因分型（培养大约2天后）。对于基因分型，将单个蠕虫用5μl的单蠕虫裂解缓冲液裂解（50 mm HEPES，pH 7.4，1毫米EGTA，EGTA，1 mm MGCL2，100 mm KCl，10％（V/V）甘油，0.05％（V/V/V/V），0.05％（V/V/V）NP-40，0.5 mm DTT和Protease insepe insease insease insease insease insease insease insepect。然后将裂解物在-80°C冷冻12小时，然后在热环生（XP Cycler，Bioer）上在65°C下孵育1小时，并在95°C下孵育15分钟。然后将裂解物冷却至室温，然后在热环体上放大基因组DNA，并具有以下程序：在95°C下进行预污染10分钟；在95°C下定位10 s，然后在每个周期中退火并在60°C下延伸30 s；循环编号：35。引物序列如下：秀丽隐杆线虫Sir-2.1，5'-GaatCggctCgtCgtTgCaagtc-3'和5'-agttgtgtggaatggaatgtgtcatggatcct-3';和秀丽隐杆线虫SIR-2.2，5'-TACCGCTCGAAAGATGGGG-3'和5'-CTGGAGCCACGTGTTCTTCTTCT-3'。由SIR-2.1和SIR-2.2敲除产生的后代证实，将个体降到了六次到N2菌株。

　　然后在先前描述的程序15中将SIR-2.3和SIR-2.4基因击倒在SIR-2.1/SIR-2.2双敲除菌株中。简而言之，将同步的蠕虫（围绕L1阶段）放在RNAi板（含1 mg ML – 1 IPTG和50μgml– 1 Carbenicillin）的RNAi板上，与HT115大肠杆菌染色扩散，含有RNAi的HT115大肠杆菌染色，含有SIR-2.3和SIR-2.4（均可在板X6和SIRAN上进行c10 plate x6和ahr a ahr a ahr in ahr in ahr In ahr i9 rnai plate cc. i9 rains in ahr i9 rahr i9 rain in ahr i9 rahr i9。然后通过qPCR确定SIR-2.3和SIR-2.4 mRNA水平的水平来检查敲低效率，其中将大约1,000个蠕虫从RNAi板上用15 ml M9 M9缓冲液洗涤，其中含有Triton X-100，然后在1,000g处进行2分钟的离心液。然后将沉积物用1 mL M9缓冲液洗涤两次，然后用1 ml的Trizol裂解。然后将蠕虫冷冻在液氮中，在室温下融化，然后重复冻结 - 再进行两次。然后将蠕虫裂解物在室温下放置5分钟，然后与0.2 mL氯仿混合，然后剧烈摇动15 s。3分钟后，将裂解液在4°C下以20,000克离心15分钟，将450μl水相（上层）转移到新的无RNase无RNase离心管（Bibopur，Epper，Eppendorf）中，然后将其与450μl的异丙醇混合，然后在20，000 g处与450μl的中心液体混合。将沉积物用1mL的75％乙醇（V/V）洗涤，然后在20,000 g下离心10分钟，然后用1ml无水乙醇洗涤，然后在20,000g下离心10分钟。然后在乙醇蒸发后用20μL无RNase水溶解沉积物。然后，使用Revertra ACE QPCR RT Master Mix与GDNA删除剂试剂盒对溶解的RNA进行反向转录至cDNA，然后使用CFX96 Thermocycler（Bio-Rad）上使用Maxima Sybr Green/rox QPCR Master使用Maxima Sybr Green/Rox QPCR Master进行实时QPCR 使用用于基因分型SIR-2.1/2.2敲除菌株的程序。引物序列如下：SIR-2.3，5'-ACTCTCCTCCTGTGCAAAT-3'和5'-ACTTCCAACGATGTGTCCCAAG-3';和SIR-2.4，5'-GCCGTAAAAAAGTTTGAGCCC-3'和5'-TTTTTTCCATGCTTTTCGGATT-3'。使用CFX Manager软件（V.3.1，Bio-Rad）分析数据。根据获得的CT值评估敲低效率。

　　如先前所述的15，但进行了较小的修改，通过三步策略建立了表达人tulp3或tulp3（4G）的TUB-1基因敲除线虫菌株（4G）。（1）首先将Tulp3或Tulp3（4G）引入N2菌株；（2）随后将这种产生的菌株敲除TUB-1基因的敲除；（3）随后挑选了TUB-1-敲除蠕虫，以进一步用N2菌株脱落。简而言之，要生成表达tulp3或tulp3（4G）的N2菌株，将cDNA插入到PJM1载体中，将GFP作为选择标记物，在NHE I和KPN I位点之间（由Sur-5启动子表达失调），然后将其注射到Worm（200 ng）的孔（200 ng）中，然后将其注射到worm（200 ng）中（程序15。然后将注射的蠕虫在NGM板上回收2天，并选择表达F1 GFP的雌雄同体以进行进一步培养。然后，使用紫外线辐射将质体染色体TULP3或TULP（S4G）表达质粒整合到线虫基因组中，如前所述，建立非摩西的转基因菌株，但进行了较小的修饰。简而言之，在L4阶段挑选了70个表达TULP3或TULP3（4G）表达蠕虫，并与600 µL M9缓冲液一起孵育，然后添加10 µL TMP溶液（DMSO中3 mg ML – 1的库存浓度），并在30 R.P.P.MM.M.M.M.M.M.中旋转。在黑暗中持续15分钟。然后将蠕虫转移到黑暗中没有OP50细菌的10厘米NGM板上，然后在紫外线交叉链接机（CL-508; UVITEC）上以总剂量为35 j cm – 2（暴露于35 s）的紫外线。辐照蠕虫以每毫升浓度为1013的1 ml OP50细菌喂食，然后在黑暗中在20°C下在20°C培养5小时，然后在35毫米NGM板上进行单个培养，持续1周，而不会转移到任何新的NGM板中（以确保F1在进一步选择之前，在进一步选择之前。。选择了表达F1 GFP的雌雄同体并单独培养2天，然后选择了F2 100％表达GFP的雌雄同体以进行进一步培养。然后，通过注入PDD122（PEFT-3 :: Cas9 + TTTI5605 SGRNA）的混合物，将编码TUB-1的基因组序列从该菌株中淘汰，载有SGRNA的载体靶向sgrNA靶向TUB-1（5'- atagctgatCaAaagttcttcttcta-3''for Interon 2和5'gagagcggt-ggtcggtcggtcggtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgttcgtcgtcgtctctcgtcgtcgtcgtctctcgtcgtcgtcgtcgtctctctctcgtcgtctctcgtcgtcgtt内含子7;用Chopchop网站（http://chopchop.cbu.uib.no/）插入了TTTI5605 SGRNA序列的PDD122矢量。F1雌雄同体蠕虫分别在NGM板上培养。产卵后，使用单个蠕虫裂解缓冲液裂解蠕虫，然后使用PCR进行基因分型的SIR-2.1/2.2敲除菌株所述的程序，以及底漆5'-GAGTAATTTTCGGCATTTGTGCTGC-3'和5'-cgagaagagagagagcattcattcattcatttcaaggttttttttt-'使用了。由敲除确认的个体产生的后代被六次降低到N2菌株，而IB检查了Tulp3或Tulp3或Tulp3（4G）的表达水平。选择以相似水平表达TULP3或TULP3（4G）的菌株进行进一步的实验。

　　如上所述构造了具有人V1E1或V1E1（3KR）表达的线虫菌株（N2），但使用了人V1E1或V1E1（3KR）的CDNA，而PJM1载体上的SUR-5启动子则由v1e1 site i替换为v1e1（vha-8）本身（vha-8）本身（vha-8）的启动子（vha-8）（vha-8）本身（vha-8）（vha-8）（vha-8）（vha-85'-CTGACTGGCGCGCCCCTTAGAGATAGATGTGTC-3'和5'-CTCTAGGCGCGCGCGCCGCCGCGCCATTAATAAAATAAATAATAATAATAATATATCATTTTTC-3'）。通过使用引物5'-atggctctcagcgatgctga-3'测序对V1E1或V1E1（3KR）的存在进行验证。

　　对于所有线虫实验，使用了L4阶段的蠕虫。

　　为了确定线虫的寿命，首先将蠕虫同步。在转移到所需的琼脂板之前，将同步的蠕虫培养为L4阶段，以确定寿命。每2天将蠕虫转移到新板上。在转会期间计算了活蠕虫。在与铂金采摘器轻轻接触后没有表现出任何动作的蠕虫被判断为死亡。使用Prism 9（GraphPad软件）生成Kaplan – Meier曲线，并使用SPSS 27.0（IBM）进行统计分析。

　　线虫对氧化应激的电阻被确定，如先前所述94。简而言之，将同步的蠕虫培养到L4阶段，然后施用LCA。经过2天的LCA处理后，将20个蠕虫转移到含有15 mM FESO4的NGM板上。然后在20°C培养蠕虫，在此期间，每1小时对生物和死蠕虫进行一次计数。

　　在25°C和60％的湿度下培养所有苍蝇，并在12小时的光周期循环中培养。在BDSC标准玉米面培养基（用于常规培养）琼脂饮食中培养成年蝇。幼虫和交叉蝇菌株在半定义的富含培养基上饲养，该培养基如前所述，但进行了较小的修饰。简而言之，将10 g琼脂，80克干酵母，20 g酵母提取物，20克肽，30 g蔗糖，60 g葡萄糖，0.5 g mgSO4·6H2O和0.5 g Cacl2·6H2O溶解在1,000 ml di- di蒸馏水中，然后冷却至60°°C，然后冷却至60°C。接下来，将6毫升丙酸添加到培养基中，并将培养基分配到培养基中（每个6毫升）。如上所述，培养基的小瓶被纱布覆盖，并用微风吹动，并在实验前将其保持在20°C（不超过3天）。使用葡萄汁板制备蝇胚。通过将30 g琼脂混合在1升水中，然后在微波炉中煮沸3发，每发3分钟来制备板。接下来，将360毫升葡萄汁，2克甲基对羟基苯甲酸酯和30 g蔗糖依次添加到琼脂溶液中，每个成分在加热的磁搅拌器上充分混合。将培养基分配到100 cm培养皿中，每米10毫升，并在实验前将其保持在4°C（不超过1周）。用于收集胚胎的酵母糊，通过将7 g干酵母与9毫升水在50毫升圆锥体瓶中与金属刮刀完全混合，直到达到花生酱的稠度为止。然后在实验前将糊状在每个葡萄汁板的中心删除。

　　WT蝇菌株（W1118; 3605），SIR24.5应变（SIRT14.5 CN1/SM6B，P {RY+T7.2 = EVE-LACZ8.0} SB1; 32568），SIR25.26菌株（SIRT15.26 CN1; 32657），cas9-canc9-clains sev1 sev1 sc. y1 sc* v1 sc* v。p {y+t7.7 V+t1.8 = nanos-cas9.r} attp2; 78782;来自BDSC。从维也纳果蝇资源中心获得了GAL4诱导的KTUB RNAI携带菌株（W1118; P {GD14210} V29111; 29111）。YWR13S菌株（YW; SP/CYO; MKRS/TM2），CAS DB应变（W1118; BL1/CYO; TM2/TM6B），ATTP3＃（68a4）菌株（Y1 M {Vas-int.dm} ZH-2A W*;M {vas-int.dm} ZH-2A W*;通过越过SIR24.5和SIR25.26菌株，获得了SIR2敲除的文件，然后用红色的眼睛和直翼挑选F1后代（Sir24.5/Sir25.26）。在W1118背景上表达的GAL4（W1118; P {ACT5C-GAL4-W} E1/CYO）的苍蝇首先是通过越过Y1 W*来生成的。p {act5c-gal4-w} e1/cyo雄性与W1118;SP/CYO女性，然后用直翅（W1118; P {ACT5C-GAL4-W} E1/SP）与W1118越过F1雄性；SP/CYO女性。

　　为了产生KTUB（CG9398）基因敲除蝇，有关细节的同步（请参阅“寿命和健康范围的寿命和健康状态评估”部分），以cas9表达cas9的果蝇在收集笼中（59-101; Genesee; Genesee Scientific）中包含葡萄汁板2天。然后允许苍蝇在新鲜的葡萄汁板上放置3发胚，每轮持续1小时，中心含有酵母糊。接下来，通过在每个葡萄汁板上填充水，然后用油漆刷轻轻移开胚胎，然后通过穿过70μm的细胞过滤器（350350; Falcon）来过滤溶液，从而收集800个胚胎。然后将滤纸中的胚胎用自来水以2 ml S – 1 3次，30 s剧烈冲洗，然后在纸巾上粗糙干燥。然后通过将过滤器浸入新鲜制备的50％漂白液（在水中稀释）中，将胚胎解剖，填充10厘米培养皿，持续1分钟，然后用自来水在2 mL S – 1的速度冲洗3次，每个30 s。在纸巾上大致干燥后，将胚胎与腹侧对齐，坐在一段双面胶带（665; 3m苏格兰）上，该胶带卡在滑梯上，然后用一滴矿物油（1：1; 1：1;卤代碳油700覆盖盐油27）。接下来，将2 nl的500ngμl-1 gRNA靶向KTUB（5'-CGCATTACGCGGCGGGACAGGAA-3''和5'-CGGATCTCATCATCGCACGAGT-3'）被注入胚胎的后极，然后遵循先前描述的程序15。将注射的胚胎在18°C的IHC透明加湿室中培养48小时，然后将幼虫转移到半定义，富含培养基的半定义，并在25°C下培养为F0成年人。然后，F0成年人与YWR13S成年人分别交配， 任何带有直翅的F1后代都被丢弃了。然后筛选剩下的F1女性后代，并通过基因分型筛选了KTUB敲除，按照“小鼠，线虫和蝇中线粒体DNA拷贝数的分析”的过程，并带有以下引物：5'-agatcaatcaatcgacccccatgtgccatgtcccg-3'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和'和''和5'-CTTGCCGTAGTCACGTTCCA-3'。来自那些带有KTUB敲除的女性对应物的F1雄性，弯曲的翼后代（可能与YW; KTUB; KTUB - / - /cyo; +/TM2基因型）分别与Cas DB菌株的处女女性分别交配。交配4天后，每个F1雄性被KTUB敲除进行基因分型，而F2男性后代（可能是W1118； KTUB - / - /cyo; +/TM6B基因型）从那些KTUB-KNOCK-KNOCKOUT确认的F1雄性中再次挑选了Case dbiven firgin Femals case db db db case db dbiven firgin。然后将F3雄性弯曲的后代（可能是W1118; KTUB - / - /CYO; +/TM6B基因型）单独与F3弯曲的翅膀后代的处女分别交配。交配10天后，每对F3雄性和女性苍蝇都经过KTUB敲除检查，并且选择了这些F3雄性和女性与KTUB敲除的F4后代相互繁殖，从而导致KTUB –/ - / - - - - - （W1118; ktub - ktub - / - - - / - /ktub - /ktub - /ktub - / - ）flies。

　　通过在attp3＃蝇中表达tulp3（4g）（将tulp3插入染色体III）中，将人tulp3（4G）重新引入了ktub - / - 苍蝇。然后将修饰的苍蝇与YWR13S顺序交叉，并将DB蝇呈回到W1118背景，然后与Ktub - / - 苍蝇交叉。简而言之，为了用Tulp3（4G）表达生成Attp3＃Fly，将编码Tulp3（4G）的cDNA插入Xho I和XBA I站点之间的PUAST-ATTB矢量中。然后将构建体注射到attp3＃蝇的胚胎中，除非浓度为300ngμl -1。然后将F0成年人与YWR13S苍蝇单独交配，而F1雄性的翅膀和橙色的眼睛（可能是YW； +/Cyo； Tulp3-4G/TM2基因型）与CAS CAS DB菌株的原始女性配对。再次与CAS DB菌株的Virgin女性交配，带有卷曲的翅膀和白眼（W1118; +/Cyo; Tulp3-4g/tm6b）的F2雄性交配，然后用卷曲的翅膀和白色的眼睛与F3雄性与F3处女的白眼搭配卷曲的翅膀和白色的眼睛和白色的眼睛，以生成Tulp3（4G）-Eptp3（4G） - +/ +/ +/ +/ +/ +/ +/ +/ +w1111。tulp3-4g/tm6b）苍蝇。Tulp3（4G）表达菌株和KTUB - / - 菌株分别与Bloomington db Flies交叉。Tulp3（4G）的F1后代，带卷曲的机翼（W1118; +/Cyo; Tulp3-4G/MKR）和Ktub的F1后代和肱骨中有其他胸腔（W1118; KTUB - / - / - / - / - /WGSP-1; +/TM6B，TM6B，TB1），以及M./wgsp-1;挑选了肱骨中的其他刷毛（可能是W1118; KTUB - / - /CYO; TULP3-4G/TM6B，TB1）。Tulp3（4G）的表达是通过将挑选的F2后代与表达GAL4的菌株（W1118; P {ACT5C-GAL4-W} E1/CYO）的表达来实现，而F3后代则具有直翼和常规螺旋（W1118; P {ACT5C-GAL4-W} e1/ktp3 E1/ktub - ins/ktppi实验。除了使用tulp3 cDNA外，同样生成了Tulp3-Re引入的KTUB - / - 蝇。

　　将人V1E1（3KR）引入了WT蝇，除了Tulp3，除了将ATTP2＃菌株（将V1E1插入II染色体II中）被用作受体。然后将F0成年人与YWR13S蝇，Cas DB蝇，F2后代本身和表达GAL4的菌株依次交配。W1118;p {act5c-gal4-w} e1/v1e1-3kr蝇用于进一步的实验。

　　如前所述，确定了飞行寿命，但进行了较小的修改。在实验之前，将苍蝇同步。在半定义，丰富的培养基中培养了大约200对苍蝇，每根管子有10对，并允许产卵一天。丢弃母蝇后，再培养胚胎10天，并在第12天粘贴的果蝇被麻醉并用二氧化碳收集（在第12天之前出现的果蝇被丢弃了），然后转移到BDSC标准的玉米面培养基中，并培养了2天。然后，通过使用自制羽毛刷（通过将成人鹅的次级秘密的顶端区域连接到塑料气球棒中的叶片的顶端区域）在麻醉垫上短暂地麻醉二氧化碳来对男性和女性成年人进行排序，并随机分配了200个组和性爱的200名成年人，并随机分配给BDSC标准的Cornmeal Mudied，不带LCA，将其分配给20 flie lca。每2天就将文件转移到新的中型试管中，而无需麻醉，直到最后一个幸存者死亡。在每个管转移过程中，记录了旧管中的死蝇和死亡试管中的死蝇的总和，记录为死亡人数，逃脱或意外杀死的苍蝇（即，在同性培养或被管子挤压的相同性培养或挤压的3天内死亡）。使用Prism 9（GraphPad软件）生成Kaplan – Meier曲线，并使用SPSS 27.0（IBM）进行统计分析。

　　如先前所述117，确定了苍蝇对氧化应激的电阻。简而言之，将同步成年人用LCA处理30天，然后转移到小瓶（每个20蝇）中，每块含有20 mm paraquat或5％（m/v）H2O2溶解或稀释的5％（W/V，在水中）浓度的滤纸。为了确定苍蝇对饥饿的耐药性（食物剥夺），用LCA处理30天的果蝇被转移到带有培养基培养基的小瓶中，被相同体积的1.5％琼脂糖代替，以去除食物供应。每2小时记录死档案，直到最后一个幸存者死亡。

　　用LCA处理的小鼠被宫颈脱位杀死，然后立即剖析甲壳虫肌肉。在室温下，肌肉组织将肌肉组织大致切成多维数据集（边缘长度约为2 mm），然后将其浸泡在rnaprotect组织试剂（每100毫克组织1毫克）中24小时。然后将组织在1 ml Trizol中孵育，然后在三轮冻融周期中孵育，然后匀浆。将匀浆在4°C下以12,000克离心15分钟，并将900 µL的透明上清液（不是顶部的脂质层）转移到无RNase的无RNase管中。接下来，将200 µL氯仿添加到上清液中，然后呈剧烈的涡旋15 s。在4°C下以12,000克离心15分钟后，将450 µL上水层转移到无RNase管中。然后通过添加450 µL异丙醇来沉淀RNA，然后在4°C下以12,000g离心30分钟。用75％乙醇洗涤颗粒两次，一次用100％乙醇洗涤，并用20 µL DEPC处理的水溶解。使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo）确定RNA的浓度。接下来，将1 µg的RNA用DEPC处理的水稀释至最终体积10 µL，在65°C下加热5分钟，并立即在冰上冷却。将随机引物混合物，酶混合和5×RT缓冲液（全部来自Revertra ace QPCR RT主混合物）添加到RNA溶液中，然后在37°C下在37°C下孵育15分钟，然后在98°C下在热社会中孵育5分钟。使用Maxima Sybr绿色/ROX QPCR主混合在Lightcycler 480 II系统（Roche）上使用以下程序：在95°C进行预贬值10分钟，对反向转录的cDNA进行了定量；在95°C下定位10 s，然后在每个周期中退火并在65°C下延伸30 s（根据扩增曲线，熔融曲线，熔融曲线和串行飞行员反应的琼脂糖凝胶上的条带确定 （其中根据每个引物对的估计退火温度设置了串行退火温度），每个引物对的退火温度，以后相同），总共45个周期。鼠标ND1，ND2，ND3，ND4，ND4，ND5，ND5，ND6，ND6，NDFAB1，CYTB，CYTB，UQCRC1，UQCRC1，UQCRC1，ATP5F1B，COX6A1，ATP6，ATP6，ATP8，ATP8，COX1和COX3的引物对产生（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）。小鼠底漆序列如下：GAPDH，5'-GACTTCAACAGCAACTCCCAC-3'和5'-TCCACCCCCCCCCCTGTTGCTGTGTA-3';ND1、5'-TGCACCTACCTATCATCACTCA-3'和5'-C GGCTCATCATCATGATCATAGAATGG-3';ND2，5'-AtactagCaattAttTtttttcataggg-3'和5'-gagggatggatgggttgtgtaaggaag-3';ND3、5'-AagcaaatccatatgaAtgcgg-3'和5'-GCTCATGGTGGTGGATGGAAGTAGAAG-3';ND4、5'-CCTCAGACCCCCTATCCACA-3'和5'-GTTTGGTGTCCTCTCATCATCGGGT-3';ND4L，5'-CCAACTCCATAAGCTCCATACC-3'和5'-GATTTTGACGTAATCTGTTCCG-3';ND5、5'-ACGAAAATGACCCAGACCTC-3'和5'-GAGATGACAAATCCTGCAAAAGATG-3';ND6、5'-TGTGTGGAGTTATGTGTGGAAGGAG-3'和5'-CAAAGATCACCCCCCCAGCTACTACC-3';TFAM，5'-GGTCGCATCCCTCGTCTAT-3'和5'-TTGGGTAGCTGTTCTGTGGAA-3';CS，5'-CTCTCACTGCAGCACCC-3'和5'-TTCATGCCTCTCATGCCACC-3';NDUFS8、5'-TGGCGGCACGTACAAGTAT-3'和5'-GTAGTTGATGATGGTGGTGGTGGTGGCAGGCT-3';NDUFAB1，5'-GGACCGAGTTCTGTATGTCTTG-3'和5'-AAAACCCAAATTCGTCTTCCATG-3';NDUFB10，5'-TGCCAGATTCTTGGGACAAGG-3'和5'-GTCGTAGGCCTTCGTCAAGT-3';NDUFV3、5'-GTGTGCTCAAAGAGCCCGAG-3'和5'-TCAGTGCCGCGAGGTGACTCT-3';ndufa8，5'-gcggagcctttcacagagta-3'和5'-tcaatcacaggggggttgggctc-3';NDUFS3，5'-CTGACTTGACGGCAGTGGAT-3'和5'-CATACCAATTGGCCGCGCGATG-3';NDUFA9，5'-TCTGTCAGTGGAGTGTGGC-3'和5'-CCCATCATCAGACGAAGGTGCAT-3';NDUFA10，5'-CAGCGCGTGGGACGAAT-3'和5'-ACTATGTGTCGAGGGGCCTT-3';SDHA，5'-AGGGTTTAATACTGCATGCCTTA-3'和5'-TCATGTAATGGATGGATGGATGGATGGCATCCT-3';SDHB，5'-agtgcggactatggtgtgtgttg-3'和5'-agacttgctgctGaggTccgtgtg-3';SDHC，5'-TGAGACATGTCAGCCGTCAC-3'和5'-GGGAGACAGAGGAGGACGGTTTG-3';SDHD， 5'-TGGTACCCAGCACATTCACC-3'和5'-GGGTGTGTGTCCCCATGAACGTAG-3';CYTB，5'-CCCACCCATATTAAACCCG-3'和5'-GAGGTATATGAAGGAAAGGTATTAGTAGGG-3';UQCRC1，5'-ATCAAGGCACTGTCCAAGG-3'和5'-TCATTTTCCTGCATCTCCCG-3';UQCRC2，5'-TTCCAGTGCAGATGTCCAAG-3'和5'-CTGTTGAAGGAGGAGGAGGAGGAAGG-3';ATP5F1B，5'-CCGTGAGGGGATGATTTAC-3'和5'-GTCAAACCAGTCAGAGCTACC-3'COX6A1，5'-GTTCGTTGCCTACCTCCTCCCAC-3''和5'-tCTTTACTTACTTACTTACTCATTCATTCATTCATAGCCCCGG-3'''';ATP6，5'-TCCCAATCGTTGTGTAGCCATC-3'和5'-TGTTGGAAAGAAGAATGGAGTCGG-3';ATP8，5'-GCCACAACTAGATACATCAACATG-3'和5'-TGGTTGTTGTTGTTGATTTGGTTGGTGAAG-3';ATP5F1A，5'-cattggtgatggtgtgtgcgc-3'和5'-TCCCAAACACGACAACTCC-3';cox1、5'-CCCAGATATAGCATTCCCACG-3'和5'-ACTGTTCATCATCCTGTTCCTGC-3';cox2，5'-tctacaagacgccacatccc-3'和5'-acggggggggttgttgttgatttcgtct-3';COX3，5'-CGTGAAGGAACCTACCAAGG-3'和5'-CGCTCAGAAGAAGAATCCTGCAA-3';Cox5b，5'-agcttcaggcaccaaggaag-3'和5'-tggggggcaccagcttgtaatg-3'。然后使用比较ΔΔCT方法和LightCycler软件（V.96 1.1，Roche；对于所有QPCR实验相同）计算mRNA水平。

　　用LCA处理1天的L4阶段的线虫用于分析线粒体基因表达。收集约1,000个蠕虫，其中15 mL M9缓冲液含有0.05％Triton X-100（V/V），然后以1,000克离心2分钟。用1 mL M9缓冲液洗涤沉积物两次，然后用1 ml Trizol裂解。然后将蠕虫冷冻在液氮中，在室温下解冻，然后再重复冻融过程2次。然后将蠕虫裂解物在室温下放置5分钟，与0.2 mL氯仿混合，然后剧烈摇动15 s。在4°C下以12,000克离心15分钟后，将450 µL上水层转移到无RNase管中。然后通过添加450 µL异丙醇，然后在4°C下以12,000g离心30分钟来沉淀RNA。用75％乙醇洗涤颗粒两次，一次用100％乙醇洗涤，并用20 µL DEPC处理的水溶解。使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo）确定RNA的浓度。接下来，将1 µg的RNA用DEPC处理的水稀释至最终体积10 µL，在65°C下加热5分钟，并立即在冰上冷却。然后将随机底漆混合物，酶混合和5×RT缓冲液（全部来自Revertra ace QPCR RT主混合物）添加到RNA溶液中，然后在37°C下在37°C下孵育15分钟，然后在98°C下在热社会中孵育5分钟。使用Maxima Sybr绿色/ROX QPCR主混合在Lightcycler 480 II系统（Roche）上使用以下程序：在95°C进行预贬值10分钟，对反向转录的cDNA进行了定量；在95°C下剥落10 s，然后在每个周期中在65°C下进行退火并延伸30 s（根据辅助飞行员反应的琼脂糖凝胶的放大曲线，融化曲线和频带确定（根据每个启动对估计的初步启动温度的估计，并设置了连续退火温度的琼脂糖凝胶），以及每个启动对的温度）和 总共45个周期。用于QPCR的底漆对如前所述119,120，除了秀丽隐杆线虫CTB-1是使用Primer-Blast网站设计的。秀丽隐杆线虫引物序列如下：AMA-1，5'-GACATTTGGCACTGCTTGT-3'和5'-ACGATTGATTGATTCCATGTCTCG-3';NUO-6，5'-CTGCCAGGACATGAATACAATCTGAG-3'和5'-GCTATGAGGAGGATCGTATTCACGACG-3';NUAF-1，5'-GAGACA TAACGAGGCTCGTGTTG-3'和5'-GAAGCCTTTCTTCCAATCATCATCATCG-3';SDHA-1，5'-TTACCAGCGTGCTTCGGAG-3'和5'-AGGGTGTGTGGAGAAGAAGAAGAATGACC-3';SDHB-1，5'-GCTGAACGTGATCGTCTTGATG-3'和5'-GTAGGATGGGCATGACGTGG-3';CYC-2.1，5'-CGGA GTTATCGGACGTACATCAG-3'和5'-GTCTCGCGGGTCCAGACG-3';ISP-1，5'-GCAGAAAGATGAATGGTCCGTTG-3'和5'-ATCCGTGACAAGGGGGGCAGTAATAAC-3';CCO-1，5'-GCTGGATGATCGTTACGAG-3'和5'-GCATCCAATGATTCTGAAGTCG-3';CCO-2，5'-GTGATACCGTCTACGCCTACATTG-3'和5'-GCTCTGGCACGAAGAATTCTG-3';ATP-3，5'-GTCCTCGACCCAACTCTCAAG-3'和5'-GTCCAAGGAAG TTTCCCAGTCTC-3';NDUO-1，5'-agcgtcatttattattgggaaagaagac-3'和5'-aagcttgtgtgctaatcccataaaatgt-3';NDUO-2，5'-TCTT TGTAGGAGGGTCTATTACA-3'和5'-ATGTTAAAAAAAAACCACATTAGCCCA-3';NDUO-4，5'-GCACGGGTTATACATCATCACTTATG-3'和5'-GATGTATGATAAAATCAATTCACCAATAAGG-3';nduo-5，5'-agatgagatttattgtgtgttttctag-3'和5'-cacctagacgatagtagttaatgctg-3';CTC-1，5'-GCAGCAGGGGTTAAGATCTTCTTAG-3'和5'-CTGTTACAAATACAGTTCAAAACAAAT-3';CTC-2，5'-GTAGTTTTTTTTGTGTGGGAGTTTTAGTG-3'和5'-CACAATAATTCATCAATTCCAAACTGATACTC-3';ATP-6，5'-TGCTGCTGCGTGTGATTAAG-3'和5'-ACTGTTAAAGCAAGTGGACGAG-3';CTB-1、5'-TGGTGTTACAGGGGCAACAT-3'和5'-TGGCCTCATTAGGGGGGTCAGC-3'。然后使用比较ΔΔCT方法和LightCycler软件（V.96 1.1，Roche；对于所有QPCR实验相同）计算mRNA水平。

　　用LCA处理30天的果蝇成年人用于确定线粒体基因的表达。对于每个样本，使用20名成年人。将成年人麻醉，转移到1.5 ml的eppendorf管中，然后快速冷冻液氮，然后使用颗粒杵（Z359963-1EA，Sigma）匀浆。然后将匀浆在室温下以1 ml Trizol裂解5分钟，然后在4°C下以12,000g离心15分钟。接下来，将900μl的上清液（无脂质层）转移到无RNase管中，然后与200μl氯仿混合。剧烈涡旋15 s后，将混合物在4°C下以12,000克离心15分钟，将450μl上水层转移到无RNase的无RNase管中。然后通过添加450μL异丙醇沉淀RNA，然后在4°C下以12,000g离心30分钟。用75％（v/v，在水）乙醇中洗涤颗粒两次，并用20μl的DEPC处理的水溶解。使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo）确定RNA的浓度。接下来，将1 µg的RNA用DEPC处理的水稀释至最终体积10 µL，在65°C下加热5分钟，并立即在冰上冷却。然后将随机底漆混合物，酶混合和5×RT缓冲液（全部来自Revertra ace QPCR RT主混合物）添加到RNA溶液中，然后在37°C下在37°C下孵育15分钟，然后在98°C下在热社会中孵育5分钟。使用Maxima Sybr绿色/ROX QPCR Master Mix在Lightcycler 480 II系统（Roche）上使用以下程序进行量子：在95°C下进行预贬值5分钟；在95°C下定位10 s，然后在60°C下退火20 s，然后在每个周期在72°C下延伸20 s，总共40个周期。D. melanogaster启动对QPCR的底漆对如前所述，如下：CG9172，5'-cgtggctgcgcgataggataat-3'和5'-accacatctctggcgtcgtcttc-3';CG9762， 5'-agtCACCGCATTGGTTCTCT-3'和5'-GAGATGGGGGGTGCTTCTCGTA-3';CG17856、5'-ACCTTTTCCATGACCAAGACG-3'和5'-CTCCATTCCTCACGCTCTCTTC-3';CG18809，5'-AAGTGAAGACGCCCAATGAGA-3'和5'-GCCAGGTACAACGACCAGAAG-3';CG5389，5'-atggctacagcatgtgCaag-3'和5'-gacagggggcatgaaggta-3';和ACT5C，5'-GCAGCAACTTCTCGTCACA-3'和5'-CATCAGCCAGCAGCAGCGTCGTCTA-3'。

　　如先前所述78确定小鼠线粒体DNA拷贝数。简而言之，使用Biospin组织基因组DNA提取试剂盒（BioFlux）提取小鼠组织DNA，但按照制造商的指示进行，但进行了较小的修改。简而言之，用LCA处理的小鼠被宫颈脱位杀死，然后迅速剖析腹腔肌肉。然后将肌肉组织在液氮中的陶瓷砂浆中磨碎。接下来，将50毫克的地面组织转移到1.5 ml的Eppendorf管中，然后添加600 µl FL缓冲液和10 µL PK溶液，其中含有2 µl 100 mg Ml – 1 RNaseA。将混合物在56°C下孵育15分钟，然后在12,000 g处孵育15分钟，然后在12,000 g处孵育。接下来，将500 µL的上清液转移到2-ml eppendorf管上，然后与700 µL结合缓冲液和300 µL绝对乙醇混合。然后将混合物加载到自旋柱上，并以10,000克离心1分钟。将流通液丢弃，并将500 µL的PW缓冲液添加到自旋柱中，然后在10,000g下离心30 s。接下来，将600 µL洗涤缓冲液添加到自旋柱中，然后在10,000g下离心30 s，然后再次重复该过程。然后将自旋柱在10,000克处离心1分钟，以完全去除洗涤缓冲液，然后用100 µL洗脱缓冲液（添加到自旋柱中，然后在室温下孵育5分钟，然后在室温下孵育5分钟，然后在12,000g的室温下孵育1分钟）。Total DNA was quantified using Maxima SYBR Green/ROX qPCR master mix on a LightCycler 480 II system (Roche) with the following programs: 70 ng of DNA was pre-denatured at 95 °C for 10 min and then subjected to PCR for a total of 45 cycles: denaturing at 95 °C for 10 s, annealing and extending at 65 °C for 30 s in each cycle.用于QPCR的小鼠底漆对如前所述（HK2，5'-GCCAGCCTCTCCTCCTGATTTTAGTGT-3'和5'-GGGAACACAAAAAAAGACCTTTCTGG-3'; 和ND1，5'-ctagcagaaacaaaccgggc-3'和5'-ccggctgcgtgcgtattctacgtt-3'）。

　　线虫线粒体DNA拷贝数是从蠕虫裂解物中确定的，如前所述78。简而言之，收集了30个同步的早期L4蠕虫，并用10μl单蠕虫裂解缓冲液裂解。将蠕虫裂解物在-80°C冷冻过夜，然后在65°C孵育1小时和95°C 15分钟。然后，使用Maxima Sybr绿色/ROX QPCR Master在Lightcycler 480 II系统（Roche）上使用以下程序进行定量线虫DNA：在95°C下进行10分钟的预污染，然后在95°C下在95°C下的45个固定周期，在10 s，将在65°C上进行65°C。如前所述的95（ND-1，5'-AgcgtCatttattTattGggaAgaagaC-3''和5'-Aagcttgtgtgtgtgtgctaatcccataaaatgt-3';和act-3，5'tgcgcgacattgatgatgatccggtaagggtaagggtaagg-3'';5'-GGTGGTTCCTCCGGAAAGAA-3'）。

　　果蝇DNA拷贝数如前所述确定，但修改较小。简而言之，将20个麻醉的成年人在含有蛋白酶K（100μgml -1）的100μl蝇裂解缓冲液（75 mM NaCl，25 mM EDTA和25 mM HEPES，PH7.5）中匀浆。然后将匀浆在-80°C冷冻12小时，然后在65°C下孵育1小时，再孵育95°C，再孵育15分钟。然后，使用Maxima Sybr绿色/ROX QPCR Master在LightCycler 480 II系统（Roche）上进行以下程序：在95°C下进行5分钟的预污染5分钟，然后在95°C下进行40个循环，在95°C下进行10 s，在60°C下进行20 s ncepts 20 s，在95°C下进行20°C延长了20 s，在95°C下进行了40个循环。D. melanogaster primer pairs used for qPCR were as previously described123 (16S rRNA, 5′-TCGTCCAACCATTCATTCCA-3′ and 5′-TGGCCGCAGTATTTTGACTG-3′; and RpL32, 5′-AGGCCCAAGATCGTGAAGAA-3′ and 5′-TGTGCACCAGGAACTTCTTGAA-3′).

　　如前所述，通过毛细管– MS（CE -MS）分析了细胞，组织或蝇的ATP，ADP，AMP和NAD+，如前所述1010，但进行了较小的修饰124。简而言之，每次测量都需要从一个10厘米盘（60–70％汇合），100 mg肝脏或肌肉组织通过冻结夹开的100毫克或20个麻醉的成年苍蝇收集的MEF。在CE – MS分析之前，将细胞用20 ml的5％（m/v）甘露醇溶液（溶解在水中），并立即冷冻在液氮中。然后将细胞用含有IS1的1 ml甲醇（50 µm-甲硫代磺胺，50 µm -Campher -10-0-磺酸）裂解，溶于水中； 1：500（V/V）添加到甲醇中，并用于标准化的代谢强度并将其标准化并调节迁移时间），并从盘子中刮掉。为了分析肝脏和肌肉中的代谢产物，在指定的治疗后将小鼠麻醉。然后，通过冻结钳迅速切除组织，然后用IS1磨碎1 ml甲醇。为了分析苍蝇中的代谢产物，用液氮冷冻后，用IS1磨碎20种成年蝇，然后在1 ml甲醇中磨碎。然后将裂解物与20 s的涡旋与1 mL氯仿和400μl水混合。在4°C下以15,000 g离心15分钟后，收集450μl水相，然后通过在4°C下以12,000g离心3 h，通过5 kDa截止过滤器（OD003C34，PALL）过滤。同时，通过将每个样品中的10μL水相结合，然后与样品旁过滤，制备质量控制样品。然后将过滤后的水相在4°C的真空浓缩剂中冷冻干燥，然后溶解在含有IS2的100μl水中（50 µm 3-氨基吡咯烷二氯化物，50 µm N，N，N-二甲基-2-苯基乙酰胺，50 µm Trime aciCICICICIC ACICIC ACICIC，50 µM-2-NAPHAPH-2-NAPHAPH-2-NAHPHAPHIOND-NAPHAPAPHIOND-NAPHAPHINPINOD-NAPHAPHINP-NAPHAPHINFTINCTINCTION TOCTTINTIST，研究盐，溶于甲醇；然后将总共20μl的重新解析溶液加载到注射小瓶中（9301-0978， 安捷伦；配备了快照盖（5042-6491，Agilent））。在CE – MS分析之前，在CE系统（Agilent Technologies 7100）上安装了CE-MS盒（G1603A，Agilent），在CE – MS纸盒（G1603A，Agilent）中安装了融合的硅毛细管（TSP050375，I.D。50 µm×80 cm; Polymicro Technologies）。然后将毛细管与调节缓冲液（25 mm乙酸铵和75 mm磷酸氢氢氢氢氢氢氢氢氢化氢状生肠，pH 8.5）进行30分钟，然后与运行缓冲液（50 mm乙酸铵，pH 8.5； pH 8.5；新鲜制备）平衡1小时。CE – MS分析以阴离子模式进行，在此期间，用调节缓冲液洗涤毛细管，然后在50 MBAR的压力下注射样品25 s，然后在-30 kV下以恒定电压再分开40分钟。鞘液液（0.1μm六链球菌（1H，1H，3H-氟丙二氟丙酰氧基）磷酸，10μM三氟乙酸铵，溶解在甲醇和水中（50％V/V）；新鲜制备的甲醇和水（50％V/V），以1 ml 1：1 ml的1：1：1：100 Flow Flow Inftiter（1：Ag agilent inf clatecities ii MSOLONT IN频率），实际上是II II MSISOGIES II II INFonECOLIES II II INVINCTIES IN INVINCONISE;每次运行中10μlmin – 1）。MS（Agilent Technologies 6545）的参数如下：离子源，双AJS ESI；极性，负面；喷嘴电压，2,000 V；片段电压，110 V；撇渣器电压，50 V；OCT RFV，500 V;干燥气体（N2）流速，7 l min – 1;干燥气（N2）温度为300°C；雾化器气压，8 psig；鞘气温为125°C；鞘气（N2）流速，4 l min – 1;毛细管电压（应用于喷雾器），3,500 V；参考（锁定）质量，六基人（1H，1H，3H，3H-TETRAFLUOROPOXY）磷酸为1,033.988109，三氟乙酸的M/z为112.985587；扫描范围：50–1,100 m/z；和扫描速率，每秒钟1.5光谱。使用Masshunter LC/MS采集（V.10.1.48; Agilent Technologies）收集数据，并使用定性分析B.06.00（Agilent Technologies）处理。ADP的水平 使用完整扫描模式测量ATP和NAD+，M/z值分别为346.0558、426.0221、505.9885和662.1019。请注意，ADP和ATP的一部分可能在源源片段化过程中损失一个磷酸基团，从而留下与AMP和ADP相同的M/Z比，并根据其在毛细管中不同的保留时间进行校正。因此，ADP的总量是M/z 346.0558频谱图的后一个峰和M/z 426.0221频谱图的前一个峰，并且适用于ATP。请注意，每种代谢产物的保留时间可能会在每次运行之间有所不同，这是通过使用同位素标记的标准标准（溶解在单个细胞或组织裂解物中）的调整，以及在每个样品之​​间运行的，IS1和IS2之间进行了调整。

　　如前所述78，使用高性能液相色谱（HPLC）–MS分析了线虫中ATP，ADP，AMP和NAD+的水平。简而言之，将维持在NGM上的150个线虫用含有Triton X-100的冰冷的M9缓冲液洗涤2天，然后用100g以100克离心5 s的浆液5 s，然后在1 ml甲醇中立即溶解细菌。然后将裂解物与1 mL氯仿和400 µL水（含4 µg ml – 1 [U-13C] - 谷氨酰胺）混合，然后将其涡旋为20 s。在15,000g下在4°C下再离心15分钟后，收集了800 µL水相，在4°C下在真空浓缩剂中冻干，然后溶解在30 µl的50％（V/V，在水中）乙腈。接下来，将30 µL的上清液加载到注射小瓶（5182-0714，Agilent Technologies；带有插入物（HM-1270，Zhejiang hamag Technology））中，配备了快照盖（HM-2076，Zhejiang Hamag Technology）。腺苷酸和NAD+水平的测量基于参考。125使用QTRAP MS（QTRAP 5500，SCIEX）与UPLC系统（exionlc AD，SCIEX）连接。将总共​​2 µL的每个样品加载到Hilic柱上（Zic-Philic，5μM，2.1×100 mm，PN：1.50462.0001，Millipore）。流动阶段由15 mM乙酸铵组成，其中含有3 ml L – L – 1氢氧化铵（> 28％，V/V）在LC – MS级水（流动相A）和LC -MS级90％（V/V）乙腈（v/v）的LC -MS级水（流动相B）的流量为0.2 ml min min min -min – 1 – 1。用以下HPLC梯度洗脱程序分离代谢物：95％B持续2分钟，然后在13分钟内持续到45％B，持续3分钟，然后返回95％B，持续4分钟。MS以负模式的涡轮V离子源运行，喷雾电压为–4,500 V，源温度为550°C，在50 psi处的1号气体，55 psi的2号气体和40 psi的窗帘气体。使用多个反应监测模式测量代谢产物， 使用分析标准优化了重新分辨电势和碰撞能量。以下过渡用于监测每种化合物：505.9/158.9和505.9/408.0用于ATP；425.9/133.9，425.9/158.8和425.9/328.0用于ADP；345.9/79.9，345.9/96.9和345.9/133.9对于AMP，NAD+的662.0/540.1;[U-13C] - 谷氨酰胺为149.9/114。使用分析师软件（V.1.7.1，SCIEX）收集数据，并使用多物种软件（V.3.0.3，SCIEX）分析了代谢物的相对量。与CE – MS分析类似，在源代码剥离过程中，ADP和ATP的一部分可能会损失一个或两个磷酸基团，因此留下与AMP和ADP相同的M/Z比率，根据列中其不同的保留时间，校正了AMP和ADP。

　　使用与KLH免疫原共轭的人V1E1的肽CardDlitdllNea（ACK）培养了针对V1E1（K99）AC（IB的1：1,000稀释）的兔多克隆抗体。然后用300 µg klh偶联的抗原对兔子进行双周卫生，该抗原与1.5 mg锰佐剂（由Z. jiang126提供）预孵育5分钟，然后将PBS与PBS混合至1.5 ml的总体积1.5 ml，持续4次，然后收集抗血清。然后，使用CardDlitDllNea（ACK）肽偶联的磺化硫偶联树脂/柱从​​抗血清中纯化V1E1（K99）AC抗体，该抗体在硫磺链接固定试剂盒中提供。为了制备柱，首先将1 mg的肽用2 mL耦合缓冲液溶解，然后添加0.1 mL TCEP（25 mM库存浓度），然后在室温下孵育30分钟。然后将混合物与硫链接树脂在柱中孵育，该树脂在旋转器在室温下2次用2 ml耦合缓冲液预校准，持续15分钟，然后在室温下在室温下孵育30分钟而不会旋转。然后除去多余的肽，然后用2 mL洗涤溶液洗涤3次，然后用2 mL偶联缓冲液2次洗涤。The nonspecific-binding sites on the resin were then blocked by incubating with 2 ml cysteine solution (by dissolving 15.8 mg of -cysteine-HCl in 2 ml coupling buffer to make a concentration of 50 mM cysteine) on a rotator for 15 min at room temperature, followed by incubating for another 30 min without rotating at room temperature.去除半胱氨酸溶液后，将树脂用6 mL结合/洗涤缓冲液洗涤，然后用旋转器上与0.2 mL结合/洗涤缓冲液混合2 ml抗血清孵育2 h。然后将树脂用1 ml的结合/洗涤缓冲液洗涤5次 并用2 mL洗脱缓冲液洗脱抗体。然后将洗脱液与100μl中和缓冲液混合。然后，通过先前描述的基于膜的亲和力纯化方法127去除了对原始抗体洗脱液中存在的基底V1E1的抗体。简而言之，将细菌纯化的HIS标签V1E1进行SDS-PAGE进行，然后转移到PVDF膜上（请参阅“免疫沉淀和IB分析”部分中的详细信息）。将溶于TBST（40 mM Tris，275μmNaCl，0.2％NaCl和0.2％（V/V）Tween-20，pH 7.6）溶解在5％（w/v）的非脂肪牛奶中的5％（w/v）非脂肪牛奶中孵育2 h，然后与粗制抗体制备2天，并重复了另一份2次2次。

　　以下抗体是从细胞信号技术购买的：兔抗磷酸-AMPKα-THR172（2535，我想要：AB_331250; 1：1：1,000对于IB）；抗AMPKα（2532，我想要：ab_330331; 1：1,000 for Ib）;抗磷酸-ACC-SER79（3661，我想要：AB_330337; 1：1,000 for Ib）;抗ACC（3662，我想要：ab_2219400; 1：1,000 for Ib）;抗LKB1（3047，我想要：ab_2198327; 1：1,000 ib）;抗His-Tag（12698，我想要：AB_2744546; 1：1,000 for Ib）;抗Myc-tag（2278，我想要：AB_490778; 1：120用于免疫荧光（如果））;抗Axin1（2074，我想要：AB_2062419; 1：1,000 for Ib）; Anti-Sirt1（9475，我想要：AB_2617130; 1：1,000 for Ib，1：100 for If）; Anti-Sirt2（12650，我想要：AB_2716762; IB 1：1,000）; Anti-Sirt3（5490，我想要：AB_10828246; 1：1,000 for Ib）; Anti-Sirt5（8782，我想要：AB_2716763; 1：1,000 for Ib）; Anti-sirt6（12486，我想要：AB_2636969; 1：1,000 ib）; Anti-Sirt7（5360，我想要：AB_2716764; 1：1,000 for Ib）;抗Histone H3（4499，我想要：ab_10544537; 1：1,000 for Ib）;抗乙酰基酮H3-Lys9（9649，我想要：AB_823528; 1：1,000 for Ib）;抗Lamor1（8975，我想要：AB_10860252; 1：1,000 for Ib）;抗GAPDH（5174;我想要：AB_10622025; IB 1：1,000）;抗Myc-tag鼠标（2276，我想要：ab_331783; 1：120 for If）;和HRP连接的小鼠抗兔IgG（构象特异性，5127，我想要：ab_10892860; 1：2,000 for Ib）;和抗泛素（UB; 3936，我想要：AB_331292; 1：1,000 for Ib）。以下抗体购自Santa Cruz Biotechnology：Mouse Anti-Ha-Tag（SC-7392，我想要：AB_2894930; 1：500 for IP或1：120 for If）;抗LKB1（SC-32245，我想要：ab_627890，1：100 for If）;山羊抗胺（SC-8567，我想要：ab_22277891; 1：100用于IP（免疫沉淀）和1：120 for If）;兔子抗VDR（SC-13133，我想要：AB_628040，1：1,000 for Ib）;和鼠标抗山羊IgG-HRP（SC-2354，我想要：AB_628490; 1：2,000的IB）。以下抗体购自ABCAM：小鼠抗抗肿的Oxphos（AB110413，我想要：AB_2629281; 1：5,000 for Ib）;大鼠抗LAMP2（AB13524，我想要：AB_2134736; 1：120 for If）;抗氯胺酮兔（AB11575， 我想要：AB_298179; 1：200 if）;抗磷酸-AMPKα2-SER345（IB的AB129081，1：1,000）；抗转移蛋白（AB1223，我想要：AB_298951; 1：500 for Ib）;抗ATP6V1B2（AB73404，我想要：ab_1924799; 1：1,000 for Ib）;抗PEN2（IB的AB154830，1：1,000）;和山羊抗Sirt4（AB10140，我想要：AB_2188769; 1：1,000的IB）。以下抗体是从发育研究杂交瘤库购买的：小鼠抗EMHC（BF-G6，我想要：AB_10571455; 1：100 for IHC）；抗PAX7（PAX-7，我想要：AB_2299243; 1：100 for IHC）;抗MHCIIA（SC71，我想要：AB_2147165; 1：100 for IHC）;抗MHCIIB（BF-F3，我想要：AB_2266724; 1：100 for IHC）;和抗MHCI（C6B12，我想要：AB_528351; 1：100 for IHC）。以下抗体购自ProteIntech：抗微管蛋白兔（10068-1-AP，我想要：AB_2303998; 1：1,000； 1：1,000，用于IB线虫小管蛋白）；抗ATP6V1E1（15280-1-AP，我想要：AB_2062545; 1：1,000 for Ib）;抗lulp3（13637-1-ap，我想要：ab_2211547，1：20,000 for Ib）;抗MOMM20（11802-1-AP，我想要：AB_2207530; IB 1：1,000）; Anti-YES 20243-1-AP，我想要：AB_10697656; IB 1：1,000）；抗微管蛋白小鼠（66031-1-Ig，我想要：AB_11042766; 1：20,000用于IB哺乳动物小管蛋白）;和Anti-Ha-Tag（66006-2-ig，我想要：ab_2881490; 1：20,000 for Ib）。兔子抗ATP6V0C（NBP1-59654，我想要：AB_11004830; 1：1,000 for IB）购自Novus Biologicals。小鼠抗β-肌动蛋白（A5316，我想要：IB的AB_476743; 1：1,000）和抗FLAG M2亲和力凝胶（IP的A22220，1：500）购自Sigma。以下抗体购自Thermo：Donkey抗山羊IgG（H+L）高度交叉吸附的二级抗体，Alexa Fluor Plus 488（A-32814，我想要：AB_2762838; AB_2762838; 1：1：100 for IF）;驴抗RAT IgG（H+L）高度交叉吸附的辅助抗体，Alexa Fluor 594（A-2​​1209，我想要：AB_2535795; 1：100 for If）;山羊抗小鼠IGM（重链）交叉吸附的二抗，Alexa Fluor 488（A-21042，我想要：AB_2535711; 1：200 for IHC）;山羊抗小鼠IGG2B跨吸附二抗，Alexa Fluor 594（A-2​​1145，我想要：AB_2535781; 1：200对于IHC）；山羊抗小鼠IgG1跨吸附二抗，Alexa Fluor 647（A-21240，RRID：AB_2535809; 1：200 for IHC）;山羊抗小鼠IgG1跨吸附二抗，Alexa Fluor 488 A-21121，RRID：AB_2535764;1：200对于IHC）；山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附的二抗，Alexa Fluor 488（A11034，RRID：AB_2576217; 1：200 for If）;和山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附的二抗，Alexa Fluor 594（A-111012，RRID：AB_2534079; 1：200 for IHC）。辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗小鼠IgG（115-035-003，RRID：AB_10015289; 1：5,000 IB的稀释度）和山羊抗兔IgG和抗兔IgG（111-035-003，rrid for：ab_2313567; 1：1.5,000 dirution;Immunoresearch。

　　The following reagents were purchased from Sigma (catalogue numbers in parentheses): DMSO (D2650), LCA (L6250), (2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin (C0926), methanol (646377), ethanol (459836), chloroform (C7559), PBS (P5493),Triton X-100（T9284），乙酸钠（NAAC； S5636），无核酸酶水（W4502），人体输注液（HTF）培养基（MR-070-D），KSOM培养基（MR-121-D），L-Glutathione还原（GSH; GSH; G4251），Nac251，nac651，s7653166516666666666666666666666666666666666666666666666651，s7651，s7653。(C5670), MgSO4 (M2643), KH2PO4 (P5655), K2HPO4 (P9666), streptomycin (85886), cholesterol (C3045), agar (A1296), propionic acid (P5561), sucrose (S7903), glucose (G7021),2-甲基丁烷（Isopentane; M32631），多甲醛（158127），加拿大香脂（C1795），BSA（A2153）（A2153），甘油（G5516），Na2HPO4，Na2HPO4（Na2hpo4），钠（S7907），钠二核溶液（nAclorite solute solution solute solution naCloLite soluce（naC）（naC）（239393933939339305）；铁（II）硫酸盐七水合物（FESO4； F8633），HEPES（H4034），EDTA（E6758），EGTA（E3889），MGCL2（M8266）（M8266），KCl（p9333），p9333），IGEPAL CA-630（IGEPAL CA-630（NP-40）（NP-40; i3021）;43815），IPTG（I6758），甲求霉素（C1613），-mannitol（M4125），甘氨酸（G8898），Isopopanol（34863），二乙基苯甲酸苯甲酸酯（DEPC）（DEPC）经过的水（DEPC）经过的水（6933520），TRIOLEN（trioyl）（TMX）4-羟基苯甲酸盐（甲基羟基苯甲酸酯； H3647），矿物油（M5310），盐油700（H8898），盐碳油27（H8773），Paraquat（36541）（36541），H2O2（H2O2），H2O2（H1009），琼脂糖（H1009），琼脂糖（H1009），琼脂糖（A琼脂）（A氨氯酸盐）(M0876), -campher-10-sulfonic acid (1087520), acetonitrile (34888), ammonium acetate (73594), ammonium hydroxide solution (338818), 3-aminopyrrolidine dihydrochloride (404624), N,N-diethyl-2-phenylacetamide（384011），trime酸（482749），二氢磷酸盐（1012070500），三氟乙酸铵（56865），甲酸（5.43804），磷酸盐（二氧化氢），磷酸盐（1012070500），三三分 - 三氧化物（568）（568）(P9416), hexadimethrine bromide (polybrene; H9268), octyl β--glucopyranoside (ODG; O8001), Trizma base (Tris; T1503), sodium pyrophosphate (P8135), β-glycerophosphate (50020), SDS (436143), 脱氧胆酸钠（S1827），β-甲醇（M6250），甲醛溶液（福尔马林； F8775），氯仿-D（带有0.05％（V/V）四甲基硅烷（TMS）（TMS）； 612200），N-二甲基甲基甲烷（612200），N-二甲基甲基甲基（N-二甲基甲基甲基法）（N-二甲基甲基甲基层（Dimethylforfamiide）（331 DMF；N，N，N-二异丙甲胺（DIEA； 199818），二氯甲烷（DCM; 650463），Na2SO4（746363），NaHCO3（S5761），ATP（A7699），IPTG（IPTG（IPTG），IPTG（I6758），Imididazole（imididazole（IPLINITING），伊斯兰教（Imididazole（Imididazole）（I5555113）Coomassie亮蓝色R-250（1.12553），乙酸（27225），TCEP（C4706），TBTA（678937），CUSO4（C1297）（C1297），trichloroaceticac Acid（91228），甲酸盐（91228），甲酸铵（70221），FCCP（70221），FCCP（C2920），SOD2920，SOD920;S2002), gentamycin (345814), collagenase A (11088793001), oligomycin A (75351), concanamycin A (conA; C9705), fluorescein isothiocyanate–dextran (FITC-dextran; FD10S), lysosome isolation kit (LYSISO1) and Duolink In原位红色起动器套件（鼠标/兔子；二重奏92101）。The following reagents were purchased from Thermo: TRIzol (15596018), Phusion High-Fidelity DNA Polymerase kit (F530N), mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription kit (AM1344), MEGAclear Transcription Clean-Up kit (AM1908), MEGAshortscript T7 Transcription kit (AM1354), Maxima SYBR Green/ROX qPCR主混合物（K0223），肽（44999），DMEM，高葡萄糖（DMEM; 12800082），FBS（10099141C），青霉素 - 链霉霉素（15140163），15140163），lipofactamine action enter Inemino Ammem nonny-Ammem nontran-Ammim comime（44999），DMEM（44999），高葡萄糖（DMEM; 12800082），Lipofactamine Ammem 2000（116666666885500）(11140050), GlutaMAX (35050061), sodium pyruvate (11360070), ProLong Diamond antifade mountant (P36970), ProLong Live Antifade reagent (P36975), streptavidin magnetic beads (88817; 1:100 for IP), prestained protein MW marker (26612), and LysoSensor GreenDND-189（L7535）。Minelute PCR纯化套件（28004）购自Qiagen。EX-527（S1541）和MG-132（S2619）购自Selleck。Biospin组织基因组DNA提取试剂盒（BSC04M1）购自BioFlux。HCG（110900282）和PMSG（110904564）购自Sansheng生物技术。Westernbright ECL和过氧化物溶液（210414-73） 是从Advansta购买的。细菌学肽（LP0037）和酵母提取物（LP0021）购自Oxoid。蛋白酶抑制剂鸡尾酒（70221）购自Roche。3-羟基硫酸盐-2,7-二硫酸酸二钠盐（2-萘酚-3,6-二硫酸酸二去钠盐； H949580）购自多伦多研究化学品。Hexakis（1H，1H，3H-周氟丙氧基）磷酸（Hexakis（1H，1H，3H，3H-TETRAFLUOROPOXY）磷酸； SC-263379）购自Santa Cruz的生物技术。聚乙基亚胺（PEI; 23966）购自。非脂肪干牛奶（9999）和正常的山羊血清（NGS; 5425）购自细胞信号技术。2-（3-（But-3-Yn-1-基）-3H-DIAZIRIN-3-基）乙醇-1-胺和1H-苯并二唑-1-羟基氧基（二甲基氨基）六氟磷酸磷酸盐（BOP）是从Bidepharm那里购买的。Oct大院（4583）购自Sakura。Revertra Ace QPCR RT Master Mix搭配GDNA去除剂（FSQ-301）购自Toyobo。Primestar HS聚合酶（R40A）购自Takara。干酵母（Fly804020f）和玉米面（Fly801020）购自LabScientific。大豆粉（62116）购自Genesee Scientific。淡玉米糖浆购自Karo。葡萄汁是从Welch的。细胞计数KIT-8（CCK-8）购自Apexbio。[U-13C] -glutamine（184161-19-1）购自剑桥同位素实验室。Rprotein A Sepharose快速流量（17127904），蛋白质G Sepharose 4快速流量（17061806）和SuperDex 200增加10/300 GL（28990944）。

　　在这项研究中，没有使用的细胞系在国际细胞线认证委员会（https://iclac.org/databases/cross-contamination/）维护的已知错误识别细胞系列列表中。HEK293T细胞（CRL-3216）购自美国类型培养物收藏。LAMTOR1F/F，AXINF/F和PKCZF/F MEF是通过使用慢病毒引入SV40 T抗原来建立的，该抗原来自小鼠垃圾的培养的原代胚胎细胞。LAMTOR1 - / - MEF是通过用腺病毒感染Lamtor1f/f MEF产生的，表达CRE重组酶12小时，如Axin - / - MEFS和PKCZ - / - / - MEFS。然后将感染的细胞在新鲜的DMEM中再孵育12小时，然后再进行进一步处理。Aldo-TKD10，TRPV-QKO12，PEN2 - / - （参考文献15），ATP6AP1 - / - （参考文献15）和AMPKA1/2 –/ - （参考文献128）MEFS和SIATP6V0C11 HEK293T细胞被生成和验证，并如前所述。HEK293T细胞和MEF在补充了10％FBS，100 IU青霉素和100 mg ML – 1链霉素的DMEM中，在37°C中，含有5％CO2的加湿孵化器中。所有细胞系均被证实免受支原体污染。HEK293T细胞和MEF通过Immocell Biotechnology进行的STR测序验证。最终浓度为10μM的PEI用于转染HEK293T细胞（异位表达）。使用相关的空载体将要转染的总DNA调整为相同的量。转染后24小时收集转染的细胞。

　　Lentiviruses, including those for knockdown or stable expression (expressed at close-to-endogenous levels), were packaged in HEK293T cells by transfection using Lipofectamine 2000. At 30 h after transfection, medium (DMEM supplemented with 10% FBS and MEM non-essential amino acids; approximately 2 ml) was collected and centrifuged at 5,000g for 3 min at room temperature.将上清液与10μgml– 1的聚甲烯混合，并将其添加到MEFS或HEK293T细胞中，然后在室温下以3,000g离心3,000克（SpinFoction）。在进一步治疗之前，将细胞再孵育24小时（MEF）或12小时（HEK293T细胞）。每个用于敲除鼠标tulp3的siRNA的序列为：5'-gcatcttgagtgtgtgtgaactatga-3'（1），5'-CCAGCTTGGAGAAGAAGTGGAAGAATTTA-3'（2）和5'-GAGAATTAGATTTAGATTAGATTTAGATTAGATTAGATTAGATTTAGATTAGATTTAGTTATATATATA-3'（3）。

　　编码SIRT1 – SIRT7，FXR，FXRβ，PXR，VDR，CAR，LXRα，LXRβ，S1PR2，CHRM2，CHRM2，FAS，FAS，FPR1，YES1，YES1和TULP3的基因使用CRISPR – CAS9系统从MEF中删除。将核苷酸退火到包含克隆TAG AAAC的补充中，并插入Lenticrisprv2载体的背对背BSMB I限制位点。每个SGRNA的序列如下：5'-CGGTATCTATGCTCGCCTTG-3'和5'-CAAGGCGCGAGCATAGATAGATACCG-3''用于SIRT1、5'-AAGGAGGACGGGAGGACTTACACG-3''''和5'-CGTGTGTAAGTAAGTAAGTAGTAAGTTAGTTACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCTCTT-3'5'-aacatcgacggcttgagag-3'和5'-ctccccccgtcgtcgatgtgt-3''sirt3，5'-ggcgcgcgcgcgcaCaaaTaaccccca-3''和5'-tcgggcgcgccgccgccgccgccgccgccgcc-3''5′-TGCGATGCAACTCGTCAATG-3′ for Sirt5, 5′-CGAGGGCCGAGCATTCTCGA-3′ and 5′-TCGAGAATGCTCGGCCCTCG-3′ for Sirt6, 5′-CCGACTTCGACCCTGCAGCT-3′ and 5′-AGCTGCAGGGTCGAAGTCGG-3′ for Sirt7,FXR（1），5'-CGAATGGCCGCGCGGCGGCGGCGGC-3''和5'-CGAATGGCGCGGCGGC-3'和5'-GCCCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-3''5'-ACCAGTCTTCCGGTTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3'和5'-CCAACAACCACCGGACTGGT-3'and 5′-CCAACAACCGGAAGACTGGT-3′ for Fxrb (1), 5′-GGACTCGACGCTCGAGAATC-3′ and 5′-GATTCTCGAGCGTCGAGTCC-3′ for Fxrb (2), 5′-TGAAACGCAATGTCCGGCTG-3′ and 5′-CAGCCGGACATTGCGTTTCA-3′对于PXR（1），5'-GATCATGTCCGATGCCGCTG-3'和5'-CAGCGGCGGCATCGGACATGATC-3'，用于PXR（2），5'-ACTTTGACCCGGAATGCGGAATGCGCCT-3'和5'-AgggcacAttCATCATCGGGTCATCGGGTCAATCATCATCGGGTCAAAGT-3'5'-TGGAGATTGCCGCATCACCA-3'和5'-TGGTGATGCGGCAATCTCCA-3'用于VDR（2），5'-CGGCCATATTCTTCTTCAC-3''和5'-GTGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAATATGGGCCG-3''5′-ACATGGCGAGTGTGGGCCCC-3′ for Car (2), 5′-TTCCGCCGCAGTGTCATCAA-3′ and 5′- TTGATGACACTGCGGCGGAA -3′ for Lxra, 5′-GCCGGGCGCTATGCCTGTCG-3′ and 5′-CGACAGGCATAGCGCCCGGC-3′ forlxrb（1），5'-catagcgccgccgccccg-3'和5'-cggtggggcgcggcgcgcgcgctatg-3''用于LXRB（2），5'-CGTGCAGTGCCCGCCCGCCGCCGCCGAG-3'''5'-aagacggtcaccatcgtact-3'和5'-agtacgatggtgaCcgTctt-3'对于S1PR2（2），， 5'-GCATGATGATTGCAGCTGCG-3'和5'-CGCAGCTGCAATCATCATGC-3'用于Chrm2，5'-GCCGTGCGCGCCGAGCGAGGTGTGGT-3''和5'-ACCACCATCATCACCTTCGGGCGGCGGGC-3''5′-GACCAATCATCACACCGGCT-3′ for Chrm3 (2), 5′-TCTCCGAGAGTTTAAAGCTG-3′ and 5′-CAGCTTTAAACTCTCGGAGA-3′ for Fas (1), 5′-TGCTCAGAAGGATTATATCA-3′ and 5′-TGATATAATCCTTCTGAGCA-3′ for Fas (2),5'-agaaggtaatCatCATCATCCCC-3'和5'-GGGTACGATGATACCTTCT-3'for FPR1（1），5'-GGCAACGGGCTCGTGATCTCTCT-3''和5'-agatcacgagcgcgcgcgcgttgccc-3''for fpr1（2）and 5′-CGAGAATCATTGCGACTAGA-3′ for Yes1, 5′-CTCCCCGTCGGCTCGCTCAG-3′ and 5′-CTGAGCGAGCCGACGGGGAG-3′ for Tulp3 (1), 5′-ACGTCGCTGCGAGGCATCTG-3′ and 5′-CAGATGCCTCGCAGCGACGT-3′ fortulp3（2）。然后，使用HEK293T细胞对植物病毒包装进行慢病毒包装，这些HEK293T细胞在Lipofectamine 2000转染试剂中每孔的6孔板中用2 µg DNA转染。转染后30小时，收集了如上所述的病毒感染MEF，除了培养至15％汇合的细胞与病毒孵育72小时。当细胞接近汇合时，它们被单细胞分类为96孔菜肴。通过测序扩展克隆并评估敲除状态。

　　为了在MEF中敲打HA-TAG，在MEF中的第一个外显子，SIRT4和SIRT5的前面，3×HA序列（插入）侧面是150 bp 5'和SIRT3，SIRT4或SIRT4或SIRT5（5''和3'同源臂）的3'序列，并与Plues contectote II ks（5''和3'同源臂）。在10厘米至80％的汇合中生长的MEF被胰蛋白酶变化并用2 mL DMEM重悬于，然后使用配备有室内幻灯片的Countstar（IC 1000）柜台确定细胞密度（12-0005-50）。然后将约106个细胞用400 µL电穿孔缓冲液悬浮（通过将80 µl溶液A（362.88 mm ATP和590.26 mM MGCL2混合在DI蒸馏水中，新鲜制成glucose, pH 7.4 in di-distilled water, sterilized by passing through a 0.22-μm filter)) in a Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvette (0.4-cm gap; 1652088, Bio-Rad), followed by mixing with 2 μg of Cas9 mRNA (synthesized as previously described129 and dissolved with DEPC water to a 1.5 μg μl–1 stock solution),2μgSGRNA（通过Genscript提供的EasyEdiT SgrNA合成服务对合成和化学修饰，将DEPC水溶于1μgμl -1储备溶液中）和6μg模板。然后使用T-020程序在核对象II（LONZA）电气器上进行电穿孔，然后在37°C的6孔DMEM中在含有5％CO2的加湿孵化器中在37°C的6孔DMEM中孵育30分钟。通过测序验证了HA-TAG的存在。每个SGRNA的序列如下：SIRT3、5'-AttGactttcaggccgacaa-3'的5'-catgaccacccccccccccccccccccctactgc-3'，用于SIRT4和5'-CAATCAATCAGGGAGAGAGAGAGGAGGCAGGCATC-3''用于Sirt5。

　　本研究中使用的全长cDNA是使用MEFS中的cDNA或从Origene或Sino生物学购买的。SIRT1 – SIRT7的DN突变体，即SIRT1（H363Y）130，SIRT2（H150Y）131，131，SIRT3（H248Y）65，SIRT4（H161Y）132，132，SIRT5（H158Y）133，133，SIRT6（H133Y）29和SIRT SIRT 29和SIRT7（H13Y）29和SIRT7（H13Y）（H13Y）（H13Y）707（H18Y）（h18y）（70岁）（h18y）。使用Primestar HS聚合酶通过基于PCR的位置定向诱变进行V1E1，SIRT1 – SIRT7和TULP3的突变。在PBOBI载体中，在PBOBI载体中，在PBOBI载体中，在PCDNA3.3载体（K830001，Thermo）中构建了用于各种表位标记蛋白的表达质粒，用于转染（异位表达），用于慢性病毒包装（稳定）在plvx-iRES（for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for for forvx-ire）。哺乳动物细胞中的强力霉素诱导表达，或PET-28A载体（69864-3，Novagen）用于细菌表达。通过测序（Invitrogen）验证PCR产物。在这项研究中构建的所有表达质粒都沉积在Addgene（https://www.addgene.org/sheng-cai_lin/）中。基于慢病毒的矢量PLV-H1-EF1A-PURO（sort-b19，bioSettia）用于MEF中的siRNA。大肠杆菌菌株DH5α（PTA-1977）购自美国型培养物，而STBL3（C737303）来自Thermo。除了STBL3中的诱变外，所有质粒均在大肠杆菌DH5α中扩增。通过使用CSCL密度梯度超速离心法纯化了本研究中使用的所有质粒。

　　为了确定AMPK激活复合物的形成，对内源性轴蛋白进行了免疫沉淀和分析，如前所述11。简而言之，收集了四个15厘米的MEF（生长到80％融合）以进行免疫沉淀。每盘冰冷的ODG缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，50 mm NaCl，1 mM EDTA，2％（w/v）ODG，5 mMβ-汞乙醇和蛋白酶抑制剂鸡尾酒）的细胞用750μL（50 mM TRIS-HCL，pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）裂解，然后进行超声处理，在4°C下进行超声处理。将细胞裂解物与抗X.蛋白抗体一起孵育过夜。通过在20,000 g处离心10分钟，预先清除过夜蛋白质聚集体，然后将蛋白A/G珠（1：250，与ODG缓冲液保持平衡），然后在4°C下再添加3小时。将珠子离心，并在4°C下用ODG缓冲液体积的100倍（通过在2,000克离心）洗涤，然后在IB之前与等体积的2×SDS样品缓冲液混合10分钟。

　　为了确定异位表达的Tulp3和Sirtuins之间的相互作用，用不同的表达质粒转染了6 cm-dish Hek293T细胞。转染后24小时，收集细胞并在500 µl冰冷的Triton裂解缓冲液（20 mm Tris-HCl，pH 7.5，150 mm NaCl，1 mm EDTA，1 mm EGTA，1％（V/V/V）中，Triton X-100，2.5 mm sodium protsccer in Protscceratier，1 mm protsccer，1毫米EGTA，1 mm EGTA，1毫米（V/V）鸡尾酒），然后在4°C下进行超声处理和离心15分钟。将抗HA-TAG（1：100）或抗Myc-TAG（1：100）抗体以及蛋白A/G珠（1：1：1：100，在Triton裂解缓冲液中预先平衡）中添加到上清液中，并在4°C下混合4 h。将珠子用200倍于4°C的冰冷Triton裂解缓冲液洗涤缓冲液的200倍，然后与等体积的2×SDS样品缓冲液混合，然后在IB之前煮沸10分钟。

　　如先前所述134，确定了V1E1的泛素化。简而言之，用6 µg HA标签的V1E1和6 µg Flag标记的泛素转染了6 cm的HEK293T细胞。转染后12小时，将细胞用20 nm mg-132处理12小时。然后将培养基吸入，并通过快速添加500 µL含有1％SD（25 mm Tris-HCl，pH 7.6，150 mm NaCl，1％（V/V）NP-40，1％（W/V）脱氧乙酸钠，1％（W/V）的含水量的含水，以1％的水为15级，将细胞裂解。然后将裂解物用无SDS的RIPA缓冲液9倍稀释，并如上所述使用500 µL稀释剂进行HA-TAG的免疫沉淀。然后通过IB确定V1E1泛素化的水平。

　　为了分析HEK293T细胞和MEFS中PAMPKα，PACC和V1E1（K99）AC的水平，在6孔盘中生长至70–80％汇合的细胞用250μl冰冷的Triton裂解缓冲液裂解。然后将裂解物在4°C下以20,000克离心10分钟，并将等体积的2×SDS样品缓冲液添加到上清液中。然后将样品煮沸10分钟，然后直接受到IB。为了分析肌肉和肝组织中PAMPKα，PACC和V1E1（K99）AC的水平，在指定的治疗后将小鼠麻醉。将冰冷钳组织立即用冰冷的Triton裂解缓冲液（肝脏的10μlmg-1组织重量，肌肉的5μlmg-1组织重量）裂解，然后进行均质化和分心，如上所述。然后将裂解物与2×SDS样品缓冲液混合，煮沸并经过IB。为了分析果蝇中的P-AMPKα和PACC的水平，将20个成年人或第三龄幼虫用200μl冰冷的RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mm NaCl，1％NP-40，1％NP-40，1％NP-40，0.5％deoxyage cocentif and contrife cocktagen）含量为0.1％，含量为0.1％，含量为0.1％，含量为0.1％。多于。然后将裂解液与5×SDS样品缓冲液混合，煮沸并经过IB。为了分析线虫中的PAMPKα和PACC的水平，为每个样品收集了在NGM板上培养的150个线虫。将蠕虫迅速用含有Triton X-100的冰冷M9缓冲液洗涤，并用150μl冰冷的裂解缓冲液裂解。然后将裂解物与5×SDS样品缓冲液混合，然后如上所述进行均匀化和离心，然后在接受IB之前煮沸。

　　在准备同一天，所有样品均经过IB，并避免了任何冻融周期。

　　对于IB，如前所述15，SDS -PAGE是在内部准备的。这项研究中使用的凝胶厚度为1.0毫米。将小于10μl的样品加载到井中，并在100 V（使用PowerPac HC高电流电源，Bio-Rad）中运行电泳，在迷你蛋白酶四局电泳细胞（Bio-Rad）中运行。In this study, all samples were resolved on 8% resolving gels, except those for H3, H3K9ac, LAMTOR1, OXPHOS proteins and ATP6V0C, which were on 15% gels (prepared as those for 8%, except that a final concentration of 15% Acryl–Bis was added to the resolving gel solution), and β-actin, GAPDH, ALDOA, V1E1 andV1E1（K99）AC，为10％凝胶。如前所述15，将分辨的蛋白转移到PVDF膜（0.45μM，IPVH00010，默克）中。然后将PVDF膜用5％（w/v）BSA（用于针对磷酸化蛋白质的所有抗体）或5％（w/v）的非脂肪牛奶（对于所有针对总蛋白质的抗体）在TBST中溶于60 r.p.p.p.p.p.p.mm的Orbital Shaker上的TBST中的所有抗体（对总蛋白质）溶于TBST。在室温下，然后用TBST冲洗两次，每个5分钟。然后，将PVDF膜与所需的原代抗体在4°C的轨道振动器上在60 r.p.m.中孵育过夜，然后在室温下用TBST进行3次冲洗3次，然后在室温下进行5分钟，然后在室温下轻轻摇动3 h h h摄氏度。然后除去二抗，并在室温下用TBST 3次，每只5分钟进一步洗涤PVDF膜。将PVDF膜在ECL混合物中孵育（通过将相等的ECL溶液和过氧化物溶液混合5分钟），然后与医学X射线膜（Fujifilm）孵育5分钟。然后使用X-Amat MX开发人员（Carestream）以及使用开发人员（Carestream）在医疗X射线处理器（Carestream）上使用X-AmomT MX开发人员（Carestream）和X-Amat MX Fixifer和补充溶液（Carestream）开发了这些膜。使用Perfection V850 Pro扫描仪（Epson）扫描开发的膜 使用Epson扫描软件（v.3.9.3.4），并使用Photoshop 2023软件（Adobe）裁剪。在单独的凝胶上分析了总蛋白质和磷酸化蛋白的水平，并显示了代表性的免疫印迹。补充图1中显示了无工艺的免疫印迹。使用ImageJ软件（V.1.8.0，美国国立卫生卫生研究院免费软件）对开发膜的频段强度进行了定量，并使用Illsterator 2022（Adobe）进行了格式化。

　　为了确定Axin和LKB1的溶酶体定位，在室温下在PBS中固定在6孔盘中盖上80％汇合的细胞在6孔盘中固定20分钟。将盖玻片用PBS两次冲洗，并在4°C下用0.1％（v/v）Triton X-100透化5分钟。用PBS冲洗两次后，将部分用含有5％BSA的PBS阻塞，持续30分钟。然后将盖玻片与抗胺或抗LKB1和抗LAMP2抗体（全部为1：100，在PBS中稀释）孵育过夜，在4°C下过夜。然后将细胞用1 mL PBS冲洗3次，然后在黑暗中的室温下与二抗孵育8小时。将细胞用1 mL PBS再洗4次，然后使用延长的钻石抗固定器安装在玻片上。使用配备有HYD SMD探测器的Stellaris 8 Falcon（Leica）系统拍摄共聚焦显微镜图像和HC PL APO CS2×63/1.40油目标（Leica）。所有参数之间的成像之间保持不变。使用LAS X软件（V.3.0.2.16120，Leica）拍摄并分析图像，并使用Photoshop 2023软件（Adobe）格式化。

　　如上所述确定SIRT3，SIRT4和SIRT5（HA标签）的定位，除了使用针对HA-TAG和TOMM20的抗体。对于SIRT1，在室温下，在PBS中固定4％（v/v）甲醛的MEF在6孔菜肴的盖玻片上生长到80％汇合。将盖玻片用PBS两次冲洗，并在室温下用0.5％（v/v）NP-40透化15分钟。用PBS冲洗两次后，将部分用含有5％BSA的PBS阻塞，持续30分钟。然后将盖玻片与抗SIRT1抗体（1：100，在PBS中稀释1：100）在室温下孵育8小时，然后用1 ml 1 ml的PBS冲洗3次。然后将细胞与Alexa Fluor 488偶联的，山羊抗兔IgG二抗二抗（1：100，在PBS中稀释）在室温下，在37°C下在黑暗中再30分钟。将细胞用1 mL PBS再次洗涤4次，然后使用Duolink用DAPI（来自Duolink in duolink int int int int int int int int int int int int int int int int int int int int int int int int int int in in in int int int int ot in in ot int int int int int int int int int int in in in ot int int int int int int int int intu启动套件）将细胞洗涤4次。使用配备有HYD SMD探测器的Stellaris 8 Falcon（Leica）系统拍摄共聚焦显微镜图像和HC PL APO CS2 63X/1.40油目标（Leica）。所有参数之间的成像之间保持不变。使用LAS X软件（V.3.0.2.16120，Leica）拍摄并分析图像，并使用Photoshop 2023软件（Adobe）格式化。

　　为了检测溶酶体的pH值，将细胞在4腔35毫米玻璃底盘上生长（D35C4-20-1.5-N，体外科学）。将细胞培养至60–80％的汇合，然后在同一35毫米菜肴中的相邻腔室中用LCA或DMSO对照处理。将细胞用1μM（终浓度）的溶液传感器绿色DND-189（参考文献135）处理30分钟，然后用PBS洗涤两次，然后在新鲜培养基中再孵育30分钟。同时，在拍摄图像之前，将延长的活抗试剂添加到培养基中。所有细胞均被染色并同时处理。特别地，在该实验中避免了任何反染色，例如使用Hoechst染料染色细胞核，以防止非特异性染色。在成像过程中，将活细胞保存在37°C，在加湿的孵化室中（Zeiss，孵化器PM S1）中保持5％CO2。所有参数（例如PMT电压，偏移，针孔和增益）在每张照片之间保持不变。使用具有×63，1.4 Na油目标的蔡司LSM 980拍摄图像。

　　如前所述136，使用Duolink ot ot ot ot in ot ot ot in ot136，使用duolink situ stu Red启动器套件（小鼠/兔子）进行PLA/Duolink测定法。简而言之，WT MEF或HA标签的SIRT3-KNOCKIN（SIRT3-KI），SIRT4-KI或SIRT5-KI MEF，所有这些都稳定地表达了Myc标记的Tulp3（或Tulp3（Δ1-60）），将其在6韦尔的菜单上的80％融合中生长至80％的融合，以固定为20分钟，即4％（4％），vers in/covers in 20 min in timald in timall of 20分钟（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）（4％）PBS，在室温下每孔2毫升每孔2毫升。将盖玻片用2 mL PBS冲洗两次，并用2 ml的0.1％（v/v）Triton X-100在PBS中透化10分钟，在4°C下进行10分钟。然后用双链接阻塞溶液（每盖板50μl）在37°C的加湿腔室中封闭细胞1小时。然后将细胞与原代抗体（1：100用Duolink抗体稀释剂稀释；每盖50μl）在4°C的加湿腔室中孵育12小时，然后在室温下洗涤2毫升2 ml洗涤缓冲液A，5分钟，在室温下进行5分钟。然后将盖玻片与Plus和负PLA探针溶液孵育（通过将10μLPLA探针减去汤料混合，10μLPLA探针加汤料和30μlDuolink抗体稀释剂；每盖子50μL）在37°C的per室中在37°C的室内进行1小时的plubans 2 m laster 2 ml plaster 2 m lavers plaste plaste plasters plose pla pla plus储备，每盖纸稀释剂稀释；50μL）。然后将盖玻片与连接溶液一起孵育（通过1：5通过水稀释Duolink连接缓冲液，然后在37°C下的加湿室中以1:50;每个盖玻片的比例添加连接酶储备）0.5 h，然后洗涤2毫升洗涤2 ml洗涤液，每次洗涤2 ml，每次换乘5分钟，每次洗涤2毫升。然后将盖玻片用放大溶液（通过1：5新鲜制备，用水稀释放大缓冲液，然后在37°C的湿室中以1:80;每盖板的比例为1:80;50μl）在100分钟内添加聚合酶储备，然后洗涤2毫升洗涤后的Buffer B，10分钟的每盘子，然后洗涤2次。 在室温下。The coverslip was then washed with 2 ml of 0.01× wash buffer B for 1 min at room temperature, followed by mounting with 15 μl of Duolink PLA mounting medium with DAPI for 30 min, and then subjected to imaging using an LSM 980 (Zeiss) as described above, except that a DPSS laser module (Lasos) at 594 nm and a diode laser module (Lasos) at405 nm分别用于激发PLA和DAPI。

　　如前所述进行了FRET-FLIM实验。136。In brief, HEK293T cells stably expressing TULP3–GFP (‘donor only’, as a control), or different combinations of SIRT1–mCherry and TULP3–GFP, or TULP3(Δ1–60)–GFP as a control, were cultured in 35-mm glass-bottom dishes (D35-20-10-N, In Vitro Scientific) to 60–80% confluence in a在37°C下用5％CO2加湿腔室，然后使用配备有HYD X和HYD SMD探测器的Stellaris 8 Falcon（Leica）系统在不同细胞中确定GFP的荧光寿命，以及HC PLAPO CS2×63/1.40油目标（Leica）。通过系统的可调白光激光器使用460 nm激光激发细胞，并使用覆盖GFP发射光谱的HYD X检测器（460-510 nm）记录光子到达时间。所有参数之间的成像之间保持不变。使用LAS X软件（V.3.0.2.16120，Leica）拍摄图像并分析图像。在所有实验中，使用Leica Auto Focus Controls积极稳定了焦平面的位置，以防止任何局灶性漂移或焦点伪像。

　　所有试剂和溶剂均从商业供应商那里获得，并在“试剂”节中进行了描述。在本节中，使用了以下设备：配备了RD-C18柱（30.0×250 mm，5μm； Welch材料）的制备HPLC（帆1000，Welch材料）用于纯化LCA探针；3100个质量检测器（水）用于记录每种化合物的MS光谱；Q激活Orbitrap MS（Thermo）用于记录每种化合物的高分辨率MS光谱；使用220 nm（HD-C18色谱柱，5μM，4.6×250 mm，Agilent Technologies）在220 nm处检测的HPLC来确定LCA探针的纯度，梯度如下：T = 0分钟，20％溶剂B（甲醇）和80％的溶剂溶液A（H2O）；t = 10分钟，100％溶剂B（甲醇）和0％溶剂A（H2O）；t = 30分钟，100％B（甲醇）和0％溶剂A（H2O），在1 ml min – 1时恒定流速）；和Bruker Avance III 600 MHz NMR光谱仪（1H：600 MHz; 13c：151 MHz）用于记录NMR光谱（氯仿-D中的光谱仪仪器，用TMS作为内标的；在Δ（ppm）中报告了化学移位；Δ（ppm），倍数，d = doublet，p = doublet，p = douptlet，t = doublet，t = = treemet，q = treep，DD =双重双线，TD =双线，TT = TT =三胞胎和M =多重的三联体），集成和耦合常数（Hz中的J），1H和13C化学移位相对于溶剂：ΔH为77.2的溶剂：ΔH的ΔH为77.2，用于77.2）。

　　如先前所述的137合成了生物素-N3连接器，并通过LCA和2-（3-（But-3-Yn-1-基）-3H-DIAZIRIN-3-3-yl-3-基）Ethan-1-氨-1-氨-Amine合成LCA探针。简而言之，将LCA（55 mg，0.146 mmol，1.0 EQ）溶解在2 mL DMF中，然后与97.3 mg BOP（0.219 mmol，1.5 EQ）混合。在室温下搅拌30分钟后，24毫克2-（3-（but-3-Yn-1-基）-3H-DIAZIRIN-3-基）乙烯-1-胺（0.175 mmol，1.2 eq）和0.073 ml Diea（0.438 mmol，3.0 mmol，3.0 eq）添加到混合物中，然后搅拌12 h室温，然后将其搅拌到室内12 h室温。然后将混合物用20 mL H2O稀释，然后用30 mL DCM提取3发。从三轮提取获得的有机相聚合，用无水的Na2SO4干燥，然后在90 r.p.m上蒸发在旋转蒸发器（旋转蒸发器R-300，buchi）上。在室温下。然后将粉末溶解在1 mL DMSO中，然后使用具有以下梯度的制备HPLC进行纯化：T = 0分钟，50％溶剂B（甲醇）和50％溶剂A（H2O）；T = 15分钟，80％溶剂B（甲醇）和2％溶剂A（H2O）；t = 25分钟，100％B（甲醇）和0％溶剂A（H2O）；t = 45分钟，100％B（甲醇）和0％溶剂A（H2O），在20 mL min – 1时恒定流速。LCA探针作为白色固体获得，产率为80.7％（58.4 mg），并将DMSO溶解至50 mm的库存浓度。将溶液存储在4°C不超过1个月。

　　LCA probe: 1H NMR (600 MHz, chloroform-d) δ 5.71 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.62 (tt, J = 10.6, 4.6 Hz, 1H), 3.10 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.24 (ddd, J = 14.5, 10.6, 5.1 Hz, 1H), 2.10–2.05 (m, 1H),2.04–2.01（M，3H），1.98–1.94（M，1H），1.89–1.77（M，5H），1.77-1.72（M，1H），1.69，1.69（T，J = 6.7 Hz，2H），1.67-1.67–1.63（M，3H），1.60-1.60-1.60-1.60-1.60-1.60-1.60-1.4（M，1）1H），1.44–1.35（M，6H），1.35–1.29（m，2H），1.28–1.19（M，3H），1.17–1.12（M，1H），1.09，1.09（DD，J = 11.5，7.8 Hz，2H）3.5 Hz，1H），0.93（D，J = 6.8 Hz，3H），0.92（S，3H），0.64（S，3H）;13C NMR（151 MHz，氯仿）δ173.7、82.7、71.8、69.4、56.5、56.0、42.8、42.1、420.1、40.5、40.2、36.5、35.9、35.9、35.5、35.5、35.426.9，26.4，24.2，23.4，20.8，18.4，13.2，12.1。MS（ESI）M/Z：496 [M+H]+。HRMS（ESI）：[M+ H]+计算C31H50O2N3，496.3898;发现，496.3910。HPLC分析：保留时间= 14.55分钟；峰面积，98.02％（λ= 220 nm）。

　　编码人类SIRT1，TULP3，KTUB，TUB-1和突变体的cDNA被插入PET-28A矢量中，以表达His标记的重组蛋白。将PET-28A质粒转化为大肠杆菌菌株BL21（DE3）（EC0114，Thermo），然后在200 R.P.M.的振动器中的LB培养基中培养。在37°C。在1.0的OD600下，用0.1 mM IPTG诱导转化细胞的培养物。在160 R.P.M.再孵育12小时后在16°C时，收集细胞。然后将细胞在His结合缓冲液（50 mM磷酸钠，pH 7.0，150 mm NaCl，1％Triton X-100，5％甘油和10 mM咪唑）中匀浆。然后将匀浆在冰上超声处理，并在4°C下以150,000g进行超速离心30分钟，然后与镍亲和力凝胶孵育（与His-Exting缓冲液均衡）。然后将镍亲和力凝胶用100倍的冰冷的用他洗涤的缓冲液（50 mM磷酸钠，pH 7.0，150 mm NaCl和20 mM咪唑）洗涤，并用His-Repution缓冲液从树脂中洗脱蛋白质（50 mm磷酸盐，pH 7.0 ph 7.0，pH 7.0，150 mm nac和250 mm nacl和250 c的CORMING和250 c。然后，通过超滤光（Millipore，UFC905096）在4°C下将蛋白浓缩至大约3 mg ml – 1，然后在超级杜克斯200柱（Cytiva）上通过凝胶过滤纯化，与含有50 mm Tris-HCl，pH 7.0和300 mM nacl的超级速度缓冲液平衡。

　　为了在体外确定TULP3和SIRT1之间的相互作用，将纯化的His标记的Tulp3和Sirt1（每种4μg）在冰上预孵育30分钟。然后将混合物放入用超级螺旋缓冲液平衡的SuperDex 200列。分数尺寸设置为1 mL，流动相位超档缓冲液和0.5 mL min – 1的流速。将样品与5×SDS样品缓冲液混合，煮沸并进行SDS -PAGE，然后进行Coomassie亮蓝色染色（请参阅“ TULP3的结合位点的确定LCA”或IB的详细信息）或IB。

　　为了使用亲和力下拉测定法确定LCA对TULP3或SIRT1的结合亲和力，首先制备了与生物素化LCA探针结合的链霉亲和素磁珠（在参考文献15中进行了描述，但进行了较小的修改）。简而言之，将10μMLCA探针溶解在4°C下的100μl冰冷的Triton裂解缓冲液中，然后与1 mM TCEP，0.1 mM TBTA，0.1 mM TBTA，1 mM CUSO4和1 mM Biotin-N3接头（所有最终浓度）在4°C下在4°C下进行1 h。在20,000g（4°C）离心30分钟后，将上清液与10μl链霉亲蛋白磁珠在4°C下孵育30分钟，然后用100×体积的Triton裂解缓冲液洗涤3次。The biotinylated LCA probe-bound beads were then incubated with 3 μg His-tagged TULP3, SIRT1 or TULP3–SIRT1 complex (prepared as described in the ‘Protein expression’ section) in 100 μl ice-cold Triton lysis buffer at 4 °C for 2 h, followed by washing with 100× volume of ice-cold Triton lysis buffer for 3 times and then incubating in 100 μl ice-coldTriton裂解缓冲液在4°C下含有不同浓度的LCA 0.5 h。然后将上清液与等体积的2×SDS样品缓冲液混合，然后将IB确定内部的TULP3或SIRT1的量。

　　如前所述15，通过使用MS与硅对接测定法相结合的两步方法来确定用于LCA的TULP3的结合位点。简而言之，将10μMLCA探针与3μgHis标记的Tulp3（如“蛋白质表达”段所述纯化）在100μl冰冷的Triton裂解缓冲液中在4°C下2 h孵育2 h，然后暴露于365-nm波长UV（CX-2000，UVP），持续10分钟。然后将混合物调节至1 mM TCEP，0.1 mM TBTA，1 mM CUSO4和1 mM Biotin-N3接头的最终浓度，并在4°C下再孵育1小时。通过在20,000 g离心15分钟通过离心清除蛋白质聚集体，然后将10μL链霉亲和素磁珠添加到上清液中，并以温和的旋转方式将其添加到上清液中2小时。然后将珠子用100×体积的Triton裂解缓冲液在4°C洗涤3次，然后在100μl冰冷的Triton裂解缓冲液中孵育，在4°C下含有不同浓度的LCA 0.5 h。然后将上清液与相等体积的2×SDS样品缓冲液混合，然后将SDS -PAGE混合。After staining with Coomassie Brilliant Blue R-250 dye (5% (m/v) dissolved in 45% (v/v) methanol and 5% (v/v) acetic acid in water), gels were decoloured (in 45% (v/v) methanol and 5% (v/v) acetic acid in water), and the excised gel slices were subjected to in-gel chymotrypsin digestion and then dried.使用纳米纤维（Bruker）与配备捕圈源的timstof Pro（Bruker）分析样品。将肽溶解在10μl的0.1％甲酸（V/V）中，并加载到自制的C18柱上（35 cm×75μm，I.D。，1.9μm，100Å）。然后将样品用3–35％乙腈（V/V，0.1％甲酸）的线性梯度以0.3μlmin– 1的流速为60分钟。使用以PASEF模式运行的TIMSTOF PRO MS（BRUKER）获取MS数据，并使用Peaks Studio XPRO软件（Peaks Studio 10.6构建20201221，BioInformatics Solutions）分析数据。。人类Uniprot参考蛋白质组数据库用于数据分析，在此期间将参数设置如下：前体和片段质量公差，20 ppm和0.05 DA；半特异性摘要模式，允许；每肽最大的裂解最大裂解，3;可变修饰，蛋氨酸的氧化，蛋白氨基末端的乙酰化以及丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸的磷酸化；LCA修饰的固定修饰，半胱氨酸的氨基甲基化和467.3763。

　　根据MS结果，包含氨基酸S194和K333的裂口可能构成TULP3的结合位点。然后使用Autodock Vina Software138（v.1.1.2）进行内硅对接测定法，在此期间，LCA和Alphafold预测的TULP3结构（https://alphafold.ebi.ac.ac.ac.uk/entry/entry/o75386)1139,140使用了。然后使用Pymol（Ver。2.5，Schrodinger）软件说明数据。然后将TULP3的氨基酸残基Y193，P195，K333和P336突变（全部分为甘氨酸）生成Tulp3（4G）突变体。如上所述进行结构比对，并使用了Alphafold预测的以下结构：tulp3：https：//alphafold.ebi.ac.ac.uk/entry/o75386;KTUB：https：//alphafold.ebi.ac.uk/entry/q86pc9;TUB-1：https：//alphafold.ebi.ac.uk/entry/q09306;V1E2：https：//alphafold.ebi.ac.uk/entry/q96a05;and vha-8：https：//alphafold.ebi.ac.uk/entry/q95x44。

　　TULP3的热稳定性通过在VP-DSC上进行的差分扫描量热法（DSC）测定，如先前所述15，但进行了较小的修改。简而言之，VP-DSC在无反馈的模式下运行，并且在每次扫描之间和之间进行10°C时的平衡15分钟。扫描范围从10到100°C设置为90°C H – 1。通过与样品单元和带有His-Prution缓冲液一起加载的参考单元进行五个加热循环，可以预先校准该仪器。然后将样品单元用350μm的His标记的TULP3蛋白或30μmHis标记的TULP3（4G）加载在His-Prution缓冲液中，并记录了热容量（CP）与温度的曲线。使用MicroCal VP-Capillary DSC软件收集数据，然后校正His-Pas-Pas-Pash-Pasher-Pasher-Pasher-Pasher-prution Buffer基准，并使用Origin 2016进行扫描速率和蛋白质浓度141归一化。

　　如前所述27，使用基于HPLC-MS的方法确定SIRT1的脱乙酰基酶活性，但进行了一些修改。简而言之，4μgHis标记的SIRT1或SIRT1（E230K）突变体（按照“蛋白质表达”部分所述纯化），要么与4μgtulp3或在5μl镍亲和凝胶上结合，并与从20 cmfs的裂解液中孵育（在60 – 70 – 70 – 70 – 70 – 70 – 70）中孵化的镍亲和凝胶，并孵化。IB）在4°C下持续1 h，然后用1 ml Triton裂解缓冲液洗涤两次，在45μl含有50 mM Tris-HCl，pH 9.0，4 mm mgcl2，0.2 mm dtt的反应缓冲液中孵育，仅在LCA-LCA组中（仅LCA-LCA组）和NAD+ NAD+在25μmLCA（均为5μmLCA）和25°C cysiled+ Clusiled+ c。通过添加5μl乙酰化组蛋白H3肽（QTAR（ACK）STGG）或乙酰化的V1E1肽（LNEA（ACK）QRL）来开始反应，均溶于反应缓冲液到2μgμl -1的库存缓冲液中，以在25分钟的25分钟内掺入2μgμl -1，以在25分钟内加油。接下来，将25μl的100％三氯乙酸和50μl蒸馏水加入混合物中，并将混合物在-20°C下孵育12小时，然后在4°C下以18,000g的速度在30分钟内离心。将颗粒溶解在70μl的10％（V/V，在水中）乙腈，然后涡旋30 s，然后在4°C下以18,000g离心10分钟。Next, 30 μl of supernatant was loaded into an injection vial (5182-0714, Agilent Technologies; with an insert (HM-1270, Zhejiang Hamag Technology)) equipped with a snap cap (HM-2076, Zhejiang Hamag Technology), and 4 μl of supernatant was injected into a HILIC column (HILIC Silica 3 μm,2.1×150毫米，SN：186002015;流动相由10毫米甲酸铵组成，其中包含0.1％（v/v）LC -MS级水中的甲酸（流动相A）和LC -MS级乙腈，含有0.1％（v/v） （流动相）并以0.3 mL min – 1的流速运行。HPLC梯度如下：70％B持续1分钟，然后在12分钟时至30％B，保持3分钟，然后在15.4分钟时返回到70％B，再保持2分钟。6545 ms（安捷伦技术）的参数如下设置：离子源，双AJS ESI；极性，积极；喷嘴电压，500 V；片段电压，175 V；撇渣器电压，65 V;VCAP，500 V;干燥气（N2）流速，8 l min – 1;干燥气（N2）温度为280°C；雾化器气压，35 psig；鞘气温为125°C；鞘气（N2）流速，11 L min – 1;和扫描范围为50–1,100 m/z。组蛋白H3和V1E1的脱乙酰化与乙酰化的肽比确定SIRT1对这些底物的活性。使用以下M/z值计算每种类型的肽的峰面积：乙酰化组蛋白H3：453.2403+905.4805；脱乙酰化组蛋白H3：453.2403+905.4805;乙酰化V1E1：550.8071+1100.6064;和脱乙酰化V1E1：529.8019+1058.5959。

　　如前所述的12,142,143，使用ATP依赖性荧光猝灭的初始速率测量了ATP依赖性质子的传输速率。简而言之，通过在DMEM中孵育60个10厘米的MEF（60–80％汇合），加载溶酶体，在冰上补充了2 mg ML – 1 FITC-DEXTRAN（最终浓度）5分钟，然后转移至37°C启动30分钟。将细胞用DMEM洗涤3次，并在37°C下再与DMEM再孵育30分钟，以使FITC -DEXTRAN转运至溶酶体。然后通过在室温下直接刮擦收集细胞，然后在37°C下在500g下离心5分钟，并根据制造商的说明使用溶酶体隔离套件纯化溶酶体，但进行较小的修饰15。In brief, cells were resuspended in 7 ml of 1× extraction buffer containing protease inhibitor cocktail at room temperature and were dounced in a 7-ml dounce homogenizer (Sigma, P0610) for 120 strokes on ice followed by centrifugation for 10 min at 1,000g, 4 °C, which produced post-nuclear supernatant (PNS).然后将PNS在20,000g下离心20分钟，并通过轻柔的移液悬浮在1×提取缓冲液中，产生粗溶酶体分数（CLF）。将CLF的体积调节为2.4 mL，然后平均分为六个1.5 ml Eppendorf管（每管400μl）。将253μl的零件和137μl的1×optiprep稀释缓冲液加入每个CLF，并通过轻柔的移液添加。该混合物定义为稀释的OptiPrep馏分（DOF）。将每个DOF（0.8 mL）加载到一个11×60 mm离心管中，顶部为27％（0.4 mL）和22.5％（0.5 ml）OptiPrep溶液垫，然后用16％（1 mL），12％（0.9 mL）和8％（0.3 mL）替代覆盖。然后，将管子在150,000克的SW60 Ti转子（贝克曼）上离心4 h，在4°C下4 h 并收集了12％OptiPrep溶液的顶部的分数作为CLF。将馏分用两量PBS稀释，然后以20,000克离心20分钟。然后将上清液吸出，然后将沉积物重悬于测定缓冲液中（125 mM KCl，1 mm EDTA，20 mm HEPES，HEPES，pH 7.5，koH），并在冰上平衡1 h，然后与5μm孔（用于5μmCona混合）（用于计算V-ATPase特定于特异性质子的传输速率），然后将其连接到37分钟，然后将37分给3777。使用Spectramax M5微板读取器以490 nm的激发记录FITC的荧光，并在520 nm处发射。在添加5 mM MG-ATP（最终浓度）后测量荧光猝灭的初始斜率。

　　线粒体如前所述纯化144，但修改次要16。简而言之，通过在室温下刮擦，在37°C下500克离心5分钟，收集了40个10厘米的MEF（60–80％汇合）。然后将细胞恢复在20 ml冰冷的IBCELLS-1缓冲液中（225毫米甘露醇，75毫米蔗糖，0.1毫米EGTA和30 mM Tris-HCl，pH 7.4），并在40毫升的Dounce同层中以100盘（使用小型的较小的清除pestle pestle pestle pestle by centrance pestle by centrance pestle by 2 time fy 2 time fy 2 emif by sig digig; dig dig98888888888888。在4°C下为600克5分钟。然后在4°C下以7,000克离心上清液，并在7,000克离心10分钟。然后用20毫升冰冷的IBCELLS-2缓冲液（225毫米甘露醇，75毫米蔗糖和30 mM Tris-HCl pH 7.4）洗涤颗粒两次。将悬浮液以7,000克离心，然后以10,000克离心，均在4°C下持续10分钟。然后将沉淀重悬于2毫升冰冷的MRB缓冲液中（250毫米甘露醇，5毫米HEPES，pH 7.4和0.5毫米EGTA），并在10 ml的Percoll培养基（225毫米甘露醇，225毫米，25毫米Hepes pH 7.4，1mm egta和30％percoll（Vif）中（Vif）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）14米（Vif），vif percoll（225毫米）（225毫米）。管（344059，贝克曼）。然后将管子在95,000g的SW 41 Ti转子（Beckman）中离心0.5 h，在4°C下为0.5 h。离心后，将位于每个管底部附近的密集带作为线粒体馏分收集。将线粒体分数用10卷MRB缓冲液稀释，然后在4°C下以6,300克离心10分钟。重悬于颗粒并用2 mL MRB缓冲液洗涤，然后在4°C下以6,300g离心10分钟，以获得纯线粒体（颗粒）。

　　如前所述145纯化胞质溶胶。简而言之，将十个10厘米的细胞培养皿在800μL均质化缓冲液中匀浆（HB； 250 mM蔗糖和3 mM咪唑，pH 7.4）。然后将匀浆通过连接到1 ml注射器的22 g针头6次，然后以2,000g离心10分钟以产生PN。然后将PNS样品加载到11×60毫米的离心管的顶部，该管子依次加载了1 ml的40.6％蔗糖（溶解在HB中），1 mL的35％蔗糖（溶解在HB中）和1 mL的1 ml 25％咖啡糖（溶解在HB中）。然后将管子在35,000 r.p.m的SW60 Ti转子（贝克曼）中离心。在4°C下1小时，并作为胞质分数收集了顶部级分（约200μl）。

　　To determine the modifications of v-ATPase, the 21 HA-tagged subunits of v-ATPase, including ATP6V1A, ATP6V1B2, ATP6V1C1, ATP6V1C2, ATP6V1D, ATP6V1E1, ATP6V1E2, ATP6V1F, ATP6V1G1, ATP6V1G2, ATP6V1G3,ATP6V1H，ATP6V0A4，ATP6V0A2，ATP6V0B，ATP6V0C，ATP6V0D1，ATP6V0D2，ATP6V0E1，ATP6V0E1，ATP6AP1和ATP6AP2在HEK293T细胞中单独表达。对免疫沉淀剂（由25个10 cm的HEK293T细胞的免疫沉淀，以特定亚基表达某个亚基的HEK293T细胞进行了SDS-PAGE，并按照“确定LCA的Tulp3结合位点的确定”部分进行处理。使用纳米纤维（Bruker）与配备捕圈源的timstof Pro（Bruker）分析样品。将肽溶解在10μl的0.1％甲酸（V/V）中，并加载到自制的C18柱上（35 cm×75μm，I.D。，1.9μm，100Å）。然后将样品用3–35％乙腈（V/V，0.1％甲酸）的线性梯度以0.3μlmin– 1的流速为60分钟。使用以Pasef模式运行的TIMSTOF PRO MS（BRUKER）获取MS数据，并使用Peaks Studio XPRO（Peaks Studio 10.6构建20201221，BioInformatics Solutions）分析。人类Uniprot参考蛋白质组数据库用于数据分析，在此期间将参数设置如下：前体和片段质量公差，20 ppm和0.05 DA；半特异性摘要模式，允许；每肽最大的裂解最大裂解，3;可变修饰，蛋氨酸的氧化，蛋白氨基末端的乙酰化，丝氨酸的磷酸化，苏氨酸和酪氨酸的磷酸化以及赖氨酸的乙酰化；固定修饰，半胱氨酸的氨基甲基化。

　　为了鉴定SIRT1相互作用的蛋白，对HA标签的SIRT1免疫沉淀剂（从20个10 cm的MEF菜肴中进行免疫沉淀，稳定表达HA标记的SIRT1）进行了SDS-PAGE，并如上所述进行处理。如上所述进行了数据采集，只是使用了配备了易于涂抹纳米库的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spectmometer（Thermo）耦合到Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spectmorter（Thermo）。使用蛋白质组发现者（V.2.2，Thermo）对小鼠Uniprot参考蛋白质组数据库分析数据。

　　通过使用平行反应监测（PRM）基于基于平行的反应监测（PRM）MS，对MEF中表达的每个胆汁酸受体的蛋白质水平进行了定量。简而言之，每个胆汁酸受体在HEK293T细胞中单独表达，然后进行SDS -PAGE和处理，如上所述。使用配备有数据依赖性采集模式的易于使用的纳米源的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spextmeter（Thermo）进行数据采集。将肽在0.1％甲酸中以300 nl min – 1的流速在0.1％甲酸中的线性梯度中洗脱120分钟。使用蛋白质组发现器软件（V.2.5，Thermo）分析了数据依赖性的获取原始文件，并使用UniProt数据库（Mus Musculus），并相应地选择了每个胆汁酸受体的定量肽（如补充表4所示）。然后，使用从MEF制备的样品，M/Z，Z和每个定量型肽的每个定量肽的样品在相同的光谱仪上通过PRM分析来确定内源性胆汁酸受体的蛋白水平。在数据收集过程中，将自动增益控制设置为1×105，最大注射时间在1,000 ms处设置为M/z的前体隔离窗口宽度（在1个源数据文件中可用的完整参数集，可在iProx合作伙伴存储库中存放的源数据文件以及纸张以及论文）。如前所述，使用Skyline Daily Wable Software（21.2.1.424）分析了PRM数据。

　　如先前所述的147，测量了线虫的OCR。简而言之，将线虫用M9缓冲液洗涤3次。将约15–25个线虫悬挂在200μlM9缓冲液中，并在96孔海马XF XF细胞培养物中添加到井中。在制造商的指导下，使用20°C的Seahorse XFE96分析仪（Agilent Technologies）进行了测量，并使用Seahorse XFE96传感器墨盒（Agilent Technologies）在37°C的37°°C的CO2无凝乳器中的Seahorse XF钙调型溶液中预取XF型量子滤器预启发。在测定过程中使用的呼吸链抑制剂的浓度如下：FCCP在10μM下，叠氮化钠在40 mm处。在测定结束时，在细胞成像多模式读取器（Cytation 1，Biotek）上确定每个孔中的线虫的确切数量，并用于标准化和纠正OCR结果。使用Wave 2.6.1桌面软件（Agilent Technologies）收集数据，并根据制造商的说明导出到Prism 9（GraphPad）进行进一步分析。

　　如前所述86,148，但进行了修改，测量了完整的肌肉组织的OCR。简而言之，小鼠饿死了所需的持续时间，并通过宫颈脱位杀死。然后切除来自两个助后的胃肌肌肉，然后在4 ml解离培养​​基中孵育（DM；通过溶解50μgml-1甲状腺霉素，2％（v/v）FBS，4 mg ML – ML – 1胶原酶在DMEM CORIDID HEPES中的胶原酶中的35％combortial combult in 35 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm Mmmmm Mmm Mmm Mmm combult in 35 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmm combult a Hepes combult a Hepes combult）1.5 h。然后将消化的肌肉质量用4 mL预热的胶原酶A-Free DM洗涤，并在0.5 mL预热的预热胶原酶A-Free DM中孵育，并通过20 g针穿过6倍的穿过20 g。接下来，将20μl的肌肉匀浆转移到海马XF24胰岛捕获微板（Agilent Technologies）的孔中。After placing an islet capture screen by a Seahorse Capture Screen Insert Tool (Agilent Technologies) into the well, 480 μl pre-warmed aCSF medium (120 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 1.3 mM CaCl2, 0.4 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 15 mM glu​​cose, 1× MEM non-essential amino acids,使用1 mm丙酮酸钠和1毫米谷氨酸；在使用前调整为pH 7.4），然后在37°C下在无二氧化碳培养箱中平衡1小时。然后，在37°C的XFE24细胞外通量分析仪（Agilent Technologies）中测量OCR，并在Seahorse XFE24传感器弹药筒（Agilent Technologies）中进行了XF型镇静校准溶液（敏捷技术）的预定量，并在37°c At Co2-Free Incubator中进行了预衡。在测定过程中使用的呼吸链抑制剂是寡霉素，最终浓度为10μM。使用波2.6.3桌面软件（Agilent Technologies）收集数据，并根据制造商的说明导出到Prism 9（GraphPad）进行进一步分析。

　　除生存曲线外，使用Prism 9（GraphPad软件）进行了统计分析，该生存曲线使用log-Rank（Mantel-Cox）测试使用SPSS 27.0（IBM）进行了分析。每组数据均经过Kolmogorov – Smirnov测试，Anderson -Darling测试，D'Agostino -Pearson Omnibus测试或Shapiro -Wilk -Wilk测试，以便在适用的情况下进行正态分布。未配对的双面学生的t检验用于确定两组正态分布数据之间的重要性。韦尔奇的校正用于差异不平等的群体。使用未配对的双面Mann-Whitney检验来确定数据之间没有正态分布的数据之间的显着性。对于具有固定因素的多个组之间的比较，使用了一个普通的单向方差分析，其次是Tukey's，Sidak's，Dunnett's或Dunn的测试。使用f检验测试了误差方差均匀性的假设（p> 0.05）。为了比较有两个固定因素的多个组之间，使用了一个普通的双向方差分析，然后使用图例指定的Tukey或Sidak的多重比较测试。Geisser – Greenhouse的校正在适用的情况下使用。调整后的手段和S.E.M.或S.D.当分析符合上述标准时，记录了值。当p时，差异被认为是显着的< 0.05 or P >0.05，观察到的效果差异很大（如参考文献149,150中所示）。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。