大肠杆菌菌株MG1655（ATCC 47076）和B. uttilis fest7003（参考文献32）在镁 - 山基汤（MMB;溶酶体肉汤中均补充了0.1 mM MNCL2和5 mm MGCL2），并在37°C或30°C中分为37°C或30°°C，溶菌化肉汤补充了0.1 mm MM MNCL2和5 mm mgcl2）。每当适用时，培养基添加了氨苄青霉素（100μgml -1），氯霉素（34μgml -1）或卡那霉素（50μgml -1），以确保维持质粒。如前所述进行噬菌体隔离33。通常，在37°C的MMB培养基中进行噬菌体感染，用于大肠杆菌Mg1655，在30°C下进行枯草芽孢杆菌和噬菌体，通过将单个噬菌体斑块选择成在MMB培养基中的600 nm（OD600）的光密度（OD600），直至培养培养物，从而传播噬菌体。然后将培养物在3,200克离心10分钟，然后通过0.2μm滤光片过滤上清液。如前所述，使用小滴定斑块测定法确定裂解物的滴度34。

　　如先前所述11,23,31,35，ACB1，APYC1，CGAS/DNCV样核苷酸转移酶（CD-NTase），CGAS样受体和效应蛋白被从大肠杆菌中纯化。简而言之，将基因从合成DNA片段（集成的DNA技术）克隆到含有HIFI DNA组装大师Mix（NEB）35的吉布森组装中的自定义PET表达矢量中，该定制PET表达矢量含有氨基末端6×His-Sumo2或6×His-MBP-SUMO2标签。expression plasmids were transformed into BL21(DE3) RIL cells (Agilent) and plated onto MDG media (1.5% Bacto agar, 0.5% glucose, 25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 0.25% aspartic acid, 2–50 μM trace metals, 100 μg ml−1氨苄青霉素，34μgml -1氯霉素）。在37°C下过夜孵育后，使用三个菌落接种30毫升MDG的起动培养物16小时（37°C，230 R.P.M.）。M9ZB表达培养物在体积中为1 l（47.8 mm Na2HPO4，22 mm Kh2pO4，18.7 mm NH4CL，85.6 mm NaCl，1％卡amino甘油，0.5％甘油，2 mM MGSO4，2 mM MGSO4，2-50μm痕量金属然后将氯霉素）用15 mL MDG的起动培养物接种，并生长（37°C，230 R.P.M.）至2.5的OD600，然后用0.5 mM Isroplopyl-β-二甲基乳糖苷（IPTG）诱导，持续16 h（16°C，16°C，230 r.p.p.p.p.p.p.mm.）。For WT Apyc1 protein, bacteria were grown in 2YT media (16 g l−1 Bacto tryptone, 10 g l−1 yeast extract, 5 g l−1 NaCl, pH 7.0) for both starter and expression cultures and grown to an OD600 of 1.5 before induction with 0.5 mM IPTG for 16 h (16 °C, 230 r.p.m.).如先前描述的29，通过在修饰的M9ZB培养基中表达1 L培养物（47.8 mm Na2HPO4，22 mm KH2PO4，18.7 mm NH4CL，85.6 mm NaCl，85.6 mm NACL，0.4％葡萄糖，0.4％葡萄糖，2 mm mgSO4，2MM MGSO4，2 – 250 mm treals Mectals Morgeals grognals，selenomethion-labell标记的蛋白。100μgml -1氨苄青霉素，34μgml -1氯霉素），并允许培养物生长至0.8的OD600，然后再补充 - 氨基酸（50 mg ml -1亮氨酸，异糖酸酯，脱甲酸酯，瓣膜，瓣膜； 100 mg mg ml -1; 100 mg ml -1 exyl -1 rysylalanine，lysylynine，threonine，threonine，threonine，threonine，threonine，threone，threone，threone; 75 mg mL -1硒蛋白）和0.5 mM IPTG诱导16小时（16°C，230 R.P.M.）。

　　过夜表达后，通过离心收集细胞颗粒，然后在50 mL裂解缓冲液中重悬于和裂解并裂解并裂解（20 mM Hepes-KOH pH 7.5，400 mM NaCl，10％甘油，10％甘油，30 mm咪唑，咪唑，1毫米TCEP）。通过以50,000g离心30分钟来阐明裂解物，将上清液倒在8毫升Ni-NTA树脂（Qiagen）以上，用35 ml裂解缓冲液用1 m NaCl补充了树脂，并用蛋白质补充了10 mL裂解缓冲液，并用300 mM imiDazole补充了蛋白质。然后将样品在透析管中用14 kDa的分子量截断（Ward's Science）透析过夜，然后用重组人SENP2蛋白酶进行SUMO2 TAG裂解，如前所述35。将用于晶体学的蛋白质透析在4°C下透析缓冲液（20毫米HEPES-KOH pH 7.5，250 mm KCl，1 mm TCEP），然后通过使用16/600 SuperDex 75列（cytiva）的尺寸 - 分类色谱法进一步净化补充10％甘油。使用10 kDA MWCO离心滤波器单位（Millipore Sigma），将纯化的蛋白浓缩至> 15 mg ml-1，等分试样，在液氮中冷冻并储存在-80°C。

　　如前所述，薄层色谱法用于分析环状核苷酸降解29。使用以下纯化的重组酶合成环状核苷酸：V。Cholerae DNCV（参考文献11）：CAA，3'3'-CGAMP，CGG；E. Cloacae CDND（参考文献23）：CAAA，CAAG；Rhodothermus Marinus CDNE（参考11）：CUA；Y. Aleksiciae CDNE（参考文献36）：3'3'-cuu;果蝇Eugracilis CGLR1（参考文献31）：3'2'-cgamp;Mus Musculus CGAS（参考文献35）：2'3'-cgamp;大肠杆菌PYCC（参考2）：CCMP;Burkholderia cepacia pycc（参考2）：cump。Synthesis reactions were performed at 37 °C for 20 h, and consisted of 2.5 µM appropriate enzyme, 25 µM appropriate nucleoside triphosphates (NTPs), trace amounts of α-32P-labelled NTP, 100 mM KCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), 5 mM MgCl2, 1 mM MnCl2 and 50 mM Tris-HCl pH 7.5（DNCV，CGLR1，CGAS）或pH 9.0（所有其他酶），最终体积为40 µl。通过添加1 µL快速CIP（NEB），然后在37°C孵育30分钟，并在95°C的热灭活2分钟，从而消化了未纳入的NTP。然后将合成反应用作下游降解反应的输入，该反应在37°C下以10 µl的混合物组成，由1 µl 10 µl的10倍重组酶或细胞裂解液，0.25-0.5 µl的0.25-0.5 µl适当的合成反应（约1-2-2p-cy）cy（约1-32p）。Tris-HCl pH 7.5、10 mm KCl和1 mm TCEP。5–20分钟孵育后（除非另有说明），在20 cm×20 cm的PEI纤维素薄层色谱板（Sigma Aldrich）上发现了0.5 µl的反应，并在1.5 m kh2po4（ph 3.8）的缓冲液中发育45分钟。将板在室温下干燥，暴露于储存磷光器屏幕上，并用台风三重量变量模式成像器系统（GE Healthcare）检测到。

　　将大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的过夜培养在250 mL MMB培养基中稀释1：100，并在37°C下生长大肠杆菌，枯草芽孢杆菌（250 r.p.m.）在30°C下生长，直到达到0.3的OD600。培养物在最终感染的最终多种感染中被噬菌体感染（补充表1）。在培养崩溃之前采集感染细胞的样品（有关时间点，请参见补充表1）。取5 mL的样品在体积中进行，并在3200g和4°C下离心5分钟。使用干冰和乙醇冷冻培养基颗粒。将大肠杆菌颗粒重悬于250 µL的裂解缓冲液中，其中含有20 mm Hepes-KOH pH 7.5、150毫米NaCl，5 mm MGCL2、1 mM MNCL2、1 mM MMNCL2、1 mM DTT，10％甘油和10％甘油和1％NP-40，并在室温下孵化，并在室温下孵化30分钟，可用于30分钟。首先将芽孢杆菌在37°C的PBS中用T4溶菌酶（热泡）在1 mg ml-1中处理10分钟，然后在室温下添加400 µL 400 µL的大肠杆菌裂解缓冲液和30分钟的孵育。通过在4°C下以17,000克离心5分钟来阐明样品，并将上清液等分并在液氮中冷冻，并储存在-80°C下。

　　隔夜大肠杆菌MG1655培养物以1：100稀释至2 L MMB的体积，并生长约1小时，至0.3-0.5的OD600。在感染的多种感染中加入噬菌体T4，并在感染后25分钟通过离心20分钟收集细胞3200g。将感染的细胞颗粒重悬于40 mL的裂解缓冲液中，由20 mM HEPES-KOH pH 7.5、150 mM KCl，1 mM DTT，5 mM MGCL2、1 mM MMNCL2、10％甘油和10％甘油和1％NP-40和1％NP-40，并在房间温度下进行30分钟的温度孵育30分钟。通过在4°C下以20,000克离心15分钟来阐明裂解物，并使用5 ml HITRAP SP柱和0.05-1.0 m NaCl通过离子交换色谱分离。合并，浓缩活性离子 - 交换分数，并用10/300 SuperDex 75柱（Cytiva）进一步分离。在单独的方法中，（NH4）2SO4添加到澄清的裂解液中，最终浓度为30％，并通过20,000g离心去除沉淀的蛋白质15分钟。然后使用疏水相互作用色谱分离可溶性级分，使用5-ml苯基柱（Cytiva）和1-0.0 m（NH4）2SO4分离。合并，浓缩活性分数，并用10/300 SuperDex 200色谱柱（Cytiva）进一步分离。对于每个富集方案，如前所述29，通过无标记的质谱法对相对于邻近非活性分数的含量最高的分数中的噬菌体T4蛋白进行了定量。

　　如先前所述37所述，使用Qiagen dneasy血液和组织试剂盒从从感染的大肠杆菌中分离出的基因组T4 DNA从受感染的大肠杆菌中分离出来的基因组T4 DNA从生化分离和质谱分析中鉴定出噬菌体T4基因。使用Q5 DNA聚合酶（NEB）对候选基因进行了PCR，并根据NEB无细胞细胞大肠杆菌蛋白质合成系统（NEB）的NEB细胞基因上游融合了含有T7启动子和核糖体结合位点的49个基本对序列（NEB）。使用PCR清洁试剂盒（QIAGEN）纯化PCR产物，并使用大肠杆菌蛋白合成系统试剂盒（NEB）翻译。每种翻译反应的1 µl体积用于测试通过薄层色谱法测试3'3'-cgamp裂解活性。ACB1被确定为噬菌体T4基因57b的乘积。

　　如前所述33，从枯草芽孢杆菌Best7003培养物上的土壤样品中分离出Sbsphij1-7噬菌体。使用高右噬菌体裂解物（> 107 pfus mL-1）用于DNA提取。用DNase-I（默克目录编号11284932001）处理500 µl体积的噬菌体裂解物，添加到最终浓度为20 mg ml-1中，并在37°C下孵育1小时，以去除细菌DNA。使用Qiagen Dneasy血液和组织试剂盒（目录编号为69504）从蛋白酶-K治疗步骤开始提取DNA。如前所述，准备使用修改的NEXTERA协议来制备图书馆的光明测序。按照Illumina测序，使用Custadapt版本2.8（参考文献39）从读取中删除适配器序列，并使用-Carefull Flag，使用Spades Genome Assembler版本3.14.0（Ref。40）将每个噬菌体基因组的修剪读数组装成脚手架。每个组装的基因组用浪子版本2.6.3（参考文献41;默认参数）进行分析，以预测开放的阅读框架。

　　SBSPHIJ和密切相关的家族成员SBSPHIJ1-7的基因组序列使用Progracgive Mauve（参考文献42）对齐。CCMP裂开的噬菌体独有的区域显示了八个候选基因。使用HHPRED（参考文献43）分析了相应的SBSPHIJ蛋白序列，以进行预测的结构同源物。扩展数据中列出了具有> 75％概率的蛋白质类别图5B和APYC1被确定为噬菌体Sbsphij基因147的乘积。

　　使用默认参数的NCBI BLASTP鉴定了ACB1和APYC1的同源物。如果ACB1序列在噬菌体结构或包装蛋白的三个基因之内，则将其归类为属于预言。通过将搜索限制为病毒序列来鉴定APYC1噬菌体序列（NCBI Taxid：10293; https：//wwww.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/taxonomy/browser/browser/wwwwtax.cgi?id=10239）。使用超快引导和1,000次迭代的IQ-Tree Web服务器生成了最大样本树44。然后使用Life的互动树在视觉上进行视觉编辑45。

　　使用Easyxtal 15孔托盘（Nextal）以悬挂式滴滴格式生长晶体。在18°C下在2 µl液滴中生长的天然和硒甲米甲氨基氨酸标记的噬菌体FBB1 ACB1 G8 – D152与纯化的蛋白质混合1：1（4 mg ml-1，20 mM Hepes-koH pH 7.5，8.5，80 mm kcl，1 mm tcep）和储气液（2 mmmon）（2 mmmon）sulffffffffffffffffffffffffffffff。pH 4.6）。将晶体生长1-7天，然后用补充了45％蔗糖的储层溶液进行冷冻保护，并通过液体氮气中的冷冻收集。使用相同的储层条件，将FBB1 ACB1-3'3'-CGAMP络合物的晶体种植，除了滴剂和冷冻蛋白溶液外，还要补充100 µM水解耐水磷酸硫硫酸磷酸硫硫酸磷酸盐修饰的类似物的3'3'-cgamp（Biolog Life Science Institute，c 216）。Bsp38 APYC1的晶体在18°C的2 µl滴剂中生长1：1与纯化蛋白（10 mg Ml-1，20 mM Hepes-KOH pH 7.5，80 mM Kcl，1 mM TCEP）和储层溶液（0.2 m硫酸盐，0.1 mm硫酸盐，0.1 m Tris-Hcl pH 7.5 7.5，30％）。将晶体生长1-7天，然后用补充15％甘油的储液溶液进行冷冻保护，并通过在液氮中冷冻收集。Crystals of selenomethionine-labelled Paenibacillus J14 (GenBank accession number WP_028539944.1) Apyc1 were grown at 18 °C in 2-µl drops mixed 1:1 with purified protein (10 mg ml−1, 20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 80 mM KCl, 1 mM TCEP) and reservoir solution (0.1 MTris-HCl pH 8.5，0.2 m mgcl2，16％PEG-4000）补充了100 µM cAMP的耐水解磷酸硫硫代磷酸盐改性的类似物（生物生命科学研究所，003）。将晶体生长1-7天，然后用补充了25％乙二醇的储层溶液进行冷冻保护，并通过冷冻在液氮中收集。在2 µl液滴中，在18°C下生长乳杆菌的晶体，将1：1与纯化蛋白（10 mg ml-1，20 mM Hepes-koH pH 7.5，80 mM Kcl）混合1：1 （0.1 M HEPES-KOH pH 7.5，0.2 m乙酸钙，10％PEG-8000）。将晶体生长1-7天，然后用补充了25％乙二醇的储层溶液进行冷冻保护，并通过冷冻在液氮中收集。在高级光子源（Beamlines 24-ID-C和24-ID-E）上收集X射线衍射数据，并使用SSRL AUTOXDS脚本（A. Gonzalez，Stanford SSRL）处理数据。对于ACB1和APYC1相测定，使用硒甲氨酸标记的ACB1晶体收集异常数据，在Phenix中用HYSS鉴定出较重的位点（参考文献46），并使用苯金利克斯中的溶液/分辨率生成初始图（参考文献46）。使用COOT（参考文献47）进行模型构建，然后在Phenix中进行完善。如补充表2中所述分析统计数据（参考文献48,49,50）。将最终结构精制成Ramachandran图的立体化学统计数据（受青睐/允许），旋转异常值和摩尔普利分数如下：FBB1 ACB1，98.52％/1.48％，0.8％和1.11；FBB1 ACB1-3'3'-CGAMP，99.26％/0.74％，1.56％和1.39；BSP38 APYC1，90.79％/7.46％，4.85％和2.64；P. J14 APYC1，95.04％/4.96％，2.38％和1.78；P. Xerothermodurans apyc1，96.12％/3.88％，1.93％和1.60。请参阅补充表2和存储PDB代码的数据可用性声明。所有结构图均用Pymol 2.3.0产生。

　　在100μl的体积中进行了用于HPLC分析的ACB1和APYC1反应，由50 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM KCl，1 mM DTT，100 µM化学合成的核苷酸标准标准（生物学生命科学研究所）和1 µm再生型蛋白质组成。APYC1反应进一步补充了5 mM MGCL2和1 mM MNCL2。将反应在37°C下孵育20分钟（除非图在图中另有说明），并使用10 kDa截止过滤器（Millipore）进行过滤。使用C18色谱柱（Agilent Zorbax Bonus-RP 4.6×150 mm，3.5 µm）分析过滤的核苷酸产物，并加热至40°C，并在50 mm NAH2PO4的缓冲液中以1 ml-min-1的速度运行，该缓冲液的NaOH调整为PH 6.8，并用3％的乙酸乙烯酸乙烯酸盐调整为pH 6.8。

　　在含有1μM环状核苷酸的反应中与纯化的T4 ACB1和SBSPHIJ APYC1预孵育合成环状核苷酸（生物生命科学研究所），1 µM重组ACB1或APYC1蛋白，100 mm Tris-HCl PH 7.5，100 mm kcl和1 mm dtt，1 H. 50 mm tris-Hcl pH 7.5，100 mm tris-hcl pH 7.5。APYC1反应进一步补充了5 mM MGCL2和1 mM MNCL2。然后，使用以下重组CBASS和PYCSAR效应蛋白：V。Cholerae CAPV（参考文献11），E。cloacae Cap4（参考文献23），B。pseudomalleicap5（参考文献23）和B. cepacia pyctir（Ref。22），使用以下重组CBASS和PYCSAR效应蛋白，将循环核苷酸反应用作效应子激活反应的10倍输入。将核酸酶效应子在含有1μM效应蛋白的25μl反应中孵育，缓冲液由50 mM Tris-HCl pH 7.5，25 mm NaCl，5 mM MGCL2，1 mM DTT和10ngμl-1 pgem9z质粒DNA孵育。在37°C下孵育20分钟后，添加5μl的DNA载荷染料，并在1％琼脂糖凝胶上分析15μL，如前所述23。在由1μM纯化效应子组成的25μl反应中分析CAPV磷脂酶活性，50 mM Tris-HCl pH 7.5，25 mM NaCl，5 mM MGCL2，1 mM DTT和1 mM DTT和面积标记的Enzchek Enzchek磷脂酶底物（热疗法器（热疗法））如前所述。根据制造商的说明，使用协同H1读取器（Biotek）测量磷脂酶活性。Pyctir在40μm中使用25μl反应，由20 mM Hepes-KOH pH 7.5、100 mM KCl和500μm的荧光NAD+模拟ε-NAD（Sigma）组成。在室温下2分钟孵育后，在协同的H1读取器（Biotek）中进行荧光测量（300 nm激发，410 nm发射）。

　　如先前所述36，使用导致霍乱弧菌DNCV 3'3'-CGAMP合成的V. Cholerae DNCV 3'3'-CGAMP合成的条件在大肠杆菌中测量CBASS效应函数。E. coli BL21(DE3) competent cells (NEB) were transformed with three plasmids encoding V. cholerae CapV (pBAD33), the CBASS effector B. pseudomallei Cap5 (pET16), and either WT or catalytically inactive (H44A/H113A) T4 Acb1 (pTU175)51.将转换板铺在MDG板上，并在5-mL MDG启动培养物中采摘三个菌落并种植16小时（37°C，230 R.P.M.）。用200 µL MDG启动培养物接种了5 ml体积的M9ZB培养物，并生长3 h（37°C，230 r.p.mm），然后通过在含有5 µM IPTG和0.2％ - 阿拉伯蛋白的M9ZB培养基中稀释1：5诱导1：5。将诱导的培养物（200 µL）添加到96孔板的井中，在Synergy H1读取器（Biotek）中，每6.82分钟读取OD600，同时在230 R.P.M.，37°C时摇动。单独包含培养基的井被用于OD600背景减法。

　　如前所述，噬菌体挑战实验是通过在带有完整的CBASS或PYCSAR防御操纵子的细菌的草坪上发现高贴噬菌体的连续稀释液，进行了噬菌体挑战实验。使用了以下防御系统：大肠杆菌菌株KTE188（IMG基因登录编号：2564596481–2564596485; https：//img.jgi.doe.gov/）在其本机启动子下克隆到质粒psg1（psg1）中（推荐3），其本地cdng cdng clong clong clong clond（推荐）（推荐）（推荐）（推荐）（推荐）（推荐）（推荐）（推荐Y. Aleksiciae Cdne（参考文献36）克隆到PBAD载体中，而大肠杆菌Pycc（参考文献2）将其本机启动子克隆到质粒PSG1中。对于ECCDNG和Yacdne操纵子，还使用了对照质粒，其中CD-NTase被灭活（CDNG-D82A/D84A）23或受体的跨膜段被删除（Yacdne）36。在这些防御系统的上下文中，噬菌体复制是使用斑块斑块测定法测量的36。简而言之，在37°C下将含有防御系统的大肠杆菌MG1655（ECKTE188，ECPYCC）或BL21细胞（ECCDNG和Yacdne）生长过夜。将300μl体积的细菌培养物与4 mL融化的MMB琼脂混合，其中含有适当的抗生素和0.2％阿拉伯糖的PBAD质粒，倒在15 cm板的溶溶剂肉汤的顶部，然后在室温下在板上固化1小时。在MMB中连续稀释高噬噬菌体，将3–5μl的滴剂放在细菌层上，并在室温下干燥1小时。将板在37°C（ACB1和APYC1救援实验）或30°C（ΔACB1T4噬菌体挑战）中孵育过夜，并通过计算过夜孵化后计数衍生的斑块来确定斑块形成单位（PFU）。表达活性CBASS操纵子的细胞的噬菌体感染不会产生清晰的斑块。为此，细菌生长没有可检测到的缺陷的稀释被认为具有单个斑块。用于体内救援实验， 使用Gibson Assembly（NEB）将ACB1和APYC1从T4噬菌体或SBSPHIJ噬菌体的基因组中扩增到质粒PBBS8K（Addgene Number 35276）中。

　　如前所述52,53，使用基于CRISPR的选择策略将废话突变引入ACB1中。简而言之，将靶向ACB1的GRNA和一个无义突变的修复模板克隆到PCRISPR中（Addgene 42875）。然后将大肠杆菌TOP10细胞用PCRISPR-GRNA-ACB1修复质粒和PCAS9转化（Addgene 42876）。采摘一个菌落，并用WT噬菌体T4感染了2-ML的对数尺度培养物，直到培养物崩溃为止。通过0.22-μm滤光片过滤所得的裂解物，并在没有质粒的大肠杆菌Top10细胞上铺板。将单个斑块挑选为含有2μL氯仿的200μlSM缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.5，100 mM NaCl，8 mm MGSO4）。在室温下1-H孵育后，根据制造商的说明，将4μL用作使用Gotaqgreen（Promega）的标准PCR反应的输入。使用Qiaquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN）纯化PCR产物，并测序用于引入无意义的突变。噬菌体T4克隆正经过三轮牙菌斑的净化，然后产生了用于所有噬菌体挑战实验中的高贴股票。

　　统计检验在图传说中描述，并使用GraphPad Prism 9.3.1进行。有关重复和样本量的实验详细信息在图传奇中描述了。没有使用统计方法来预先确定样本量，也没有使用盲目或随机分组。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。