HELA，HCT116，A549，H1975，HEPG2，HEPA1-6，NCI-H1299，HCC1937，MCF7，T47D-KBLUC，786-O，A-498，5637，5637，T24，T24和HEK293T细胞从美国型型文献中获得了美国典型的文化培养物。G. legube提供了ASISI-ER-U2OS-AID细胞；X.R. Greenberg提供了U2OS-265记者细胞。将所有细胞培养在Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）中，该培养基（DMEM）补充了10％的胎牛血清（FBS）和1％青霉素 - 链霉素，并在37°C下保持在5％CO2的加湿孵化器中，并释放了混蛋。

　　将H1.4（也称为H1-4）和CTPS1 CDNA从HeLa细胞克隆，并分别亚克隆到P3×FLAG-CMV10，EGFP-C1，PET28B和PGEX-4T3载体中。将P300的CDNA（也称为EP300），CBP（CREBBP），HMOF（KAT8），TIP60（KAT5）和PCAF（KAT2B）（KAT2B）克隆到P3×FLAG-CMV-10中。将P300 HAT的CDNA克隆到P3×FLAG-CMV-10，MCHERRY-N1，EGFP-C1和PGEX-6P1载体中。将P300片段的cDNA克隆到PGEX-6P1中。将H1.1，H1.2 H1.3和H1.5的CDNA克隆到P3×FLAG-CMV-10中。根据制造商的协议，使用野生型构建体作为模板（vazyme Biotech）的模板生成所有突变构建体。补充表1提供了质粒构建引物的清单。

　　对于瞬态转染，按照制造商的说明，使用Ultrictect 3.0试剂（4A Biotech）用上述质粒转染细胞。根据制造商的指南，还使用干扰素转染试剂（Invitrogen）将细胞用非靶向对照或基因特异性siRNA转染。所有siRNA序列均列在补充表2中。通过Sanger测序和蛋白质印迹证实了纯合插入和敲门液。补充表3中提供了单个指南RNA（SGRNA）的寡核体和序列的列表。

　　对于基因敲除细胞系，将靶向H1.1 – H1.4或CTPS1的SGRNA携带的质子病毒2质粒转染了HEK293T细胞72 h，使用聚乙基胺（PolySciences）根据制造商的指示。收集含有慢病毒的培养基并在8μgml -1聚甲烯的情况下转移至HeLa细胞。感染48小时后，将细胞亚种子分成96孔板，并使用紫霉素（2μgml-1）选择单个菌落1周。从幸存菌落的WCL中提取蛋白质进行蛋白质印迹分析。

　　对于过度表达的细胞系，将携带抗SGRNA突变的FLAG-H1.4的PCDH-CMV-MCS-EF1慢病毒转染48小时。携带抗SGRNA的耐烟病毒的慢性病毒将转染到CTPS1-KO细胞中48小时。然后将转染的细胞培养在含有嘌呤霉素（5μgml -1）的培养基中10天。选择抗生素后，将细胞子种子分成96孔板，以选择单个菌落。从幸存菌落的WCL中提取蛋白质进行蛋白质印迹分析。

　　如前所述61，建立了HELA细胞中的FKBP12 DEGRON TAG介导的系统，以耗尽HELA细胞中的CTPS1（FKBP – CTPS1）。为了为CTPS1生成内源性DTAG诱导的降解系统，将靶向起始密码子区域和PUC19质粒的SGRNA共转染到HELA细胞或表达野生型或突变体FLAG-H1.4的HELA细胞或H1.4-KO HELA细胞中。PUC19质粒包含以下元素：左右同源臂，以及FKBP12（F36V），3×FLAG标签，P2A和编码Blasticidin-Seminase（BSD）的基因。选择转染的细胞，用10 µg ML-1蓝胶蛋白 - s-选择性抗生素（Blasticidin-S HCl； A1113903，Thermo Fisher Scientific）选择，并将子种子分成96孔的板，以选择单个菌落并筛选出正确的双质体整合。PCR和Western印迹证实了所有纯合插入和敲击。

　　为了提取组蛋白酸，将含有0.4 M硫酸的低渗性缓冲液中的冰裂在冰上，并在4°C下用三氯乙酸沉淀过夜。用冰冷的丙酮将组蛋白颗粒洗涤两次，然后气干。然后将沉淀重悬于等体积的DDH2O和2×加载缓冲液中，然后在免疫印迹之前煮沸5分钟。

　　对于染色质分馏，在缓冲液I（50 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl和1 mM EDTA）中收集细胞并在冰上裂解，其中含有0.1％Triton X-100和1％蛋白酶抑制剂鸡尾酒3分钟。离心后（13,000g持续3分钟），将上清液丢弃，并将沉淀重悬于冰I中，含有200μgml -1 rnasea和1％蛋白酶抑制剂鸡尾酒3分钟。第二次离心后，将沉淀重悬于相等的PBS和2×载荷缓冲液中，并在免疫印迹之前煮沸5分钟。

　　对于WCL提取，将细胞在冰缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.5、137 mm NaCl，10％甘油，1％NP-40、2 mM EDTA和1％蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中收获30分钟，然后在13,000G处进行15分钟的15分钟，然后在13,000G处进行15分钟。离心后，将沉淀重悬于5倍的加载缓冲液中，并在免疫印迹之前煮沸5分钟。

　　对于内源性共免疫沉淀，在裂解缓冲液（20 mm Tris-HCl pH 7.5、137 mm NaCl，10％甘油，1％NP-40、2 mM EDTA和1％蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中，在冰上制备WCL 30分钟，然后在13,000G处于15分钟。用指定的抗体（2μg）在4°C下过夜，将裂解物免疫沉淀，然后再添加30μl蛋白G或蛋白A A琼脂糖凝胶珠。在4°C下再孵育2小时后，将珠在NP-40缓冲液中洗涤3次（20 mm Tris-HCl pH 8.0，137 mm NaCl，1％NP-40，10％甘油，2 mm EDTA和1％蛋白酶抑制剂鸡尾酒），在4°°C处于100 g时。将沉淀的成分煮沸并通过蛋白质印迹分析。

　　对于FLAG共免疫沉淀，将WCLs提取并用Flag-琼脂糖凝胶珠在4°C下过夜。将珠在NP-40缓冲液中洗涤3次，并在4°C下以100克离心1分钟。将免疫沉淀的蛋白在TBS缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4和150 mM NaCl）中用50μL3×FLAG肽（Sigma-Aldrich; 0.125 mg ML-1）在4°C下过夜过夜过夜。将上清液与2×SDS载荷缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 6.8、4％SDS，20％甘油，0.2％溴酚蓝色和2％β-羟基乙醇）煮沸。

　　将其标记或GST标记的质粒转化为大肠杆菌BL21细胞，并用0.1 mM异丙基β-1-1-硫代甲基乳糖苷（IPTG）在16°C诱导，然后在16°C下过夜，然后使用Ni-Isa sepharose gel或glutathione gel或Glutathione-sepharose-seapharose-seapharose – Sepharose-Sepharose-seapharose – Sepharose-seapharose – Seapharose-4b Beads均等。在4°C下，将等量的单个HIS融合蛋白与十个缓冲液中的GST融合蛋白在4°C（10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA和100​​ mM NaCl）中孵育4小时。然后将珠子在10个缓冲液中洗涤3次，在4°C下以100克离心1分钟，然后在相等的体积2×SDS加载缓冲液中煮沸5分钟，然后再进行免疫印迹或COOMASSIE亮蓝色染色。

　　通过SDS -PAGE（6–15％凝胶）分离等效量的煮沸蛋白样品，并转移至硝酸纤维素膜。用5％BSA阻塞后，将膜在4°C下与指定的原代抗体孵育过夜，然后在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗孵育2小时。使用ECL试剂盒（WBULS0500，Millipore-Sigma Aldrich）检测蛋白质，并使用Tanon 5200SF成像系统可视化。补充表4提供了有关抗体的信息列表。

　　对于H1 PTM识别，组蛋白通过SDS -PAGE分离，并用Coomassie Brillial Blue染色。然后将频带发送到Wininnovate Bio进行液相色谱 - tandem质谱法以识别H1 PTM。所需的页面频带在质谱级胰蛋白酶（V5280，promega Biotech）中脱水，脱水和消化，在37°C下持续12小时。从含有0.5％三氟乙酸的70％乙腈/水的凝胶中提取肽，然后将6μl肽混合物加载到Nanoviper C18（Acclaim c18（Acclaim c18）上，冻干并将其重新悬浮在5％乙腈/水（0.1％甲酸）中（0.1％甲酸）（0.1％甲酸）。将肽在易于的NLC 1200系统（Thermo Fisher）上进行色谱分离。在配备有纳米柔性离子源的Q精确质谱仪（Thermo Fisher）上获取了串联质谱。使用Peaks Studio 8.5（生物信息学解决方案）处理串联质谱法原始数据以进行蛋白质识别和PTM分析。数据库搜索参数如下设置：Uniprot-Human的蛋白质组数据库，包括20,603个蛋白质条目或H1.2_HUMAN组蛋白的靶蛋白（Uniprot登录号：P16403）；前体和片段离子的质量公差分别为10 ppm和0.05 Da；乙酰化（蛋白质N末端，K），氧化（M），脱氨酸（NQ）和固定氨基甲基化（C）的固定修饰的可变修饰。根据每个样品中的肽区域进行了不同样品之间PTM的无标签定量分析，该分布通过分布相关的肽特征区域（包括不同的M/Z提取的离子色谱区域）来计算。

　　对于CTPS1磷酸化位点鉴定，提取WCL，使用抗FLAG进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE分离，并用Coomassie Brillial Blue染色。然后将条带发送到PTM BIO进行液相色谱 - 倾向质谱法，以鉴定CTPS1磷酸化位点。

　　将提取的组蛋白蛋白溶解在150μL的再合化缓冲液中（8 m尿素，2％CHAP，0.5％IPG缓冲液和0.002％Bromophenol Blue），然后使用以下程序加载到等电聚焦（IEF）的条件上：20 V（重新放置）；500 V持续1 h;1,000 V持续1 h;1,000–5,000 V持续4 h;和5,000 V持续4 h。在IEF之后，将条带在SDS平衡溶液中孵育15分钟，其中含有10 mg ml-1二硫代抗素（DTT），然后在SDS平衡缓冲液中再孵育15分钟（50 mM Tris-HCl pH 8.8，6 m尿素，30％尿素，30％甘油，2％SDS和0.001％sds和0.001％bromophenol Blue bluemopher蓝蓝色）含量为2--含2--含量为2---含量为2---含量为2------含量为2--------含量为2--------含2--辅助。在免疫印迹前通过SDS -PAGE缓冲液洗涤条，并通过SDS -PAGE解决。

　　U2OS-ASISI-ER-AID细胞暴露于500 nm 4OHT 4小时。使用过度活跃的cut＆Tag测定试剂盒或多动ATAC-SEQ套件（Vazyme）进行切割和TAG或ATAC-SEQ。

　　用抗H1（N76D/N77D），抗H1K75AC，抗H1K75AC2ND或抗CTPS1抗体进行切割和TAG。简而言之，用提供的核提取缓冲液从1×105细胞中提取核，然后与10μlCona珠一起孵育。然后，加入1μg抗H1（N76D/N77D），抗H1K75AC，抗H1K75AC2ND或抗CTPS1抗体，并在室温下培养2小时。用提供的挖掘缓冲液洗涤两次后，添加0.5μg二级抗体并在室温下孵育30分钟。用挖掘缓冲液洗涤两次后，用珠子将2μLPA/G-TN5培养1小时，然后在37°C进行标记1小时。用蛋白酶K和缓冲液B/L停止反应，并用DNA提取珠提取DNA，以进行随后的PCR，以扩大文库。

　　对于ATAC-SEQ，收集了5×104个细胞并重悬于裂解缓冲液中（10 mM Tris-HCl pH 7.5，10 mM NaCl，3 mM MGCL2和0.05％NP-40）。将裂解物在4°C下500克离心3分钟。将细胞沉淀重悬于转骨反应混合物中，并在37°C下孵育45分钟。在PCR之前，使用ATAC DNA提取珠纯化了转置DNA以扩增库。用ATAC DNA清洁珠纯化了放大的ATAC-SEQ库，并用30μLDDH2O洗脱。

　　使用TRUEPREP索引套件（Vazyme）创建了库，并发送到Novogene在Illumina Novaseq 6000平台上进行测序。使用FASTP（V0.23.4）处理原始读取，以消除适配器和低质量序列。Bowtie2（v2.5.4）使用参数“ - 非常敏感 - 无粘合剂”来​​对齐HG38人类基因组参考。SamTools用于将SAM文件转换为BAM格式，应用最低映射质量得分的过滤标准为10。使用PICARD工具删除了重复的读取。然后，使用BAMCoverage函数将BAM文件转换为BW格式，并使用参数“ –NormalizeSUSE BPM”进行了归一化。使用升降机实用程序，将前80个Bless信号酶切割位点62进行从HG19到HG38的坐标转换。使用DeepTools的ComputeMatrix和PlotheatMap函数（v3.5.5），完成了每种组蛋白修饰和开放染色质的信号的metagene曲线和热图（v3.5.5）。根据先前的研究62，DSB站点被归类为容易重组或NHEJ。

　　将细胞暴露于10 Gy IR或20μMVP16中，持续2小时。在指定时间释放后，将细胞以每毫升5×105的密度重悬于冰冷的PBS中，并以1:10（vol/vol）比结合熔融的低熔点琼脂糖。细胞 - 琼脂糖混合物被扩散到预热的彗星载玻片上，并保持在4°C，直到琼脂糖固化。然后将载玻片浸入裂解缓冲液（2.5 m NaCl，100 mM EDTA，10 mM Tris-HCl和1％Triton X-100）中，在4°C下过夜。将载玻片在新鲜制备的运行缓冲液（1毫米Na2Edta和300 mm NaOH）中孵育30分钟，然后在1.0 V cm -1的运行缓冲液中进行电泳30分钟。将载玻片在75％乙醇中洗涤两次，持续5分钟，并在37°C下干燥。然后将细胞用5μgml -1碘化丙啶在黑暗中染色30分钟，然后使用Olympus BX51荧光显微镜捕获图像。使用ImageJ中的OpenComet插件测量彗星尾矩；捕获并计数50个核或5个字段。

　　ELISA验证了针对H1（N76D/N77D），H1K75AC和H1的抗体的特异性（H1K75AC）和H1的三个位点（H1K75AC2ND）的特异性。将纯化的抗体在96孔板中孵育，并在50 ng的改性或阴性对照肽中孵育。然后用PBS将孔洗涤3次，并使用微滴定板读取器在450 nm下测量每个井的吸光度。

　　将从大肠杆菌纯化的10μMHis – H1.4或His – H1.4-KQ蛋白与10μLPBST结合缓冲液（含有0.05％Tween的PBS）混合。彻底混合后，除去10μl混合物并连续稀释双重。该稀释程序作为配体重复16次。将总共​​10μl的2 nm DNA-CY5与每个配体混合，然后将Monolith NT.115（Nanotemper Technologies）标准毛细管插入每个混合物中。MST设备是在将毛细血管放在样品托盘中1至16中的位置后启动的。通过绘制肽浓度针对液体诱导的荧光变化（Y轴上的原始荧光变化）来分析数据。使用MO进行曲线拟合。亲和力分析和给定的KD值以95％的置信度计算。

　　将野生型和CTPS1-KO HELA细胞或H1.4-KO HELA细胞系稳定地表达突变体H1.4（5×104），将其播种成35毫米玻璃玻璃盆中，并在37°C下在5％CO2下在37°C下在37°C下培养48 h。将细胞用10 Gy IR或20μMVP16处理2小时，然后在4％的4％组织固定溶液在4°C下固定至少30分钟，用PBS洗涤3次，然后在-20°C下用预冷的甲醇透明30分钟。用5％BSA在室温下阻塞1小时后，将细胞洗涤并在4°C下与所示抗体孵育过夜。用PBS洗涤3次后，将细胞与辅助抗体在室温下在Alexa Fluor 488或594中偶联1小时孵育。用PBST洗涤3次后，DAPI被用来染色核DNA。在尼康共聚焦显微镜下捕获免疫荧光图像。

　　纯化GST – P300 HAT并与乙酰化缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM NaCl，4 mm MGCL2、0.1 mM EDTA，1 mM DTT和10％甘油）中的底物孵育，带有或不带乙酰基-COA（5 mm），在30°C下为1 h乙酰-COA（5 mm）。通过添加5×蛋白样品缓冲液（250 mM Tris-HCl pH 6.8、10％SD，50％甘油，0.5％溴酚蓝和5％β-羟基乙醇）来停止反应，并将样品煮沸5分钟，然后通过SDS-PAGE-PAGE-PAGE-PAGE和IMMUNOMOBLOTTING分离。

　　从转染的HEK293T细胞中纯化了FLAG -CTPS1，他的H1.4或GST – H1.4从大肠杆菌细胞中纯化。将FLAG-CTPS1（8μM）在21°C下在含有20 mM Tris-HCl（pH 7.9）和10 mM MGCL2的反应缓冲液中孵育3分钟。然后将FLAG-CTPS1与预热（37°C）的核苷酸结合使用，最终浓度为2 mM UTP，2 mM ATP和0.2 mM GTP，持续30分钟。加入底物His -H1.4（2μM），并在37°C下再孵育45分钟以允许聚合。然后将样品进行2DGE和免疫印迹。

　　将HELA或HCT116细胞（7×104）接种到35毫米玻璃底盘中，并用MCHERRY-P300 HAT，GFP-CTPS1或GFP – PARP1转染48小时。用365 nm的脉冲氮紫外线激光（16 Hz脉冲，41％激光输出）在局部辐照细胞，该细胞由微点系统（Andor）产生。该系统直接与尼康A1共聚焦成像系统的落荧光路径耦合，并在指定的时间内每10 s捕获及时解密图像。使用ImageJ软件计算出来自指示单元的辐照路径信号的强度。

　　将野生型或CTPS1-KO HELA细胞（3×105）接种到35毫米玻璃底盘中，并用来自微点系统（Andor）产生的365 nm脉冲氮UV激光器（16 Hz脉冲，41％激光输出）局部辐照。在辐照后5分钟固定细胞在4％的4％组织固定溶液下至少30分钟，用PBS洗涤3次，然后在-20°C下用预冷冷的甲醇透化30分钟。在室温下用5％BSA阻塞1小时后，将细胞洗涤并在4°C下与抗H1（N76D/N77D），抗H1K75AC，抗H1K75AC2ND或抗-CTPS1和抗-CTPS1和抗I-γH2AX抗体一起在4°C共孵育过夜。用PBS洗涤3次后，将细胞与辅助抗体在黑暗中在室温下在室温下与Alexa Fluor 488或594偶联1小时孵育。用PBST洗涤3次后，DAPI被用来染色核DNA。在尼康共聚焦显微镜下捕获免疫荧光图像。

　　使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA。将悬浮液离心（13,000g持续5分钟），并使用异丙醇在4°C下以13,000g离心10分钟。用75％乙醇洗涤后，将RNA在37°C下用DNase I处理30分钟，以去除污染的DNA，然后根据制造商的说明，使用Quntercript RT Kit（Tiangen）将其反转录为cDNA。

　　在150毫米细胞培养皿上使用1％甲醛交联10分钟，并在室温下用125 mm的甘氨酸淬火2分钟，将U2OS-ASISI-ER-AID细胞（1.5×107）交联10分钟。收集细胞，用冷PBS洗涤两次，并重悬于免疫沉淀缓冲液中（150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mm EDTA，0.5％NP-40和1％Triton X-100），以进行超声片段化。在4°C下以12,000g离心10分钟后，将上清液与1μg正常兔IgG或抗H1或抗H1（N76D/N77D）抗体在原生A/G Sepharose珠上固定的C孵育。将珠子用免疫沉淀缓冲液洗涤五次，并与100μl的10％切尔克斯（Bio-Rad）混合。将样品煮沸10分钟，并收集上清液。将颗粒重悬于120μl的DDH2O中，并在4°C下以10,000g离心1分钟。上清液合并为IP DNA池。使用SYBR Green Supermix（Vazyme）在Qtower3G接触实时PCR检测系统（Analytik Jena）上使用SYBR Green Supermix（Vazyme）（Analytik Jena），将免疫沉淀DNA池和2％输入DNA用作QPCR分析的模板。一式三份分析所有样品。

　　1％的甲醛在150毫米细胞培养皿上在150毫米细胞培养皿上的U2OS-ASISI-ER-AID细胞（5×107）持续10分钟，并在室温下用125 mm甘氨酸淬灭2分钟。收集细胞，用冷PBS洗涤两次，并重悬于IP缓冲液（150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mm EDTA，0.5％NP-40和1％Triton X-100）中，以进行超声片段化。在4°C下以12,000g离心10分钟后，使用Re-Chip-It套件（53016，Active Motif）收集上清液进行芯片 - 重新芯片测定。1％的输入DNA作为对照存储。简而言之，将染色质与3μgH1.4抗体或正常兔IgG和25μl蛋白G珠一起在4°C下孵育。将珠子用芯片缓冲液1和芯片缓冲液2洗涤两次。在室温下，用100μLRe-Chip-It洗脱缓冲液洗脱了第一个芯片反应30分钟。然后用脱盐柱收集第一个芯片染色质，然后进行第二芯片（含有25μLLSV蛋白G珠，3μg抗H1（N76D/N77D），抗H1K75AC或抗H1K75AC或抗H1K75AC-2nd抗体或正常兔Igg）或正常的兔Igg）。将珠子用芯片缓冲液1和芯片缓冲液2洗涤两次，并在室温下用洗脱缓冲液AM2洗脱15分钟。然后将染色质交联并用蛋白酶K处理。芯片– RE-RE-CHIP DNA和输入DNA用作模板作为QPCR分析的模板，使用SYBR Green Supermix（Vazyme）在QTOWER3G触摸实时PCR检测系统（Analytik Jena）上。一式三份分析所有样品。

　　将265-U2OS细胞（7×104）接种到35毫米玻璃底盘中。在暴露于4OHT（500 nm）之前，将细胞用GFP载体，GFP -P300 HAT或GFP – CTPS1转染48小时，并屏蔽I（30 ng ml -1）持续6小时。然后将细胞与1 ml的4％组织固定溶液在4°C孵育至少30分钟，并用PBS洗涤3次。DAPI用于染色核DNA。在尼康共聚焦显微镜下捕获免疫荧光图像。

　　将PDR-GFP-U2OS（同源重组）或PEJ5-GFP-U2OS（NHEJ）细胞（7×104）接种到60毫米细胞培养皿中。将细胞用CTPS1，P300或对照siRNA转染12小时，然后用标记为Flag标记的野生型H1.4或2nd/2nr/2nr/2NA/KQ/KR突变体转染12小时。然后用表达I-SCEI的逆转录病毒再感染细胞，再感染48小时。胰蛋白酶吸引后，收集细胞进行流式细胞仪分析。

　　将H1.4-KO HELA细胞（7×104）接种到35毫米玻璃底盘中。将细胞暴露于10 Gy IR中，然后在4°C下至少30分钟与1 ml的4％组织固定溶液一起孵育。将细胞用PBS洗涤3次，然后在-20°C下用预冷的甲醇透化30分钟。用抗P300和抗H1.4或抗CTPS1和抗CTPS1用5％BSA洗涤并用5％BSA进行洗涤和阻塞1小时，并使用Duolink int situ int int sigma（Sigma）对细胞进行双染色。图像是在尼康共聚焦显微镜下捕获的，并使用ImageJ软件自动量化PLA焦点。

　　如先前所述63进行MNase分析。简而言之，将HeLa细胞（7×106）用VP16（40μM）处理1小时。离心后（1,500g持续5分钟）后，将细胞颗粒重悬于缓冲液A（10 mM HEPES pH 7.9，10 mm KCl，1.5 mm MGCL2，0.34 M蔗糖，10％蔗糖，10％甘油，10％MM DTT，1 mm DTT，1 mm DTT，0.1％Triton X-100 X-100 X-100和蛋白酶抑制剂Cocctail）。在冰上孵育8分钟后，将裂解液以13,000克离心3分钟，在4°C下离心3分钟。将沉淀进一步在缓冲液B（3毫米EDTA，0.2 mM EGTA，1 mM DTT和蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中裂解30分钟，然后在1,700g的冰中离心5分钟。将沉淀物重悬于MNase缓冲液（200 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM NaCl和25 mM CaCl2）中，用10 U MNase在25°C下持续1分钟，并通过添加0.5 m EDTA来停止反应。在冰上孵育10分钟后，加入RNase A和蛋白酶K。通过1.2％琼脂糖凝胶电泳分离DNA，并使用ImageJ分析每个车道的强度。

　　将HeLa细胞（7×106）用VP16（40μM）处理1小时，然后收集并重悬于500μl缓冲液A（20 mm HEPES pH 7.9、0.5 mm DTT，1 mm pmsf，1 mm PMSF，1.5 mm mgcl2和0.1％Triton）和0.1％Triton）中，含有1 m或指示浓度为NAC的浓度。然后将样品在100,000g（超速离心，贝克曼·库尔特）以超速离心20分钟，然后收集包含释放组蛋白的上清液以进行进一步分析。

　　进行了染色体中期扩散测定法以研究染色体异常。将细胞暴露于3 Gy IR，并在恢复2小时后收集和用秋水仙碱预处理8小时（0.4μgml -1）。暴露于含有56 mM KCL的低音溶液后，将细胞保存在3：1甲醇中：乙酸（v/v）溶液。然后将细胞滴入酒精清洁的载玻片上，并用GIEMSA染色。使用蜻蜓共聚焦成像系统（Andor）获得图像；在每个实验中随机选择并检查了100多个有丝分裂染色体。

　　IR或VP16处理1小时后，将等效数量的细胞（对照组N = 500；实验组N = 5,000）接种到60毫米细胞培养皿中，并在5％CO2下37°C培养2周。然后将细胞用1×晶体紫罗兰色染色，并计算含有50多个细胞的菌落。

　　Alphafold蛋白结构数据库（https://alphafold.ebi.ac.uk/）用于预测CTPS1的潜在结构（Uniprot P17812）。组蛋白H1.4或H1.4-2ND由Alphafold 2（https://colab.research.google.com/alphafold2.ipynb）预测。

　　p300 HAT的结构是从先前的Report64（https://www.rcsb.org）获得的。Gramm（https://gramm.compbio.ku.edu）和pymol用于与CTPS1的H1.4的结合口袋和热点氨基酸的虚拟验证，以及H1.4或H1.4或H1.4-2nd和P300 HAT。H1.4和接头DNA之间的结合结构是从先前的Report65（https://www.rcsb.org）中获得的。LYS75，ASN76和ASN77氨基酸根据报道的野生型结构通过Pymol突变。Pymol可视化H1.4或H1.4-QDD与接头DNA之间的结合。

　　野生型或CTPS1-KO HELA细胞，或H1.4突变的HELA细胞系具有FLAG – H1.4-RRR或FLAG-H1.4-RAA的稳定表达，在PBS中以2：1（v/v）的比率进行胰蛋白酶粉刺，计数和重悬于2：1（v/v）。然后将细胞（5×106中的100μl混合物中的5×106）皮下播种到4周大的雌性BALB/C裸鼠（Wuxi Apptec）中。将小鼠随机分为IR疗法和对照组（每组六只小鼠）。对于治疗组，肿瘤部位每3天暴露于3 Gy IR，每次治疗后都测量肿瘤大小。使用游标卡钳在指定的天数评估肿瘤体积，并使用公式：体积= 0.5×L×width2进行计算。三到四种治疗后，将小鼠安乐死（通过宫颈脱位），将肿瘤称重并储存在液氮中或固定在福尔马林中。从液氮中解冻样品，如上所述分离WCL或组蛋白。使用指定的抗体通过蛋白质印迹分析蛋白质样品。在这项研究中使用动物的使用已获得深圳大学DNA损伤反应早期阶段的机构动物护理和使用委员会的批准（染色质重塑的机制，202400110）。

　　将福尔马林固定，石蜡包裹的档案组织的切片（5μm）脱蜡，再水化并用蒸馏水冲洗。通过在压力锅中与1 mM EDTA缓冲液（pH 8.0）孵育10分钟，可以实现抗原检索。内源性过氧化物酶活性通过在甲醇中3％过氧化氢中孵育30分钟来阻断内源性过氧化物酶活性。然后，将切片在4°C下用抗CTPS1和KI-67的多克隆抗体（分别为1：100和1：500）染色16小时，并使用基准XL（Ventana Medical Systems）上的通用HRP多聚体试剂盒（Ventana Medical Systems）使用通用的HRP多聚体试剂盒进行色素发育。根据制造商的说明，使用TUNEL凋亡检测试剂盒（Yeasen）对福尔马林固定的石蜡包裹的组织切片进行染色。通过考虑染色强度和区域，使用ImageJ软件评估组织微阵列中的CTPS1表达水平。

　　从上海第一产妇和婴儿医院在被诊断并用放射性治疗的临床患者那里获得了总共33个成对的人宫颈肿瘤和para-tumour样品。从液氮中解冻样品。使用RIPA裂解缓冲液分离WCL，并在H2SO4中提取组蛋白。然后，使用指定的抗体通过蛋白质印迹分析蛋白质样品。Fudan University上海癌症中心提供了放射疗法之前的58个宫颈癌样品的组织微阵列芯片。通过免疫组织化学确定CTPS1表达水平。所有使用人类标本的研究均由深圳大学临床研究伦理委员会批准。患者提供了书面知情同意书，用于研究其切除的组织进行研究。用于胃和肺癌生存分析的数据是从KM绘图仪网站（https://www.kmplot.com/analisy/）获得的。

　　PTM BIO开发了抗H1（N76D/N77D），抗H1K75AC和抗H1K75AC2ND抗体。简而言之，设计并合成了抗H1的动物免疫（cydvekddsrik（n76d/n77d）； cagydve-（acetyl）k-nnsrik，用于抗H1K75ac； agydve-（acetyl）k-ddve-（acetyl）k-ddsyl）k-dddsrikc for anti-h15ac75ac75Ac2n5Ac2nd。设计并合成了未修饰的对照多肽，以纯化和检测目的（抗H1的cydveknnsrik（N76D/N77D）; cagydveknnsrik用于抗H1K75AC; agydve-; agydve-（acetyl）k-nnsrikc and agydvekdvekddsrikc752。将多肽与KLH结合以进行兔免疫。将免疫原用生理盐水稀释，然后与相应的佐剂混合1：1。将抗原和佐剂完全混合以形成稳定的乳液，然后注入六只健康的新西兰兔子。每只兔子被免疫四次。在第45天，收集了30毫升的全血和离心。离心后，通过ELISA和DOT印迹收集上清液进行血清筛选。纯化阳性血清样品。蛋白A柱被包装，并用10卷预冷的PBS缓冲液平衡。将过滤的样品加载到平衡的蛋白A柱上。用PBS缓冲液洗涤色谱柱，并用150毫米甘氨酸缓冲液洗脱。从蛋白质A纯化获得的粗igG上，将纯化加载到平衡的抗原多肽亲和色谱柱上，以特别丰富靶抗体。将上一步中获得的靶抗体加载到未修饰的亲和色谱柱上，以去除非特异性抗体成分。直接收集了废水。

　　GraphPad Prism 9.0.0用于数据分析。每组数据均经过Kolmogorov – Smirnov测试，Anderson -Darling测试，D'Agostino -Pearson Omnibus测试或Shapiro -Wilk -Wilk测试，以便在适用的情况下进行正态分布。除非在图中指出，否则使用学生的未配对两尾t检验来确定两个选定的正态分布数据组之间的重要性。p <0.05被认为具有统计学意义。对于损坏与未损坏的染色质特征比较，使用两个样本Wilcoxon检验确定了显着差异。使用Pearson R检验分析了蛋白质表达水平之间的相关性。通过对数秩（Mantel – Cox）测试分析总生存期。数据表示为均值±S.D.除非图中指出，否则对至少三个独立的生物学实验进行所有实验。根据以前的经验选择样本量，以确保足够的统计能力。对于动物研究，使用基于Web的工具（www.biomath.info）进行了功率分析。尽管在数据分析过程中掩盖了标签，但在实验过程中，体内实验并未蒙蔽。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。