全长野生型FLVCR1（人SLC49A1，NCBI参考序列NM_014053）和FLVCR2（人SLC49A2，NCBI参考序列NM_017791）的互补DNA被克隆到PCDNA5/FRT/frt/frt/frt/frt/frt/slc49a2（人类SLC49A2）中。两个FLVCR的基因通过C端标志融合标签进行了修饰。在补充表1和2中提供的序列数据中找到了更多详细信息。重组FLP-IN T-REX293-FLVCR1和FLP-IN T-REX293-FLVCR2细胞系通过使用Invitrogen的TetracyCline-abor-in-Rex293宿主Cell Line System使用TetracyCline-coble-clible-clible-clible-clible-clible-clible-clible-clibles-cliblecline-teracycline-clibles-complyclinecline-rapinclineclineclinclace诱导。Flp-In T-REx293 cells were cultured in high-glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; Sigma-Aldrich) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco), 1% Pen/Strep (Gibco), 1 μg ml−1 of Zeocin (Gibco) and 15 μg ml−1 of blasticidin S hydrochloride（Applichem）在37°C下在5％CO2的大气中。定期测试细胞对支原体污染阴性。为了稳定的整合，分别以1:13的质量比分别用FLP重物组合酶编码表达载体POG44（Invitrogen）共转染了PCDNA5/FRT-FLVCR1-FLAG和PCDNA5/FRT-FLVCR2-FLAG载体。所有转染程序均根据制造商的说明（Invitrogen）用Lipofectamine 2000试剂进行。为了选择稳定的克隆，将转染的细胞用含有100μgml -1湿霉素B（Applichem）的生长培养基培养。

　　HEK293细胞用PCDNA3.1质粒和人FLVCR1或FLVCR2和人胆碱激酶A（CHKA）进行胆碱转运测定法或乙醇胺激酶1（ETNK1），用于乙醇胺转运测定法，用于使用脂肪三抑素2000 Deogent（Invitrogen）。定期测试细胞对支原体污染阴性。转染后24小时后，将细胞与含有20μM[3H]胆碱或2.5μM[14C]乙醇胺的DMEM孵育。将细胞在37°C和5％CO2下孵育1小时，以吸收配体。随后，用冰冷的普通DMEM洗涤细胞，并在室温下摇动30分钟，然后用RIPA缓冲液（Thermo Scientific）裂解。通过闪烁式Tri-Carb（Perkin Elmer）对细胞裂解物进行定量。将来自细胞裂解物的放射性信号标准化为总蛋白质水平。对于剂量曲线测定，将指示的胆碱和乙醇胺浓度与细胞在37°C下孵育1小时。对于时间表测定，将细胞与20μM[3H]胆碱或2.5μM[14C]乙醇胺一起孵育。通过添加冰冷的普通DMEM，在指示的时间点停止了运输测定法。为了测试FLVCR1突变体的转运活性，使用了20μM[3H]胆碱和2.5μM[14C]乙醇胺。为了测试FLVCR2突变体的转运活性，使用了100μM[3H]胆碱和2.5μM[14C]乙醇胺。为了进行过表达FLVCR1或FLVCR2的HEK293细胞的转运测定，而无需与CHKA或ETNK1共表达20μM[3H]胆碱和2.5μM[14C]乙醇胺。

　　For transport assays under indicated pH conditions, the following buffers were used: pH 8.5 buffer (140 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8.5, 2 mM CaCl2, 1 g l−1 of -glucose), pH 6.5 buffer (140 mM NaCl, 20 mM MES pH 6.5, 2 mM CaCl2, 1 g l−1 of -glucose) or pH 7.5 buffer (140 mMNaCl，20 mM Hepes -NaOH，2 mM Cacl2，1 g l -1的 - 葡萄糖）。对于无钠缓冲液，使用了含有140 mM KCl，20 mM Hepes-KOH pH 7.5、2 mM CaCl2、1 g l-1的 - 葡萄糖的缓冲液。在这些测定中，使用了20μM[3H]胆碱或2.5μM[14C]乙醇胺，并在与配体孵育15分钟后停止测定。将来自细胞裂解物的放射性信号标准化为总蛋白质水平。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific）对总蛋白进行定量。

　　将HEK293细胞用盖玻片播种到24孔板上，并在补充10％胎牛血清和1％青霉素 - 链霉菌素的DMEM（Gibco）中维持。使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen），用flvCR1或FLVCR2用FLVCR1或FLVCR2共转染HEK293细胞。诱导的HEK293稳定的细胞系分别将过量产生的FLVCR1或FLVCR2播种到Millicell EZ载玻片八孔载玻片（Millipore）上。通过添加最终浓度为2μgml -1的强力霉素盐酸盐，在80％汇合处诱导稳定的细胞系。蛋白质过量生产进行24小时。对于透化和染色，将细胞用PBS两次洗涤，并在室温下以4％PFA固定15分钟，然后用PBS两次洗涤，并在PBST（PBS（具有0.5％Triton-X）的PBS（在室温下为0.5％Triton-X））进行透化15分钟。对于免疫荧光染色，随后将HEK293细胞用PBS洗涤，并在5％的正常山羊血清中封闭1小时，然后用FLVCR1和FLVCR2多酮抗体染色1：250稀释1小时，然后用Alexa Fluor 555（A-21428，Invitrigen）用ASS ANS ANTIB稀释1 h，然后用Alexa Fluor 555（Alexa Fluor 555（Alexa Fluor）释放。将细胞用DAPI（Thermo Scientific）对染色，并用激光共聚焦显微镜（Zeiss LSM710）成像。过量生产稳定的细胞用相同的方案处理，但用单克隆抗FLAG M2-FITC（F4049，Sigma-Aldrich）在室温下以10μgml-1的形式处理1小时，持续1小时，持续1小时，持续标签标签标签和Mitotracker RedCmxros（M7512，InvitRogen）定位。使用带有DAPI（P36966，Invitrogen）的延长钻石安装培养基安装细胞，并用激光共聚焦显微镜（共聚焦显微镜Leica Stellaris 5）成像。

　　为了生成用于FLVCR1和FLVCR2的突变质粒，使用了重叠的PCR方法。将FLVCR1或FLVCR2的突变cDNA克隆到PCDNA3.1中以进行过表达。突变通过Sanger测序验证。为了测试这些突变体的转运活性，将突变质粒与CHKA共转染进行胆碱转运测定法或ETNK1进行乙醇胺转运测定法。转移后24小时后，将细胞用DMEM洗涤，并与含有20μM[3H]胆碱或2.5μM[14C]乙醇胺的DMEM孵育，用于FLVCR1突变体，100μM[3H]胆碱或2.5μm[14C]乙醇胺[14C]乙醇胺用于FLVCR2突变剂。在37°C下孵育1小时后停止测定。将每个突变体的放射性信号标准化为总蛋白质水平。

　　为了检查出口功能，在没有与CHKA或ETNK1共转染的HEK293细胞中表达FLVCR1和FLVCR2质粒。然后将细胞与200μM[3H]胆碱或100μM[14C]乙醇胺一起孵育2小时，以用配体培养细胞。随后，将细胞洗涤以去除介质中留下的配体，并在37°C下与胆碱/乙醇胺无乙醇胺培养基孵育1小时，以释放预包装的配体。洗涤细胞并收集以定量放射性信号。与放射性配体孵育2小时后的样品被收集，以确定释放前放射性水平的水平并用于对照。

　　使用对照组（FLVCR1F/F和FLVCR1F/+-MX1-CRE）的成年肝（年龄3-6个月）和有条件的FLVCR1-KNOCKOUT（FLVCR1F/F-MX1-CRE）小鼠用于代谢组分分析。所有小鼠均保持在特定的无病原体条件下，并以12小时的深光周期自由获取食物和水。简而言之，将小鼠灌注PBS，以在器官收集之前去除血液。肝脏样品在由Mepabolon运送为代谢组学之前进行了快速冻干。代谢物的水平表示为相对量。根据协议编号2001-13对涉及小鼠的研究进行了审查和批准。

　　对于蛋白质的产生，将FLP-IN T-REX293-FLVCR1和FLP-IN T-REX293-FLVCR2细胞系在上述条件下含有100μgml-1的湿霉素B的生长培养基中培养在滚筒瓶中（Greiner Bio-One）。通过添加最终浓度为2μgml -1的强力霉素盐酸盐，在100％汇合处诱导了基因表达。72小时后，用Accutase溶液（Sigma-Aldrich）收集细胞，并将其储存在-80°C下直至进一步使用。将收获的细胞悬浮在含有25 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl和0.1 g ml-1的冷裂解缓冲液中船只（PARR仪器）。将细胞裂解物在4°C下以8,000克离心15分钟。随后，将低速上清液在4°C下以220,000克离心60分钟。重悬于整合的膜中，并将其存储在含有25 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl，10％甘油（V/V）和0.1 G ML-1的储存缓冲液中，Sigmafast EDTA无蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich）。

　　两个FLVCR的所有纯化步骤均在4°C下进行。用1％（w/v）Lauryl麦芽糖新烯基甘氨酸（LMNG; GlyCon Biochemicals）用温和搅拌1 h溶解了分离的膜。通过以220,000g的超速离心去除不溶性的膜馏分1小时。随后，将上清液与抗Flag M2亲和凝胶树脂（Millipore）孵育1小时。用含有50 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl和0.02％LMNG（w/v）的缓冲液预先校准树脂。使用20列的洗涤缓冲液（50 mm Tris pH 7.4、150 mm NaCl，5％（v/v）甘油和0.02％LMNG）进行洗涤步骤。将蛋白质从M2树脂中洗脱，其中10列体积的相同缓冲液补充了4 mM FLAG肽（Millipore）。将洗脱样品浓缩并进行超级螺旋200增加10/300柱（Cytiva），该柱与尺寸排除色谱缓冲液（50 mM Tris pH 7.4、150 mm NaCl和0.001％（W/V）LMNG）平衡。合并峰值分数，使用50 kDa截止浓度器（Millipore）浓缩至1.5 mg ml-1，并存储以进行进一步分析。

　　对亲和纯化的蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹。使用抗FLAG（F3165，Sigma-Aldrich）在1：1,000稀释时检测到FLAG标记的FLVCR1和FLVCR2。与碱性磷酸酶（A9316，Sigma-Aldrich）结合的抗小鼠IgG用作1：5,000稀释的二抗。通过多克隆FLVCR1和FLVCR2抗体在1：1,000稀释的内部升高，检测到天然FLVCR1和FLVCR2蛋白。GAPDH抗体（SC-32233，Santa Cruz）用作1：4,000稀释的装载对照。IRDYE 680LT（926-32212，LI-COR Biosciences）用作检测的二抗。

　　色氨酸荧光测量是使用Prometheus panta（纳米机技术）进行的。用含有50 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl和0.001％（w/v）LMNG至1μm的稀释缓冲液稀释纯化的蛋白质样品。通过含有4 mm化合物的稀释缓冲液中的连续稀释液制备具有不同浓度的胆碱或甜菜碱的缓冲液。将蛋白质样品与相等体积的稀释缓冲液或含化合物缓冲液混合，最终蛋白质浓度为0.5μm，然后在室温下孵育15分钟。根据Prometheus高敏毛细管（纳米磁化器技术），使用了10μl混合溶液。通过使用Python库（包括Pandas，Numpy，Scipy和Seaborn）在Visual Studio Code（Microsoft）中分析了记录的F350/F330。记录了三个技术重复以进行数据分析。用于数据分析的自定义Python代码可通过https://doi.org/10.5281/zenodo.10938397公开获得。

　　为了在不同的样本条件下收集FLVCR1和FLVCR2的冷冻EM数据，制备了FLVCR蛋白和推定的底物分子的不同组合。对于两种脱离的FLVCR样品，将蛋白质浓度调节至约1.5 mg ml-1，并进行凝固。对于补充胆碱的样品，将纯化的蛋白质调节至1.5 mg ml -1，并以1 mM的最终浓度加入胆碱。对于补充乙醇胺的FLVCR1样品，将纯化的蛋白质调节至1.5 mg ML -1，并以1 mM的最终浓度加入乙醇胺。样品在室温下孵育10分钟，然后再冻结。对所有样品施加了相同的暴跌条件：300元R1.2/1.3铜网格（Quantifoil）在氯仿中洗涤，然后在15 mA处用Pelco Easiglow设备发光90 s。使用Vitrobot Mark IV设备（Thermo Scientific）在液体乙烷中，在4°C下将4 µL样品施加到网格中，并在4°C下进行4 s，100％的相对湿度，并在液态乙烷中进行了标称的印迹力20。

　　对于每个冷冻EM样品，使用Titan Krios G3i或Krios G4显微镜（Thermo Scientific）以300 kV的方式记录了一个数据集以能量过滤的透射电子显微镜模式记录。用EPU软件3.0-3.4（Thermo Scientific）调整电子光对齐。使用EPU 3.0-3.4的自动化策略在电子计数模式下使用Gatan K3（安装在KRIOS G3I上）或FALCON4（安装在Krios G4上）直接电子检测器的自动化策略。对于Gatan K3检测器，使用了标称放大倍率为105,000，对应于校准的像素大小为0.837Å，并以大约15 e -pixel -1 s -1的电子通量记录了4 s的电子通量，将剂量分馏视频（80帧）记录为4 s，对应于总剂量，对应于80 e -e -a -a -2的总剂量。对于Falcon4检测器，使用了215,000的名义放大倍率，使用了对应于校准的像素大小为0.573Å的标称放大倍率，以电子事件代表形式记录了剂量分级的视频，以大约4 e-1 e-1 s-1的电子通量为5 s的电子通量，为5 s，对应于总剂量，对应于总剂量约50 e-a-2。图像记录在-1.1和-2.0 µm名义散焦之间。通过EPU V.3.0-3.4和CryoSparc Live（V.3.0和4.0）33监测数据收集质量。

　　对于每个获取的数据集，都应用了相同的冷冻EM图像处理方法：使用MotionCor2校正梁诱导的运动并生成剂量加权图像34。GCTF用于确定对比度传输函数（CTF）参数并执行校正步骤35。在此步骤中，除去了估计分辨率差（超过4Å）和严重的散光（超过400Å）的图像。粒子被黄玉选择，用于所有进一步的处理步骤36。使用Relion（v.3.1和4.0）或CryoSparc（v.3.0和4.0）进行二维分类，初始模型生成，三维（3D）分类，CTF细化，贝叶斯抛光，3D排序和最终地图重建。在数据处理管道中，在每个3D分类或所有结果类别的3D分类之后，进行了3​​D自动网络作业，以通过指标和视觉检查仔细评估所得的密度图以进行质量和分辨率。数据处理仅用于那些似乎有望进一步完善阶段的地图。在单个最终地图中生成了傅立叶壳相关（FSC）曲线和局部分辨率估计。显示了我们的处理工作流程和地图质量摘要的示意图和补充图。3–5。

　　FLVCR1和FLVCR2的第一个原子模型是在COOT（v0.8）中AS-分离态的相应的电子显微镜密度图中内置的（V.1.5和1.6）39,40,41，使用Alphafold预测的结构作为初始templates42。在手动主链跟踪和侧链的对接后，进行了近距离改进（V.1.18）43。如果需要，可以手动检查和纠正完善结果。这些模型被用作模板来构建所有随后的原子模型。最终模型通过phenix44中实现的霉菌验证。在近比（V.1.18）中进行地图对模型交叉验证。FSC0.5用作定义分辨率的截止值。在扩展数据表1中显示了有关冷冻EM数据收集，改进和验证统计的综合信息。使用Chimerax可视化了不同状态中两个FLVCR蛋白的最终模型，并用作分子动力学模拟的起始结构。

　　所有分子动力学模拟均使用GROMACS 2022.4（参考文献45）软件进行。将蛋白质结构嵌入具有75％教皇和25％POPG的脂质双层中，并用CHARMM-GUI46植入，并用150 mM NaCl溶解在TIP3P水中。CHARMM 36M力field47与改进的WYF参数用于阳离子-π相互作用，特别是胆碱和乙醇胺配体48。将系统最小化的最陡峭的步骤最小化，并在NVT集合中为250 ps的分子动力学平衡，在NPT集合中为1.625 ns平衡。在平衡期间，主链和侧链重原子中的4,000和2,000 kJ mol -1 nm -2的位置约束分别逐渐释放。最初用1,000 kJ mol-1 nm-2的力常数限制膜磷酸盐和脂质二氢的Z位，并在平衡过程中逐渐释放。在NPT平衡期间，1 FS的初始时间步长增加到2 fs。用粒子网ewald49处理远程静电相互作用，实际空间截止值为1.2 nm。Van-der-Waals相互作用被切断超过1.2 nm的距离。Lincs算法50用于限制涉及氢原子的键。在平衡过程中，使用1 ps的耦合常数与Berendsen Thermostat51保持310 K的恒定温度。用半偏性Berendsen Barostat建立了1 Bar的恒定压力，耦合常数为5 ps。在生产运行中，使用了Nosé -Hoover Thermostat52和Parrinello -Rahman Barostat53。

　　我们使用冷冻EM结构作为初始模型，用于模拟与胆碱和胆碱结合的flvcr1，As-异形和胆碱的内向flvcr2以及与外部脱落的flvcr2。我们使用PROPKA SERVER54设置了每个残基的质子化状态，如pH 7.0所预测的。通过将脱离的向外脱落的FLVCR2与胆碱固定的胆碱向内的FLVCR2对齐并在腔中保持胆碱，从而产生了胆碱向外的FLVCR2的初始结构。在胆碱输入模拟中，在溶液中使用380 mM胆碱使用AS溶解的结构。为了模拟乙醇胺结合的FLVCR1，该配体代替了冷冻EM结构腔内的胆碱。还进行了去质子化乙醇胺的模拟，并将结果包括在补充图2中。11和12。胆碱和乙醇胺释放模拟在配体从腔中退出后被中断，因此具有可变的持续时间。对于所有其他系统，每个副本均运行1 µs。补充表3（包含技术信息表）提供了本研究中所有模拟的摘要。在补充图11中显示了所有未包含的副本的时间分辨距离计算。将最小原子对距离计算为所有成对原子的最小距离，包括两个规定的基团（例如，配体和某些定义的侧链）。

　　使用Pymol55引入丙氨酸取代突变，并使用与相应的野生型模拟中应用的参数相同。在FLVCR1和FLVCR2中，分别在腔残基W125FLVCR1和W102FLVCR2中引入丙氨酸突变。

　　对于MM/PBSA计算，我们使用的GMX_MMPBSA56分别使用介电常数为7.0、80.0和4.0，分别用于膜，溶剂和蛋白质，以及0.0072 kcal mol -1 nm -2的默认表面张力。我们使用相互作用熵方法57估算了熵。通过丙氨酸扫描估算W125FLVCR1和W102FLVCR2对结合能的贡献。

　　视觉分子动力学58和MDANALYSSISS59分别用于可视化和分析轨迹。补充表4提供了对我们模拟的可靠性和可重复性的评估。

　　用摩尔v.2.5（参考文献60）映射隧道和空腔，其瓶颈半径为1.2Å，瓶颈公差3Å，原点半径5Å，表面半径10Å，探头半径5Å，内部阈值为1.1Å。

　　我们使用castp61计算出腔体的体积，其瓶颈半径为1.4Å。从FLVCR1模型中除去了残基297–320和512–516，以避免内部环之间的体积错误归类到空腔体积。类似地，残基272-296和487–502不包括在FLVCR2的腔体积计算中。

　　使用Clustal Omega62进行了来自Homo Sapiens，Felis Catus，Mus Musculus和Sus Scrofa的FLVCR1和FLVCR2的多个序列比对。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。