以12 h的光线周期保持在25°C的飞行量。补充表2中提供了蝇库的清单。在补充表3中给出了所有动物的所有动物的详细基因型。使用UAS/GAL4/Tubuling80TS进行温度敏感的敲低实验的交叉，将其保持在18°C，并转移至29°C至29°C以诱导转移元素表达。在35°C（对于ROK和KOI克隆）中，在热休克进行15-45分钟之前，将用于克隆诱导实验的杂交保持在18°C，或在第三型幼虫早期至中期，在33°C（所有其他克隆）在33°C（所有其他克隆）下进行15-25分钟。热休克后，将十字保持在25°C，以促进有效的基因表达。十字架以确定轻度NEJ或HDAC1敲低对使用ENG4的圆盘生长的影响，以降低RNAi效率并防止致死性。

　　除非另有说明，否则在第三级幼虫的机翼盘上进行免疫染色。幼虫在冰上的PBS中剖析，或在Epplant培养物中孵育（见下文）24，然后在4％甲醛（FA）和PBS中固定20分钟。随后的所有洗涤和孵化步骤均通过在摇摆平台上轻轻摇动尸体进行。将样品用含有0.3％Triton X-100（PBX）的PBS两次冲洗，然后在PBX中洗涤10分钟。在含有5％BSA（BBX）的PBX中，幼虫在与原代抗体和Alexa Fluor 488 phaloidin（Invitrogen，A12379）或Alexa Fluor 633 phitaloidin（Invitroloid，A22284）中孵育45分钟。在补充表4中提供了本研究中使用的一抗和二级抗体的列表。为了去除主要抗体，将样品用BBX冲洗两次，然后在BBX中进行60和30分钟的2个洗涤步骤。然后将样品在含有DAPI（2.5μgml -1; Applichem，A1001）的BBX中孵育，并在室温下在黑暗的室温下孵育。将机翼盘安装在安装培养基中（80％甘油，1×PBS和20 mm N-丙酸酯（Sigma-Aldrich，p3130））之前，将样品冲洗两次，然后用BBT洗涤30分钟30分钟。通过共聚焦显微镜（Leica SP8共聚焦显微镜）检测组织中的免疫荧光信号。总和强度投影是使用斐济产生的。

　　为了使翼盘取向在图面板中，旋转了一些圆盘图像。正方形的空无一量的空角上有固体黑色盒子，以提供更一致的面板布局。

　　所有量化均使用斐济进行。为了定量组蛋白乙酰化和总AC-K免疫信号，将积分强度归一化为相应的DAPI信号，并显示为边缘信号与机翼盘的中心的信号之比。边缘定义为从圆盘边缘开始并向内移动的10像素的区域。为了定量扩展数据中的H3K18AC图10a，B，确定前缘和后边缘的总强度，而不是RIM与中心信号的比率。为了定量TMRM信号，将集成的强度标准化为相应的MitoGFP信号，并显示为边缘与机翼盘中心的信号之比。边缘定义为从圆盘边缘开始并向内移动的13像素的区域。为了量化TUBK40AC免疫信号，为斐济的TUBK40AC和DAPI图像生成了总和投影，并用于测量集成强度。将TUBK40AC的强度标准化为相应的DAPI信号。为了定量鱼信号，斐济用于测量集成强度，将其标准化为相应的DAPI信号。为了结合生物学重复的数据，将每个重复的强度归一化为平均控制强度。比较同一机翼盘，GFP或IFP信号之间的前部和后隔室之间的强度或强度比（边缘与中心），以识别隔室边界。

　　为了定量核ACSS2，H3K18AC和H3免疫信号，使用DAPI信号来概述细胞核，并用斐济在该区域测量了平均核强度。此外，确定了每个核的最向外的部分与向外的组织表面，核表面与最接近线粒体的表面之间的距离。为了量化ACSS2过表达的椎间盘和对照盘中的核ACSS2免疫信号（图6C – F），将值进一步分为三个箱（<5 µm, 5–10 µm and >10 µm），并归一化为<5 µm bin的平均值。

　　给出单个数据点并显示为晶须图。通过Mann-Whitney检验（双面），通过Kruskal – Wallis测试通过Dunn的多重比较测试确定了显着性，通过双向ANOVA，以及šídák的多重比较测试或Wilcoxon签名的秩检验，如相应数字图例所示。Pearson相关系数用于确定数据的相关性。使用Rout确定异常值的存在。

　　使用Microsoft Excel（Mac的V.16）或GraphPad Prism（V.9）分析数据

　　将鱼类探针设计为涵盖所需基因转录物的200至450个核苷酸（有关使用的引物序列的补充表5，请参见补充表5）。根据制造商的协议，将T7启动子序列（CCGGTAATAATAATACGACTCACTATAGGGG）添加到反向引物的5'末端允许直接从PCR放大片段中转录。纯化RNA探针（RNA清理，Macherey-Nagel，740948），并在50％甲酰胺中储存在-20°C下，直到使用。

　　对于鱼，在PBS中剖析了第三龄幼虫，并在4％FA – PBS中固定30分钟。在含有0.1％Tween-20（PBT）的PBS中冲洗后，将幼虫洗涤两次，持续10分钟，在PBT中洗涤20分钟。将幼虫在含有50％甲醇的PBT中孵育5分钟，然后将其转移到甲醇中，其中可以在-20°C下储存几天。5分钟在含有50％甲醇的PBT中孵育后，在4％FA – PBT中再次固定幼虫20分钟。通过在PBT中进行三个洗涤（每5分钟）去除FA。将洗涤缓冲液改为杂交溶液（HS）（50％甲酰胺，5×SSC（0.75 m氯化钠和75 mM柠檬酸钠），50 µg ML – 1肝素和0.1％TWEEN-20），通过HS – Pbt稀释液的Serial洗涤步骤分别为5分钟。在HS中进行10分钟的洗涤，然后在65°C的HS中盖住2小时的HS，并补充了100 µg ML – 1鲑鱼精子DNA（Invitrogen，15632-011）。同时，将15 ng的鱼探针在100 µL阻止缓冲液中变性3分钟，在80°C下进行3分钟。在冰上5分钟后，将探针添加到样品中，并在65°C下孵育过夜。为了去除未结合的探针，将样品冲洗一次，并在HS中洗涤两次5分钟和15分钟。通过70/30、50/50和30/70（v/v）的HS – PBT稀释液在HS – PBT稀释液中，通过连续洗涤步骤将缓冲液改回PBT。随后，将幼虫冲洗并在PBT中洗涤3次，每次洗涤15分钟，然后在甲基酸缓冲液（1 m马来酸，1.5 m NaCl; pH 7.5）中封闭60分钟，并补充了0.5％（w/v）阻塞试剂的核酸杂交和检测试剂（Roche，110996176176176001）。将样品在4°C下孵育过夜，并在没有鱼类探针的情况下预先吸收（2-3 h与幼虫孵育）抗二高氧素的抗氧基素Fab片段与辣根过氧化物酶（Roche，11207733910）偶联。未结合的Fab碎片通过3个冲洗和PBT洗涤10分钟。在含有DAPI（2.5 µg ML – 1）的PBT中对核染色15分钟， 然后在PBT中洗涤10分钟。为了可视化鱼类探针的定位，根据制造商的协议，使用了TSA加荧光素试剂盒（Akoya Biosciences，NEL741001KT）。最后，将样品冲洗一次，并用PBT洗涤两次15分钟，然后将机翼圆盘安装在安装介质中。通过共聚焦显微镜（Leica SP8共聚焦显微镜）检测组织中的荧光信号。总和强度投影是使用斐济产生的。

　　为了使翼盘取向在图面板中，旋转了一些圆盘图像。正方形的空无一量的空角上有固体黑色盒子，以提供更一致的面板布局。

　　为了使用TMRM对MMP进行实时成像，在Explant培养基中解剖了由Tubuling4（TubG4）驱动的MitoGFP的第三级幼虫的机翼盘（见下文）24（见下文），并转移到含有与TMRM; Biomol，Biomol，Abd-22221和Abd-2221和ABD-2222的同一培养基中转移到一个含有相同的培养基中。药物处理的浓度和持续时间在相应的图例中指出。补充表6列出了本研究中使用的化合物。在黑暗中孵育后，将机翼盘安装在ePulant培养基中的幻灯片上，并使用左侧SP8共聚焦显微镜成像。

　　遗传编码的线粒体pH传感器SYPHER3S-DMITO15允许可视化线粒体pH，并用作MMP的指标，因为它是通过质子梯度建立的。SYPHER3S-DMITO基于过氧化氢传感器Hyper，由插入细菌过氧化氢传感器Oxyr的调节结构域的圆形置换的黄色荧光蛋白（YFP）组成，该突变具有对氢的传感器对氢的突变，但朝着PH25固定敏感。该传感器具有两个激发最大值，发射约405 nm是pH不敏感的，而488 nm左右的发射显示，随着pH的较高，发射的强度增加。

　　为了生成sypher3s-dmito转基因蝇，将传感器编码序列从哺乳动物表达载体（Addgene，108119）15转移到puast-attb vector26中，从而使转基因的位置定向插入液体插入到蝇基因组中，并在UAS/Gal4-Septers的控制下（参见UAS/GAL4-SEFTERS 5）（参见Nepentery Spection 5）。通过PHIC31介导的重组将转基因插入VK33对接位点。

　　为了使用SYPHER3S-DMITO对MMP进行实时成像，将表达在TUBG4控制的传感器的第三级幼虫的机翼盘在Explant培养基中解剖（见下文）24，并转移到包含相同培养基和指示抑制剂的外植体中。药物处理的浓度和持续时间在相应的图形传奇中指示，并在补充表6中提供了化合物列表。在黑暗中孵育后，将翼盘安装在PBS的幻灯片上，并使用Leica SP8共核显微镜进行成像。图像以比率构型为488 nm激发（pH敏感）与405 nm激发（pH不敏感）时的发射比。深色（蓝紫色）表示较低的pH值和较低的MMP，而更亮的颜色（黄白色）代表较高的pH值和更高的MMP。

　　使用Bodipy染色可视化机翼圆盘中的脂质液滴。为此，将来自第三龄幼虫的机翼盘在Epplant培养基中解剖（见下文）24，并转移到含有相同培养基的外植物室，这些室内含有相同的培养基（10μm； Sigma-Aldrich，790389）和Hoechst 33342（10μgMl-1; Sigma-1; Sigma-Aldrich，B2261）。在黑暗中孵育10或30分钟后，将幼虫用PBS冲洗一次，然后在4％FA中固定20分钟。在将机翼盘安装在安装培养基中（80％甘油，1×PBS，20 mm N-丙酸酯（Sigma-Aldrich，p3130））之前，将幼虫冲洗两次，然后用PBS洗涤2次10分钟。通过共聚焦显微镜（Leica SP8共聚焦显微镜）检测组织中的荧光信号。

　　为了使翼盘取向在图面板中，旋转了一些圆盘图像。正方形的空无一量的空拐角是带有固体黑色的底漆，以提供更一致的面板布局。

　　离体外植体培养物用于药物治疗以及翼盘的活染色。在epplant培养基（施耐德的果蝇培养基（Gibco，21720024）中剖析了第三龄幼虫，其中包含100 U ML – 1青霉素，100μgml-1链霉菌素（Gibco，15140122），1.6 Nm Juvenile hormone（Sigma-aldrich，3333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333334M）科学，LKT-E0813-M010），8.3 ng ML – 1腺苷脱氨酶（Roche，10102105001）和10 µg ML – 1胰岛素（Sigma-Aldrich I0516），我们以前显示了维持翼的差异和增强的，以使翼的差异和扩增。在植物室（小瓶中的网状篮子）中进行孵育，其中含有持续搅拌以进行氧合的植物培养基。药物处理的浓度和持续时间在相应的图传说中指示，补充表6提供了使用的化合物列表。

　　为了鉴定果蝇基因组中的Fabo依赖性H3K18AC峰，Cut＆Run20是在流浪的第三龄幼虫的机翼盘上进行的。剪切和运行是一种分析DNA - 蛋白质相互作用的方法，类似于ChIP – Seq。它基于由蛋白A组成的融合蛋白，能够结合原代抗体和微球菌核酸酶（MNase），该核酸酶（MNase）在结合位点上切断了GDNA。然后将这些产生的DNA片段分离并测序。

　　在这项研究中，应用了先前发表的果蝇优化的剪切和运行方案27（https://protocols.io/private/d6b0ad2dc1431a513994a2a05ac59cda）。简而言之，在存在或直接解剖的500 µm etomoxir的情况下，在存在或不存在500 µm etomoxir的情况下将徘徊的第三龄幼虫孵育2小时。然后，机翼盘被绑定到con菜蛋白A涂层的磁珠（Polysciences，86057-3），以防止在随后在磁架上的洗涤台上丢失盘。为了允许抗体结合（H3K18AC，1：500），用digitonin透化机翼盘。过夜孵育后，用蛋白A -MNase融合蛋白（细胞信号，40366）装饰结合的抗体。通过添加钙激活MNase诱导DNA消化。将样品补充酵母峰值DNA。使用Ampurexp珠（Agencourt，A63880）纯化释放的DNA片段。

　　使用KAPA Hyper Prep套件（Roche，7962312001）制备库，按照制造商的协议。在偏离协议时，kapa纯珠被ampurexp珠子代替。由于切割和运行中的样品输入较低，因此进行了适配器连接（TRUSEQ单索引DNA适配器（Illumina，20015960））进行3小时。根据先前发表的Menthod28改变了PCR方案，以缩短PCR周期（在60°C下为10 s），有利于在切割和运行过程中产生的短DNA片段的指数扩增。为了有效地从库中删除底漆峰，该协议中包括第二次放大后清理，如制造商所建议的那样。测序（125个核苷酸配对 - 末端读数，HISEQ2000，Illumina）由DKFZ基因组学和蛋白质组学核心功能进行。

　　Galaxy Server Platform29用于数据分析。使用装饰式的序列修剪适配器序列！（v.0.6.3）（https：//github.com/felixkrueger/trimgalore）在将读序列对准果蝇基因组（DM6）之前，Bowtie2（v.2.4.2）30,31。Bowtie2设置根据先前发布的方法28进行了调整，如下： - 本地 - 非常敏感的本地 - no-no-no-no-no-mixed-no-discordant -phred33 -i 10 -x 700。接下来，使用markdupicates（v.2.18.2.2.2）（htttpppppp：usiiial）删除读取重复项（使用MACS2 CallPeak（V.2.1.1.1.1.20160309.6）32,33进行峰值通话。最后，使用差异（V.2.10.0）34评估差异结合和主成分分析，通过根据处理对样品进行分组。使用Chipseeker（v.1.18.0）35用来自Ensembl（DM6，基因和基因预测）的基因组注释文件进行注释。使用在线工具http://www.webgestalt.org进行了基因本体学富集分析。

　　使用先前发表的System23生成表达突变组蛋白的飞行线。A. herzig编码组蛋白基因单元（HIS-GU）提供的网关克隆（Thermo Fisher Scientific）的入口向量被用作同时将H3K18和H4K8突变为H3R18和H4R8或H4Q18和H4Q8（请参阅补充表5）。将突变体HIS-GU的克隆分为三个入口向量（使用Xhoi和BSTBI），可以生成最终的目的地向量，该目的矢量包含三个通过Gateway Cloning突变的His-Gus。该目的地向量，根据参考优化。23，包含重组位点，允许PHIC31介导的插入蝇基因组。将转基因分别插入VK33和ZH86FB对接位点。随后，将两条转基因飞行线重新组合，在III染色体上产生6个HIS-GU的线，并越过组蛋白无效突变体背景（HISC）。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。