小鼠在12-12 h的浅色周期中被组成的小鼠，并随意进入饮食和水，室温保持在22°C左右，湿度保持在30-80％之间（不受控制）。将小鼠单一容纳进行食物摄入测量，并保持在30°C的热暴露实验。该研究使用了以下菌株的小鼠（至少6周）：野生型（WT）C57BL/6J（Jackson Stock，000664），B6.CG-GT（ROSA）26Sortm9（CAG-TDTOMATO）HZE/J（Jackson，jackson，007909，007909，007909，AI9），ai9，ai9），pirt-cre51，pirt-cre51，pirt-cre51，pirt-cre51，pirt-cre51，pirt-cre51，pirt-cre51。两种性别都用于解剖学研究研究，并将雄性小鼠用于体内功能实验。所有实验方案均由Scripps研究所机构动物护理委员会批准，并符合NIH的指南。

　　CAV2从CNRS矢量核心获得。Raavretro-Cre是从波士顿儿童医院和Janelia获得的。Php.s-cre，Php.s-dio-SFGFP（来自D. Gibbs的礼物）是从Janelia获得的。Php.s-tdtomato（Addgene，59462），Php.s-Mscarlet（Deisseroth实验室和内部克隆的礼物），root-cre（Addgene，51904），root-eyfp（内部克隆内部），php.s-s-mcherry-flex-flex-dta（Add-dta，addgens，585536），585536，MCRET-MSCR，MCCAR，MSCR，MSCR，MSCR，MSCR，MSCR，MSCR，MSCR，MSCR，MSCR，MSCR，MSCR，MSCR，-MSCR，MSCR，MSCR，MSCR，MSCR，MSCRENS，MSCR使用已发表的协议53在内部包装。内部生产的AAV被QPCR滴定，然后将其等分为6-10μL，并进行闪存以进行长期存储。

　　用于体内选择的质粒改编自之前的出版物54。RAAV-PUBC-SFGFP-CAP和AAV2/9-REP-AAP由Pubc-Mcherry-Rab（Addgene，115239），Pucmini-ICA​​P-PHP.S（Addgene，103006），Paav2/8（Addgene，112864）生成。鉴于DRG和IWAT的解剖学分离，未使用CIS-lox模块或转基因CRE系。根上皮库是通过使用Gibson Assembly在AAV9的588和589位置之间使用NNK变性引物（集成的DNA技术）插入随机七聚体来生成的，如先前所述54。

　　如先前所述53,54。简而言之，每150毫米板中只有10 ng的RAAV-PUBC-SFGFP-CAP库DNA DNA被转染在HEK293FT（Invitrogen R70007）细胞中，并在60小时后收集病毒以进行纯化。

　　将所得的AAV衣壳库双侧注入每个脂肪垫109个病毒基因组（VGS）的C57BL/6J雄性小鼠的IWAT中。使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen）注射两周后，从注射小鼠的T12 -L3 DRG中回收了RAAV基因组。将回收的病毒DNA放大了两轮，该片段包含含有Q5高效率聚合酶（新英格兰生物AB）的七聚体插入。在马萨诸塞州综合医院清理并处理放大产品以进行完整的扩增子测序。

　　NGS运行的RAW FASTQ文件与使用SamTools（v.1.10）之间的AAV9-Template DNA片段对齐，该片段的DNA片段包含氨基酸588和589之间的21 bp多元化区域。量化了所有21 bp序列在所有回收序列中均具有七聚体插入的丰度。

　　用异氟烷麻醉小鼠（诱导4％，维持1.5-2％），其皮肤在手术区域被剃光，头发用乙醇和碘去除并消毒。手术后，给小鼠皮下注射氟尼蛋白和局部抗生素软膏，以进行术后护理。

　　为了注入IWAT，在两侧的侧面皮肤上进行了横向切口。为了注入eWat，在下腹壁上进行了横向切口。为了注入IBAT，在壁间区域进行了中线切口。为了注入皮肤，进行了皮内注射。所有逆行跟踪都使用了带有31G（点型2点）针头的汉密尔顿注射器。在PBS中，总共4-5μl0.1％CTB-488或CTB-647（Invitrogen）注入了每个脂肪垫（IBAT2μL）或带8-15次注射的侧面皮肤，以扩散截然器。分别缝合腹壁和皮肤（用于iWat，ewat或ibat注射）。注射后3-5天采取组织，以使染料到达DRG SOMA。

　　如上所述进行注射。为了进行病毒比较研究（扩展数据图3A），Cav2-cre（每毫升4.2×1012个物理颗粒，5μl），php.s-cre（1.6×1013 VG每毫升，3μl），raavretro-cre（raavretro-cre）（9×1012 VGS per，5μl）与0.01％（9×1012 VGS）混合在一起（sig）（sig）（SIG）（sig）（sig）（sig）（sig）（sig）（s）单侧注射到AI9小鼠的IWAT中。将AAV9-TDTOMATO（每毫升2×1013 VGS，2μL）与0.01％快速果（Sigma-Aldrich）混合，并单侧注射到WT小鼠的IWAT中。

　　如上所述进行注射。为了进行根特征，将AAV9或根部 - 晶状体（每毫升4×1013 VGS，2μL）在0.001％F-68和0.01％快速蛋白的PBS中单独地施用到WT小鼠的IWAT中。第一次手术后两周，将4μl的0.1％CTB-647注入相同的IWAT脂肪垫中，并在第二次注射后3-5天进行组织进行定量。

　　6-OHDA先前已用于选择性交感神经去神经5,56。在使用前新鲜制备6- OHDA（TOCRIS）（盐水中12 mg ml-1，抗坏血酸（Sigma-Aldrich）的盐水为12 mg-Ml-1），在使用前新鲜制备，并保持在冰上并且没有光。将6-OHDA（8μL）注入每个IWAT脂肪垫中。使用0.02％抗坏血酸的盐水用作对照。注射后7-9天进行组织。

　　根据先前的报告57进行了抗原内部DRG注射。在背皮上进行了中线切口，以露出背部肌肉。沿着椎骨沿线的肌肉仔细分离以暴露DRG。暴露了T13和L1椎骨水平的DRG，AAV（在PBS中〜1×1013 VGS，每毫升为0.001％F-68和0.01％FastGreen）在神经节中注射（每次神经节的200 nl），使用nanoliter 2020 Indector（〜200 nl）使用nanoliter 2020 Indector（pulted Glass）。注意避免破坏周围的血管。背肌和皮肤分别缝合。Php.s-tdtomato或Php.s-Mscarlet用于顺行标记。

　　在PBS中有选择地烧毁IWAT引起的DRG，根或根-YFP（每毫升4×1013 VG，每毫升4×1013 VG，2μL），在0.001％F-68和0.01％FastGreen中注入了单方面或额外的fp.s-mcherry-flex-flex-dta（1×1013），并注入0.01％的快速速度。如上所述，被双侧注射到T13和L1 DRG中。提取组织，或在手术后3-4周进行生理测量。

　　如上所述，将AAV注入IWAT和DRG中，以实现CRE依赖的感觉消融。第一次注射后两到三周，再次将6-OHDA或盐水注入IWAT。第二次注射后7-9天提取组织。

　　为了可视化小鼠躯干和IWAT样品中的感觉神经，如前所述，使用杂化方法清除组织样品17。

　　用异氟烷和内部灌注冰冷的PBS和冰冷的4％PFA在PBS中用异氟烷终止麻醉小鼠，蔗糖（电子显微镜灌注固定剂，1224SK）。对于躯干样品，小心地去除皮肤，使IWAT连接到肌肉上，从中线切下脊髓，以促进清除和成像。将所有收集的样品在4％PFA的4°C中固定1-2天，然后在PBS中洗涤。将躯干样品在10％EDTA/15％咪唑（在4°C下持续7天）将其脱钙，然后在25％N，N，N，N'，N'tetrakis（2-羟基丙基）乙基二氨基氨基氨基氨基（Quadrol）（Quadrol）（Quadrol）（Quadrol）（在1×PBS中）（在1×PBS）（在37°°C中）。

　　将25％四氢呋喃（以1×PBS），100％二氯甲烷（DCM），100％DCM，100％DCM，100％DCM，100％DCM，95％，95％，95％，95％，80％，70％，70％和50％tortran占25％，二氢呋喃，依次洗涤躯干和IWAT样品。1×PBS洗涤任何剩余的有机溶剂。然后将样品在A1P4水凝胶中孵育（1％丙烯酰胺，0.125％BIS，4％PFA，0.025％VA-044引发剂（W/V）在4°C中在4°C中孵育，然后在氮气和聚合（37°C时4 H）中脱离。然后将样品从水凝胶中取出，并用20 mm Lioh-Boric Buffer pH 8.0被动清除，该pH 8.0在37°C下含有6％SDS，直到样品显得半透明。清除后，将样品在PBST（0.2％Triton X-100）中清洗，然后继续进行折射折配或免疫标记。

　　将IWAT样品与在室温下在PBST中稀释的一抗孵育。与一抗孵育后，将样品在PBST中洗涤，然后在室温下以PBST稀释的二抗孵育。在折射率匹配和安装之前，将样品在PBST中广泛洗涤。使用了以下抗体：抗蛋白酶1（细胞信号，9349，1：400），抗Th-647（Biolegend，818008，1：300）;抗UCP1（ABCAM，AB10983，1：200）;抗兔子488（杰克逊免疫研究711-546-152，1; 400）;抗兔子-647（杰克逊免疫研究711-606-152，1：400）。

　　清除或免疫标记的样品在EasyIndex（RI = 1.52，Life Canvas）中折射 - 折射率匹配，并安装在间隔（Sunjin Lab）中以进行共聚焦显微镜成像或以琼脂糖安装为浅层显微镜成像。

　　用异氟烷和心内灌注PBS和4％PFA，将小鼠终止麻醉。对于侧面皮肤样品，剃光皮肤，并使用Nair去除头发。

　　剖析感兴趣的神经节（DRG，SCHG和腹腔/肠系膜复合物），并将其安装在Rapiclear（Sunjin Lab）中，用硅胶间隔（Electron显微镜）进行共聚焦成像。剖析了侧面皮肤，在PFA中固定后固定，并在PBS中洗涤3次，然后使用0.25 mm Ispacers（Sunjin Lab）安装在Fluoromount-G（Invitrogen 00-4958-02）中进行共体成像。

　　解剖侧面皮肤，在PFA中固定后，在30％的蔗糖中脱水，然后将其嵌入OCT，然后切成25μm，并安装在涂有明胶的载玻片上。为了进行免疫荧光分析，将皮肤组织切片用0.3％Triton X-100的PBS中的5％正常驴血清阻塞。初级抗体是在相同的封闭溶液中制备的，并过夜孵育（抗βIII-微管蛋白（ABCAM，AB18207，1：1,000）。第二天，将切片用PBS洗涤，然后在PBS中洗涤2小时，然后在室温下与二次抗体（抗Rabbit-647，Jackson Immuno Research，Jackson Immuno Research，7111-111-60），并在室温下孵育2 hDAPI之前用延长的金抗固定式山植物（Invitrogen）进行共聚焦显微镜成像。

　　解剖了IWAT中注射CTB-647的小鼠的T12至L2 DRG，在PFA中进行了固定，在30％的蔗糖中脱水，然后在OCT中嵌入OCT，然后以20μm切除。DRG切片根据上述过程使用以下主要抗体进行染色：抗CGRP（Immunostar，24112，1：1,000），抗神经丝重多肽（ABCAM，ABCAM，AB4680，1：1,000）。二级抗体和染料包括抗Rabbit-594（杰克逊免疫研究，711-586-152，1：500），抗chicken-488（杰克逊免疫研究，703-546-155，1：500）和隔离蛋白B4 Alexafluor 488（生命技术），IS INLEXAFLUOR 488（LIFEL TEANCOLIES，IS I211111111111111111111111111111111114号）。

　　用异氟烷将小鼠终止麻醉。提取IWAT，EWAT和IBAT并在4％的PFA中提取并在4°C的4％PFA中固定。将组织用石蜡装饰，切成5μm，并安装在载玻片上。然后将切片用降血石和曙红在Sanford Burnham Prebys组织学核心上染色，并使用明亮的场显微镜成像。

　　使用以下一个目标之一，用奥林巴斯FV3000共聚焦显微镜成像固定的IWAT样品，全套神经节，染色的皮肤切片：×4/0.28 NA，空气（Xlfluor，Olympus）；×10/0.6 Na，浸入水（Xlumplanfi，Olympus）。使用Fluoview（V.2.4.1.198）获取图像。

　　使用1％琼脂糖/EasyIndex安装躯干或IWAT样品。安装的样品被成像，在装满EasyIndex的SmartSpim室内，并在顶部用矿物油密封。使用×3.6/0.2 Na物镜（LifeCanvas）获取图像，其1.79μm，1.79μm，4μmXYZ XYZ Voxel尺寸。图像采集沿着样品中的对称性中央平面完成了双侧照明。

　　使用Leica M165 FC立体显微镜和Flir BFS-U3-51S51S51M-C相机对新鲜固定的肝样品进行成像。使用SpinView（V.2.5.0.80）获取图像。

　　使用具有×40/0.6 Na物镜的钥匙BZ-X710显微镜成像用血久毒素和曙红染色的载玻片（CFI S Plan Fluor Elwd ADM，Nikon）。

　　在12:00至14:00之间剖析脂肪组织，并在液氮中闪烁。使用Trizol（Invitrogen）和Rneasy Mini Kits（Qiagen）从冷冻组织中提取总RNA。为了进行RT – QPCR分析，使用Maxima H减去第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对总RNA进行了反转录。使用CFX384实时PCR系统（Biorad）将所得的cDNA与引物（集成DNA技术）和Sygreen Blue Mix（Genesee Scientific，17-507）混合。使用TBP（编码TATA-box结合蛋白）mRNA作为参考基因，使用ΔΔCT方法计算归一化的mRNA表达。对ΔΔCT进行了统计分析。引物序列（分别为5'至3'）如下：TBP（CCTTGTACCCTTCACCAATGAC和ACAGCCAAGAGATCAGATTCACGGGA）；ucp1（aggcttccagtaccattaggt和ctgagtgaggcaaagctgattt）;Elovl3（ttctcacgcggggttaaaaaatgg和gagcaaCagatagacGacCac）;Cidea（Atcacaactggcctggttacg和tactacccggtgtccatttct）；FASN（ggaggtggtgtgatagccggtat和tgggtaatccatagagcccag）;ACACB（CGCTCACAACAGTAAGGTGG和GCTTGGCAGGGGAGTTCCTC）;chrebpβ（TCTGCAGATCGCGTGGAG和CTTGTCCCGGCATAGCAAC）。

　　RNA文库的准备和测序是在Scripps Genomics Core进行的。根据制造商的推荐方案，使用NEBNEXT超定向RNA库准备套件将总RNA样品用于RNA-Seq库中。简而言之，为每个样品选择了1μg总RNA，将其转换为双链cDNA，然后转换为分裂和测序适配器的连接。然后，使用条形码的PCR引物对8个循环进行PCR扩大，并使用Ampure XP珠纯化和尺寸选择，然后将100 bp的单阅读测序加载到Illumina NextSeq 2000。

　　将测序的读取与GRCM39参考基因组（Ensembl，V.104; http://uswest.ensembl.org/mus_musculus/info/index）保持一致，并使用鲑鱼（V.1.5.1）59对基因计数进行定量。DESEQ2（V.1.32.0）58进行了差异基因表达分析和P值计算。使用元体系59通过证据计数设置对基因优先级进行基因本体富集分析。

　　在冯·弗雷·钱伯斯（Von Frey Chambers）中，将小鼠适应1小时。使用上下方法60，用校准的von Frey丝（0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0和6.0 g）测量50％的机械阈值。

　　如前所述61，建立了两个温度选择测试设备。将车道均匀地分配在两个不同的温度板之间，设置为30°C和18°C，将单个小鼠放在其中一个泳道中。将小鼠在带有红外照明的黑暗房间中使用Ethovision Tracking System（Noldus Information Technology）进行10分钟以适应并进行跟踪1小时。分析了每个温度区域所花费的总时间。

　　使用热电偶直肠探针（世界精密仪器）测量核心温度。当处于热中性状态的小鼠移动到室温超过24小时时，室温核心体温被服用。

　　如前所述62，使用尾巴裁缝方法（kent Scientific）测量血压和心率。

　　将冷冻的IWAT组织以4倍的重量为0.1 mol l -1高氯酸裂解，离心并穿过30 kDa过滤管（Millipore）。使用电喷雾电离（ESI）在正模式下，在敏捷的6470三倍四极杆（QQQ）液相色谱 - 质谱（LC -MS）系统上分析了滤液。AJS ESI源参数设​​置为如下：将气体温度设置为250°C，气体流量为12​​ L min -1，并在25 P.S.I.设置为雾化器压力。将鞘温度温度设置为300°C，鞘气流设置为12 l min -1。毛细管电压设置为3,500V。在Agilent Eclipse Plus C18 LC柱（3.5μm，4.6×100 mm，959961-902）上进行了代谢物的分离。移动相如下：缓冲液A，具有0.1％甲酸的水；缓冲液B，乙腈，甲酸0.1％。LC梯度从0到2分钟开始为5％B。然后将梯度从2到23分钟线性增加到5％A/95％B。从23到28分钟，将梯度保持在5％A/95％B；从28到29分钟，梯度回到了5％B的起始浓度B。在整个运行过程中，流速保持在0.7 mL min -1。对去甲肾上腺素进行了多重反应监测，将M/z = 170.1的过渡作为前体离子到m/z = 152片段。停留时间为200，片段设置为60，碰撞能将设置为4，电池加速器电压设置为4。

　　在30°C的热屈服下，喂食高脂饮食（HFD）（D12492，研究饮食）的小鼠进行双侧感觉消融。HFD喂养是在手术后1个月开始的（大约11-12周大）。每周都要测量体重。在HFD上进行了空腹葡萄糖并在9周时进行葡萄糖耐量测试，并在HFD时在13周时测量血浆胰岛素。

　　在腹膜内注射葡萄糖（1 g kg -1）之前，将小鼠禁食4小时（08：30-12：30）。使用oneTouch Ultra 2血糖表在指示的时间点测量血糖水平。

　　禁食14小时后，将禁食的血液样品骨气回到光周期中。血浆在肝素处理的管（Microvette CB 300LH）中分离。用ELISA试剂盒（Crystal Chem，90080）测量血浆胰岛素，并使用Biotek Cytation 5读取器读取。

　　在含有停止蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，78430）和磷酸酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，78420）中提取全组织蛋白裂解物（G-Biosciences（G-Biososciences）（G-Biososciences）。使用二甲酸测定法（Pierce）确定蛋白质裂解物。将蛋白质裂解物在Laemmli缓冲液（Biorad）中变性，并通过4–12％迷你蛋白酶TGX SDS-PAGE（Biorad）解决，并转移到聚乙烯二氟乙烯膜膜上。将膜与在4°C的所有电脑阻塞缓冲液（Biorad）中稀释的一抗孵育过夜，然后与二级抗体抗兔HRP孵育（杰克逊免疫研究，711-036-152，1：10,000）或抗小组HRP（Jackson Immuno Research，Anbrouted inbroud inbrout in Brountion hrp（杰克逊免疫研究）温度。使用SuperSignal West Pico加化学发光底物（Invitrogen）可视化结果。以下抗体用于免疫印迹：抗P-HSL（Ser660）（细胞信号传导，45804，1：1,000），抗HSL（细胞信号，4107，1：1,000），抗α-微管蛋白（ABCAM，7291，1：10,000）。具体而言，在剥离P-HSL膜后，HSL被印迹。

　　使用ImageJ分析所有图像。Imaris呈现3D卷图像。

　　随机选择了40μm×40μm×40μm（X，Y，Z）的区域，并最大程度地投影在Z上，使用定制的ImageJ脚本在整个带有内部标记的IWAT带有TH染色的IWAT的堆栈中。仅保留含有TDTOMATO阳性（DRG）阳性的区域。TDTOMATO阳性纤维的厚度使用imagej直线函数在视图中的两个不同位置进行测量并平均。宽度小于2.5μm（任意切割）的纤维被认为是纤维纤维。如果TH-647通道表现出与TDTomato信号的重叠，则该视图被认为是正的。我们量化了来自3个生物学重复的13张图像，总共将包含TDTOMATO阳性薄纤维的77个视图定量以达到阳性。

　　随机选择了80μm×80μm×20μm（X，Y，Z）的区域，并使用Z上的自定义ImageJ脚本在侧面皮肤或IWAT中最大程度地投射，或者来自小鼠的IWAT中的IWAT中，收到了痛膜内的标签。使用ImageJ中的自动阈值自动分割包含神经纤维的区域。神经密度被计算为Areanerve/Areatotal。仅保留包含神经信号的视图进行定量。我们从3个生物学重复的39张图像中量化了466个视图，并从31张侧面皮肤复制中量化了468个图像，来自31张图像来自IWAT的2个生物学重复。

　　根据侧面皮肤横截面中跨基底膜的神经纤维数量确定具有针对βIII-微管蛋白的抗体的表皮内神经纤维的定量。评分是在所有图像上以盲目的方式进行的，并在注册到该状态的事后进行了评分。定量了4只小鼠（每组10-15个切片）的同侧和对侧侧面皮肤。

　　如上所述，DRG和SCHG是从注射AAV（根或AAV9）和CTB的小鼠中取的。T11 -L3 DRG和T12 SCHG被定量使用AAV和CTB标记的细胞数。在所有AAV标记的细胞中，在T13和L1 DRG中量化了AAV和CTB双阳性细胞的百分比，因为在T13和L1 DRGS上进行了治疗性手术，以进行后来的体内实验。

　　使用斐济的DRG全安装成像中的完整堆栈图像手动量化SOMA尺寸。我们注意到，将CTB注射到不同的荧光团（即CTB-488对CTB-647）中的CTB可能会导致标记为DRG神经元的SOMA直径分布略有差异；因此，当量化CTB标记的DRG soma尺寸时，我们只使用CTB-647。

　　对于肝荧光在根表征中的测定，以两个不同的暴露时间获得了相同的视图。使用较长暴露时间的图像用于确定组织的形状，并且使用较短的暴露时间的图像用于量化强度以避免过度饱和。在ImageJ中手动绘制了肝脏和背景的兴趣区域，肝荧光强度定义为平均强度 - 平均强度背景。

　　没有使用统计方法来计算样本量。样本量是根据先前的研究和文献使用类似的实验范例来确定的。除了手术后或实验期间患有恶化的健康问题的小鼠和通过组织学评估的病毒靶向遗漏的小鼠外，没有任何数据被排除在外。以盲目的方式收集数据，并在病变后注册到该条件并进行相应分析以防止任何偏见。

　　所有非RNA-seq分析均使用GraphPad Prism 9（v.9.3.1）进行指示的统计检验进行。进行了配对的两尾学生的T检验，以比较一种动物的同侧和对侧。单个动物的左侧或右侧被随机分配进行单方面治疗。将小鼠随机分配进行双边治疗。每个实验的样本量在图中报告。所有体内实验均至少两次，或从两个独立队列中分组得出相同的结论，除了在一个队列中进行了HFD处理。对于代表性图像，实验重复的数量如下：图2。1b – d（四），1E，G，H，J（三），2a – b，d（二），4A（四），4C，d（二）和扩展数据图。1A（三），1B（四），1C（二），2A（六），2F（三），2H – I，K（二），3a，d，e（3），3b（二），3b（二），4a，4a，h（二）;5b（二），7d（三），7E（两个）。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。