将ETR瞬时作为质粒DNA（在细胞系中）或mRNA（在细胞系，原代细胞和体内）递送。为此，将ETR克隆到包含：（i）上游CMV启动子的表达向量中；（ii）用于体外转录mRNA的上游T7启动子（IVT）；（iii）下游WPRE信号；（iv）3'-末端拉伸64种腺苷（64a）;（v）mRNA IVT的SPEI质粒线性化位点（扩展数据图1B）。先前描述了基于DCAS9的ETR的编码序列15。对于质粒介导的GRNA表达，将CRRNA序列克隆到先前描述的含有U6启动子的表达载体和葡萄球菌pyogenes cas9 trrna39的序列。针对小鼠PCSK9的CGI的GRNA使用Chop Chop40（https://chopchop.cbu.uib.no/）设计，并根据高模拟活动和特异性进行选择。ZFP和故事是由默克和Thermo Fisher Scientific设计和合成的，并将其亚克隆到哺乳动物表达质粒中，以代替DCAS9序列。根据制造商的说明，使用T7 Megascript套件（Thermo Fisher Scientific，AMB1334-5）生产mRNA。对于体外实验，通过IVT产生部分修饰的mRNA，包括以下对标准方案的修改：（i）在最终浓度为8 mm的最终浓度下，纳入抗反向盖帽模拟3´-O-ME-M7G（5'）PPP（5'）PPP（5'）G（NEB，M0251）；（ii）将GTP浓度从7.5降低至2.5毫米。对于体内实验，IVT产生了重大修饰的mRNA，包括对标准方案进行以下修改：（i）以4 mm的最终浓度纳入CleanCap-AG（Trilink Biotechnologies，N-7113）；（ii）用N1-met-ψ-尿苷（Trilink Biotechnologies，N-1081）取代UTP，最终浓度为7.5 mm。然后使用RNeasy Mini套件纯化mRNA（Qiagen，74134）。使用4200次贴台系统评估了mRNA的质量和完整性，并根据A先前描述的核苷酸模化方案41通过Axolab合成SGRNA。对于体外或体内研究，CAS9 mRNA分别如上所述或从Trilink Biotechnologies（L-7606）进行了体外转录。补充表6列出了本研究中使用的ETR和GRNA的序列。本研究中使用的质粒可在签署材料转移一致时使用。

　　Hepa 1-6 cells (CRL-1830, ATCC) were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Corning, 10-013-CV) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; EuroClone), 1% -glutamine (EuroClone, ECB3000D) and 1% penicillin–streptomycin (Euroclone, ECB3001D)在37°C下，在5％CO2加湿孵化器中。HEPA 1-6 PCSK9TDTOMATO细胞系是通过与：（i）含有2A-TDTOMATO-POLYA CASSETTE的HDR供体质粒在PCSK9的外显子12中，将含有2A-TDTOMATO-POLYA CASSETTE的HDR供体质粒产生：（i）HDR供体质粒：（i）HEPA 1-6 PCSK9TDTOMATO细胞系。（ii）cas9表达质粒；（iii）表达针对PCSK9最后一个外显子的GRNA的质粒（参考文献42）。TDTOMATO阳性细胞比单细胞水平分类并放大。HEPA 1-6 PCSK9TDTOMATO细胞系在签署材料转移一致时可用。来自C57BL/6雄鼠的原发性小鼠肝细胞是从Biopredic International购买的，作为胶原蛋白涂层的96孔板的粘附单层，并根据制造商的说明进行维护。在不同的时间点收集处理细胞和对照细胞的上清液，并在-20°C下作为一次性使用等分试样存储。

　　对于在HEPA 1-6 PCSK9TDTOMATO细胞中的体外实验，使用4D-核对象X系统（LONZA）在SF细胞系解决方案（Lonza，V4XC-2032）中，用RNA或质粒DNA转染3×105细胞，并使用CM-137脉冲程序转染。对于通过LNP A，B，C，D和E进行体外和体内实验，这些研究级试剂是通过将脂质混合物和RNA结合的精确纳米系统（PNI）制定的，后者溶解在PNI专有的pNI专有配方中。脂质混合物由溶解基于乙醇的溶液中的四种不同的成分制成：可离子脂质，辅助脂质，胆固醇和1,2-二酰酯-rac-rac-glycero-3-甲氧基乙二醇甘油（PEG-DMG）。辅助脂质的化学性质不同：（i）1,2-di-（9z-octadecenoyl）-Sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）用于LNP A；（ii）1,2-二十二烷酰基-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPC）用于LNP B；（iii）1,2-二倍氨酰SN-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）用于LNP C；（iv）1,2-Di-（9z-ottadecenoyl）-sn-甘油-3-磷酸蛋白（DOPC）用于LNPS D和E。可离子脂质以及四个组件的摩尔比是PNI的所有人信息。使用微流体墨盒（IGNITE NXGEN CARTRIDGE; PNI）将RNA和脂质混合到纳米Assemblr Ignite仪器（PNI）中，总流速（TFR）为12 ml min -1，流速比（FRR）为3：1（RNAS：LIPIDS）。在初始LNP筛选实验中，使用了氮与磷酸（NP）比为6和9，并且将其剩余的体内实验设置为6。使用代码IL00V77根据精密纳米系统（PNI）的要求提供脂质混合物LNP D。使用所需RNA配制的LNP D可以通过签署协议直接从PNI购买。估计的周转时间为1-2个月。或者，可以从PNI购买LNP D和配方设备。在这种情况下， PNI从技术上将在制定协议的设置中支持研究者。使用GenVoy-ILM试剂（NWW0042，25 mm）生产的LNP按照制造商的指示使用纳米和纳米Assemblr Ignite仪器（PNI）制定，并使用微流体墨盒（Ignite NXGEN Cartridge; PNI）。设置公式参数如下：（I）TFR为12 ml min -1;（ii）3：1的FRR；（iii）NP比为4。所有LNP均使用Amicon离心滤器（MWCO 30 kDa）浓缩，在1×PBS中以3：1稀释（PH7-7.3，MG2+/CA2+ - free）中的3：1稀释去除去乙醇，并通过0.22-syrice进行手动过滤乙醇。使用动态光散射（DLS）分析粒度及其多分散指数（PDI），并使用基于Ribogreen板的测定法确定RNA封装效率和浓度。补充表7报道了本研究中使用的LNP的DLS分析和RNA定量的结果。

　　使用CytoFlex S（Beckman Coulter）进行流式细胞仪，并使用FCS Express V.7（Denovo软件）分析原始数据，以提取PCSK9TDTOMATO-SENGATION-COLLED的百分比。当指示时，将TDTOMATO阳性或阴性细胞与Facsaria Fusion细胞分类器（BD Biosciences）分类为批量种群或单细胞水平。流式细胞仪和细胞分选程序的门控策略在补充图1中报道了。

　　使用rneasy mini套件（Qiagen，74134）从6×106 PCSK9中的细胞中提取总RNA，并使用Qubit 2.0氟化测定法（Thermo Fisher Scientific）进行定量。使用Nebnext Ultra RNA库预备套件制备未经体现的库，用于rRNA耗竭后的Illumina，并使用Illumina Novaseq 6000平台（Novaseq Control Software v.1.7）进行测序，以获得至少3000万个150bp-long-gong-long-gong-long-gong-long配对式读数。读取质量由FASTQC V.0.11.9（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）控制，低质量读取和适配器使用TRIM GALORE v.0.6.6.6.6.6.6.6.6.6.6.6.6.6.6.6.6.6 scome v.0.6.6.6。（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/）根据以下参数： - Quality 20，-length 25， - paired。使用Star v2.7.6a（参考文献43），将高质量的剩余读取与鼠标参考基因组GRCM38对齐。使用子阅读软件包v.2.0.1（参考文献44）和Gencode M25作为基因模型的fartialecounts函数对基因计数进行量化。使用R bioconductor package sva v.3.38.0（参考文献45）的combat_seq函数（参考文献45），由于存在不同的库制剂（如果存在）校正原始计数。使用R BioConductor套件DESEQ2 V.1.30.0（参考文献46）中实现的负二项式泛型对数线性模型估算读取分布。使用nbinomwaldtest函数测试了差异基因表达，并使用Benjamini -Hochberg方法校正P值。

　　使用Maxwell RSC培养的细胞提取套件（AS1620）从6×106 PCSK9TDTOMATO的细胞中提取基因组DNA，并使用Nanodrop 8000进行定量。使用Nebnext DNA Ultra IL reaumine nill sepeene sore n nebnext dna reaumine erse his 3.使用酶促方法来制备文库。每个样品至少生产25000万150亿美元的配对末端读数。读取质量由FASTQC V.0.11.9控制，并且使用Trim Galore v0.6.6删除适配器，并删除了适配器。在以下参数中： - 质量20， - 长度25， - paired， - clip_r2 5。使用bismark读取映射器甲基化呼叫者工具v.0.23.0分析了高质量的剩余读数。详细说明，使用Bismark V.0.23.0具有默认参数的读取与转换的基因组和未转换基因组（GRCM38）对齐。然后使用DEDUPLICATE_BISMARK脚本删除重复项，并使用bismark_methylation_extractor脚本获得甲基化状态。然后，将甲基化调用加载到R环境中，并使用R bioconductor封装甲基甲基v.1.16.1进行处理。使用FilterByCoverage函数（低计数过滤器等于1，高于99.9的高百分位）过滤导入的数据，并使用jurandizecoverage函数进行标准化。考虑到所有重复中涵盖的位置，使用Unite函数合并了来自不同样本的信息。用percmethylation函数计算甲基化百分比，并确定样品之间的相关性，以应用COR函数（默认的Pearson方法）。使用R Bioconductor套件BSSEQ V.1.26.0（参考文献47）和DSS v.2.44.0（参考文献48）进行差异甲基化分析。第一的， 该对象是使用MakeBsseqdata函数从Bismark输出开始创建的。DMLTEST函数用于标准化步骤和带有以下参数的差分分析：Smoothing = true and Smoothing.Span = 500。然后，应用CALLDML函数以确定差分甲基化基因座（DML）设置为阈值Delta = 0.4 = 0.4，P.Threshold = 0.4和P.Threshold = 1×10-3。为了排除与脱靶甲基无关的任何混杂DMR，将三角洲甲基化阈值设置为0.4；也就是说，最小值未在CAS9处理的细胞中调用任何DMR，这是一个没有直接甲基化活性的阴性对照。定义了DMR，以相同的阈值应用CallDRM函数。使用r bioconductor软件包Chippeakanno v.3.24.2（参考文献49）使用antotatePeakInbatch函数对确定的DMR进行注释，并使用Gencode M25注释和以下参数：PeakLocfordistance =“ Middle”，prainturolocfordistance =“ Middle”，farrelocfordistance =“ tss”，founcation =“ tss”，uptuct =“和多个”。所有处理过的样品的DMR均使用作为参考的相同模拟处理的控件进行计算。

　　八周大的C57BL/6N雌性小鼠购自查尔斯河实验室。涉及动物处理和护理的程序遵循了国家和国际法和政策，并得到了机构动物护理和使用委员会的批准（授权编号604/2020-PR和233/2022-PR，由意大利卫生部提供）。外壳温度和相对湿度分别为22°C（±2°C）和55％（±5％）。使用了12小时的–12小时光周期，并尽一切可能的努力最大程度地减少了所用小鼠的数量及其痛苦。对于体内给药Cas9或ETR，将mRNA-LNP溶液稀释在没有钙和镁的PBS中（Corning，21-031-CV）。随后，将小鼠随机分配到治疗组并用红外灯加热以获得血管舒张。最后，将250 µL的LNP溶液或PBS（此处定义为载体）静脉注射到尾静脉中。For plasma analyses (see next section), around 200 µl of blood was collected from the retro-orbital plexus of each experimental mouse by using a non-heparinized micro-haematocrit capillary tube (Kimble Chase, CSX40A502), and then moved into an EDTA-sprayed blood collection tube (Sarstedt, 20.1288.100).然后在室温下以2,000克离心血液10分钟。纯化的血浆最终从上清液中收集，并在-20°C下作为一次性使用等分试样存储。对于实验终止和器官的收集，通过CO2吸入和组织（肝脏，脾脏，肺和肾脏）对小鼠进行安乐死，并去除并进行快速冻干以进行进一步的分子分析。对于部分肝切除术，将小鼠用2％的异氟烷​​连续吸入进行麻醉。在肝切除术之前，将小鼠禁食4小时。根据希金斯方案50进行手术。简而言之，剃须腹部皮肤，并从Xyphoid开始进行2厘米的上线切口。打开腹膜后， 肝脏轻轻动员和暴露。抬起左侧叶，绑住并通过3.0丝缝线（Ethicon，eh6823h）绑在施加的连字符的距离。肌肉和皮肤分别分别为4.0 vicryl（Ethicon，V994H）和一个闭合封闭伤口的系统。对于术后镇痛，皮下注射到颈部脂肪垫中，使用了Carprofene（每公斤5毫克）。在肝切除术和尸检期间收集肝组织和血液，用于分子分析和PCSK9血浆定量。为了隔离肝细胞，首先用异氟烷对小鼠进行麻醉，并通过HBSS-Hepes 0.03％胶原酶IV（Sigma）暴露并灌注肝脏并灌注（每分钟32毫升）。收集消化的小鼠肝脏，通过100μm细胞过滤器（BD生物科学），并加工成单细胞悬浮液。在室温下以不同的速度（30g，25g和20g）的连续离心旋转，并连续离心3分钟，以获得肝细胞。

　　为了量化PCSK9，分别将处理的小鼠和上清液的血浆融化并稀释1：200和1：2。然后根据制造商的说明（R＆D Systems，MPC900）将稀释液装入商业预斑ELISA套件上。同样，使用吸收分析来量化LDL-C（P/N 00018256040，Werfen），Alt（P/N 00018257440，Werfen），AST（P/N 00018257540，pl/n 00018257440）的水平00 18250040），按照制造商的说明。

　　根据制造商的说明，使用Maxwell 48 Promega RSC组织DNA纯化试剂盒（AS1610）从Snap-Frozen组织（约30 mg）中提取基因组DNA。在指示的情况下，通过纯化的肝细胞来量化编辑和编辑效率（请参阅“小鼠处理和处理”）。在这些情况下，根据制造商的说明，使用1×106细胞从1×106细胞中提取基因组DNA（AS1610）。使用T7分析或靶向深测序对PCSK9基因座的基因编辑效率进行了定量。For the T7 assay, a 765-bp genomic region encompassing the CRISPR–Cas9 binding site was PCR-amplified using the primers listed in Supplementary Table 8. PCRs were then processed using the Alt-R Genome Editing Detection Kit (IDT, 1075932), run on the Agilent ScreenTape System, and the percentage of editing was quantified according to the manufacturer’s instructions.对于有针对性的深度测序，使用补充表8中列出的PCR9的启动子区域或EXON 1进行PCR扩大。然后使用Nebnext Ulta ultra II DNA库预备Kit用于PCSK9启动子的Illumina for PCSK9启动子或使用nebnext ultra dne库的iLlumina for pcsk9 expsk9 extksk9 excsk9 minsk9和mimnimine minsk9 minsk9 minsk9和mi。控制软件v.2.6）。用crispresso2 v.2.8（参考文献51）分析测序数据，以检测核苷酸插入和/或缺失。将读取与推定切割位点周围的边界序列（400 bp集中在SGRNA互补位点上，用于CAS9处理的样品的互补位置，或使用Bowtie2 v.2.2.2.5（参考文献.52,53）中的ZFP-8识别站点以EVOETR-8处理样品为中心的ZFP-8识别位置）。之后，原始FASTQ文件被子集，仅保留读取映射到感兴趣的区域 （https://sourceforge.net/projects/bbmap/）。用crispresso2在配对末端模式下分析其余的读取，设置三件软件v.0.39（参考文献54; http：//wwwww.usadellab.org/cms/cmms/?page = trimmamomation）以删除低 - 质量位置（得分<30）和illumina adapstorments（-trimina drim trammantics（-trimine trmminass） -- trimmomatic_options_string'Illuminaclip：truseq3-pe-2.fa：2：30：10 minlen：100'）。然后，使用Flash V.1.2.11（参考文献55）合并每个配对末端读数，以产生一个单一的重叠群，该重叠群映射到输入扩增子参考（启动子区域或第一个外显子），取决于实验）。提供了SGRNA互补位点和ZFP-8目标序列，以将分析集中在目标区域上，并将定量窗口设置为剪切位点周围（CAS9样品）或ZFP-8中心（EVOETR-8样品）周围的每侧20 bp。通过仅考虑插入和缺失的总读数计数来测量读数及其相对丰度来量化鉴定的等位基因。使用靶向的Bisulfite深序（靶向的BS-Seq）对PCSK9启动子或体外识别的DMR的CpG甲基化百分比进行了定量。具体而言，根据制造商的说明，将纯化的基因组DNA转换为Epictect Fast Bisulfite转换试剂盒（Qiagen，59104）。然后，使用补充表8中列出的引物对PCSK9和意外DMR的启动子区域进行了PCR扩增。对于PCSK9启动子，使用Nebnext Ulta Ulta DNA库预备套件为Illumina制备了库。对于其他DMR，使用了用于Illumina的NEBNEXT ULTRA II DNA库准备套件。使用配对端模式的Illumina Miseq平台对库进行测序（Miseq Control Software v.2.6）。读取质量由FASTQC V.0.11.9控制，并且使用Trim_galore v0.6.6删除了低质量的读取和适配器。具有以下参数： - 质量20， - 长度25， - paired，-rrbs。使用bismark读取映射器甲基化呼叫者工具V.0.23.0（参考文献56）分析了高质量的剩余读数。详细说明，使用Bismark_methylation_extractor脚本将读取与使用bismark的未转化和转换基因组（GRCM38）对齐。将甲基化调用加载到R环境中，并使用R Bioconductor封装甲基甲甲基v.1.16.1（参考文献57）进行处理。使用FilterByCoverage函数（低计数过滤器等于10，高于99.9的高百分位）过滤导入的数据，并使用jurandizecoverage函数进行标准化。考虑到至少一个条件重复的位置，使用UNITE函数合并了来自不同样品的数据。使用percmethylation函数计算每个CpG处的甲基化百分比。

　　使用GraphPad Prism V.9（GraphPad软件）绘制和分析数据。当图中指示时，通过使用GraphPad Prism v.9（GraphPad软件）评估统计显着性并应用所述测试。所有体外实验均以技术重复（n≥2）进行，并在各自的传说中指出了确切的重复数量。设计了体内实验，其中包括多只小鼠（n≥3）。图例中指出了任何实验组中任何实验组中处理的小鼠的确切数量。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。