为了在两个等位基因上产生具有内源标记的METTL17的稳定的哺乳动物细胞系，我们使用了以前在实验室中开发的基因组编辑平台，用于纯化人类的prebibosomes，称为Sneak PEEC（表面工程荧光辅助依从蛋白表位增强了蛋白质表位增强捕获）24。该系统使用指导RNA靶向的CAS9基因组裂解和框架内细胞表面表位表达，以允许通过荧光激活的细胞分选（FACS）鉴定双乳细编辑的克隆。维修模板质粒包含600 bp同源性臂，侧翼位于METTL17的最后一个外显子的Cas9切割位点，以及包含亲和力标签的框架内插入物（linker-twinstrep-twinstrep-flag-10xhis-tev-flag-10xhis-tev-spot-3c-3c-gfp）和两个工程的细胞表面coli coli coli（E.Btuf Vitimin b12 pote pote）ps ee e.和人类免疫缺陷病毒1（PDB：5O2U）的衣壳蛋白p24）由T2A位点48,49。

　　为了生成这些维修模板，将CAS9目标位点的同源臂和多个克隆位点克隆到PUC57骨架（Genscript）中。使用多个克隆位点中的Noti和Paci位点引入了整个插入序列，包括亲和力标签，T2A位点和表面显示表位。单引导RNA和链球菌CAS9的表达质粒（变体ESPCAS9（1.1））源自addgene质粒＃71814，这是F. Zhang50的礼物。使用CRISPOR.TELFOR.NET51设计了20 bp单引导RNA目标序列（5'GTTTCCTCCATCTCGGTC-3'，PAM：CGG），并使用BBSI位点克隆到该矢量中。

　　HEK293F细胞（R79007，Thermo Fisher Scientific）在24孔板（353047，Falcon）中生长在293自由泳293表达培养基（12338026，Thermo Fisher Scientific）中，并补充了2％热灭活的胎儿牛油（FBS）。未测试细胞系的支原体。使用1 µg总DNA（均为等摩尔浓度的CAS9/CAS9/单个指南RNA质粒）以大约90％的汇合使用Lipofectamine 2000（11668019，Thermo Fisher Scientific）在500 µL Opti-Mem Medic（31985070）中转染每个孔。转染十二小时后，将细胞洗涤并重悬于自由泳293表达培养基中，补充了2％的热灭活FBS。恢复后，将细胞扩展到六孔板（10062-892，VWR），并在14天的时间内通过。

　　为了制备用于流式细胞仪的细胞，通过温和的抽吸从六孔板中收集细胞，用0.1％BSA洗涤在1x PBS中，并在1x PBS中以0.1％BSA重悬于每毫升1-10×106个细胞的1x PBS中。接下来，将两个荧光标记的纳米酶标记为纳米词，它们特异性结合了在细胞表面表达的一个表位，以10 nm的浓度添加到细胞悬浮液中。标记反应在黑暗中在冰上进行30分钟，然后用1x PBS用0.1％BSA洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于200 µL的1x PBS中，用0.1％BSA重悬于细胞分类之前直接过滤，以去除细胞块（3522235，BD Falcon）。使用BD FACSARIA细胞分选蛋白（BD Biosciences）使用FACSDIVA软件（BD Biosciences）进行细胞分类。DAPI在分类前直接用来直接染色死细胞。在使用表达GFP或来自质粒的细胞表面表位的HEK293F细胞对实验细胞进行分类之前，直接进行了必要的单色补偿控制，包括GFP和每个标记的纳米身体。为了鉴定双乳细胞标记的METTL17细胞，首先对细胞进行分类以鉴定GFP阳性细胞，然后进行第二次选择，以分离BTUF和P24表面表位阳性的细胞隔离细胞。使用FlowJo（FlowJo，LLC）进行数据分析。

　　将单细胞克隆分类为96孔板，其中含有200 µL自由泳293个表达培养基（12338026，Thermo Fisher Scientific），并补充了2％的热灭活FBS。克隆扩张2周后，通过两个PCR筛选单个克隆以确认双重编辑。根据制造商的方案，使用Quickextract DNA提取溶液（QE09050，Lucigen）分离基因组DNA。在提取的溶液中，使用以下PCR引物使用每个PCR（50 µL最终反应量）使用30 µL：

　　对于反应1，向前：5'-TATGTGTTCACAGTGTCCCCATGAACTCCC-3'（Mettl17左同源性臂的上游基因组引物退火）；反向：5'-GACTCCGGGGCCAACTGTCTCAAGG-3'（BTUF表位特定）。

　　对于反应2，向前：5'-TATGTGTTCACAGTGTCCCCATGAACTCCCCC-3'（Mettl17左同源性臂的上游基因组引物退火）；反向：5'-TGCTGTCATCATTTCCTCGAGCGTAGCACC-3'（HIV P24表位特异性）。

　　随后在37°C的自由泳293表达培养基中以8％二氧化碳的80％湿度在37°C的自由泳293表达培养基中生长在双重标记的METTL17 HEK293F细胞中，在135 r.p.m摇动。

　　S. cerevisiae菌株BY4741（MATAHIS3ΔLEU2Δ0MET15Δ0URA3Δ0）用作构建内源标记菌株的起点。在YPG培养基（1％酵母提取物，2％肽和3％甘油）中，在30°C下有氧菌株在30°C下生长。从三个遗传修饰的BY4741菌株中纯化了酿酒酵母MTSSU的组装中间体：第一个含有3C可裂解的C末端GFP标记的MTG3（MATAHis3ΔLEU2Δ0MET15Δ0MET15Δ0URA3Δ0MTG3Δ0MTG3Δ0MTG3Δ0MTG3δ-linkER-3C-3C-3C-3C-3C-3C-GFP :: clnatat）protease-cleavable C-terminal mCherry-tagged CCM1 and a 3C cleavable C-terminal GFP-tagged MTG3 (MATa his3Δ leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 MTG3-linker-3c-GFP::ClonNat CCM1-linker-tev-mCherry::HphMX4), and the third strain containing a C-terminal在RSM22上（MATAHIS3ΔLEU2Δ0MET15Δ0URA3Δ0RSM22-linkER-TEV-ALFA TAG-3C-MCHERRY :: CLONNAT）上的Tandem 3C蛋白酶可裂解的MCHERRY和TEV可裂解的AlfA肽标签

　　为了比较野生型和PET127-KNOCKOUT（KO）背景中的Mitoribosomal复合物，从Horizo​​n Discovery的酵母基因敲除（MATAHIS3ΔLEU2Δ0MET15δ0ura3δ0ura3δ0PET127 :: kanmx6）中购买了PET127-KO菌株。对野生型和PET127-KO菌株进行了修改，以包含TEV蛋白酶可裂解的C末端GFP标记的US17M（MATAHIS3ΔLEU2Δ0MET15Δ0URA3Δ0US17M-linkER-linkEN-linkER-linkER-linkER-linkER-linkER-linkER-TEMEV-GFP ::::: hphmx4US17M-linker-TEV-GFP :: Clonat）。

　　所有菌株均通过应用标准基因组标记技术产生。用于酵母基因组标记的引物详细介绍：CCM1正向引物：AAAAGTCACACGCAAAGGCCCTGAAGTGGGAGGAGGAAGGAACAAGAACAACAACATAACATGACGACGCTGCCTGCAGGGGTCGACGACGGATCC;CCM1反向底漆：GagctttttttatttataCgcgctTatcatatAtatatAtatatAtatatGcatgCatgCatggGggCagaTggCagatccgcggcgcgcgcgcatagg。MTG3前底漆：TGGTTCAACACCTAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATCCCTATTGATTACTACCAATGATGGACGCTGCCTGCAGGGTCGACGGATCC;MTG3反向底漆：Tgaatatactttgtttgttccaccaacttttttttttatttacttacttacttacattcattcatattggcagatccgcgcgcgcgcgcgcatagg。RSM22正向底漆：AattgtccactttttcacggcagcagcacgattttttttaCaAcatgtaaAtaaAtagaAaaAaaAaAcgctgCtgCaggTCGACGGATCCC;RSM22反向底漆：caaactgtactatatatatatCatattCacgtatgTatgaAtaTaTaTaAtaAgtaggCagatCagatccgcgcgcgcgcgcgcatagg。US17M前向入门：AAAATTTGTTAAGAAAGCACGTCATGATGATGATGACAACAACAACCAAAGCCACAGCACGCTGCAGGCAGGGTCGACGGATCC;US17M反向底漆：TactatttacgtaacgagtcttgtgttgtataTattAttataTtaTtaTaTtaTaTtaggtgTagggCagatCagaTccgcgcgcgcgcgcgcgcatagg。

　　在YPG培养基（1％酵母提取物，2％肽和3％甘油）中，在30°C下有氧菌株在有氧菌株中生长，直到600 nm的光密度为1.5-2。将细胞以4,000克收获5分钟，用1 L冰冷的DDH2O洗涤一次，并用一量补充蛋白酶抑制剂（E64，pepstatin和pmsf）的DDH2O量等于细胞药丸的质量。最终的颗粒在液氮中闪烁，并且（如果用于复杂的纯化），则使用RETSCH行星球磨机PM100裂解。冷冻地面粉末存储在–80°C或立即使用。

　　在37°C的自由泳293表达培养基中以80％的湿度和8％的二氧化碳在37°C的自由泳293表达培养基中生长了双重标记的METTL17 HEK293F细胞，并在135 R.P.M上摇动。3.2 L的细胞生长至3.0×106个细胞，每毫升，并通过2,000g离心（JLA 8.100，Beckman Coulter）收获。将细胞在冰冷的1x PBS中洗涤，滴入液体N2中，并在-80°C下冷冻直至使用。使用Ref改编的协议完成了粗线粒体纯化。52。所有步骤均在4°C下使用预冷的缓冲液在冰上完成，并在4°C下完成所有离心步骤。将冷冻细胞重悬于冰冷的低音缓冲液中（20 mM HEPES-KOH pH 7.5、5 mM Kcl，1.5 mM MGCL2，并以1倍的蛋白酶抑制剂（E64，pepstatin和pmsf）的比例为1 ml G-1的冷冻材料。在将重悬悬在转移到Dounce均质器中之前，细胞膨胀了10分钟。然后通过15笔杵B裂解细胞。2.5倍MSH缓冲液（525 mM甘露醇，175 mM蔗糖，20 mm HEPES pH 7.5含1x蛋白酶抑制剂（E64，pepstatin和pmsf））添加至1x浓度。然后通过两轮离心液在1,300g的泥浆碎片中清除裂解液。然后，上清液以15,000克旋转15分钟（JA 25.50）至颗粒线粒体。用1倍MSH缓冲液洗涤粗线粒体，并在线粒体重悬浮缓冲液（25毫米Hepes-KOH pH 7.5，100 mm KCl，25 mm kCl，25 mm毫克（OAC）2和1％Triton X-100 v/v中，用1x蛋白酶抑制剂（E64，pepstat geroz pepstatin和pmsf）AT A at A at A at A at A at A at A a e64，e64材料。将线粒体在4°C的情况下裂解30分钟，并持续混合，并通过17,000g离心裂解20分钟（JA 25.50，Beckman Coulter）。在预衡的抗GFP珠（Chromotek）中，将30 µL添加到上清液中，并在4°C下以恒定混合而在4°C下孵育3小时。用线粒体重悬浮缓冲液洗涤两次珠，然后用洗涤缓冲液（25 mm Hepes-KOH pH 7.5，100 mm KCl和25 mm mg（OAC）2具有1x蛋白酶抑制剂（E64，pepstatin和pmsf））。然后将珠重悬于40 µL洗脱缓冲液中（25 mM HEPES-KOH pH 7.5，100 mM KCl，25 mm mg（OAC）2和0.005％C12E8），并通过在冰上1小时内添加3C蛋白酶。洗脱的配合物立即用于网格制备，并通过LC -MS或SDS -页区进行分析。

　　使用Vitrobot Mark IV机器人（FEI公司）以95％的湿度制备网格。在洗脱的复合溶液中，将3.5 µL施加到带有2 nm超薄碳（LFH7100AR35，电子显微镜科学）的层的发光量化量子Au R3.5/1上。在手动吸收多余的溶液之前，将网格在Vitrobot腔室内孵育2.5分钟。在新鲜样品中，然后重新涂3.5 µL，然后再孵育2.5分钟和手动印迹。最终的3.5 µL样品施用和2.5分钟的孵育完成，然后用斑点8，印迹时间为8，并浸入液态乙烷中。在具有能量滤波器（缝隙宽度为20 eV）的Titan Krios Electron显微镜（FEI）上成像网格，并在300 kV下运行的K3 Summit检测器（GATAN），名义放大倍率为×64,000。Serialem53用于收集总计37,047个显微照片的数据集，其散焦范围为-0.7至-1.8 µm，超分辨率像素大小为0.54Å。显微照片使用每秒28.5 e-的总剂量为2.1 s，总剂量为每秒28.5 e-，总剂量为51 e -2。使用多拍策略，每个孔收集了9个显微照片，并在每个阶段位置成像四个孔。第二个数据集使用不同的收集策略在不同孔的同一网格上收集了包括9,990个显微照片的数据集，其中使用相同的Decocus范围，电子剂量和框架计数在每个阶段位置成像9个孔。这些数据集在补充图中及以下的数据集1（37,047个显微照片）和数据集2（9,990个显微照片）。

　　除非指出，否则使用Relion 3.1.1（参考文献54）完成所有冷冻EM处理步骤，并在补充图2中进行了总结。3–18。对于每个数据集，使用MotionCor2实现在Relion55中校正了图像，加权剂量加权，对齐并归纳为1.08Å，并使用GCTF1.18（参考文献56）估算了显微照片Defocus。通过使用数据集1的2,597个显微照片的测试子集生成了一个用于3D分类的初始模型，如下所示：培训Crololo57并用于从这些显微照片中挑选533,056个颗粒，并以每Pixel（8×binning）以8.64Å的形式提取这些粒子。在2D分类（K = 100和T = 2）之后，保守选择了六个类，类似于成熟的MTSSU的不同视图，导致65,174个颗粒，这些颗粒以每位像素（4×Binning）的像素大小为4.32Å（4×Binning），从而以4.32的像素大小重新提取。这些粒子用于生成从头开始模型。该初始模型被用作3D分类的参考，其中2D分类的第二组333,265个颗粒的全局对齐，该粒子的保守程度较低，并以每个像素（2×binning）为单位为2.16Å。将两个占数据和268,009个颗粒的粒子组成的类别组合在一起，并将其组合为4.36Å。此重建被用作整个数据集分类的参考。

　　对每个数据集进行了冰冻的培训，并用于从所有显微照片中挑选粒子，导致数据集1的颗粒为7,597,700个颗粒，用于数据集2和1,511,635个数据集2。这些粒子以8.64Å以8.64Å的速度提取，每个像素（8×binning），每个数据集（8×binning），分别为四个粒径1颗粒，分别为四子集。To clean the particle stack, each subset, as well as all particles from dataset 2, were subjected to 2D classification (K = 100 and T = 2) followed by 3D classification with alignment (K = 5 and T = 4; 25 iterations with 7.5° angular sampling, 10 iterations with 3.7° angular sampling and 10 iterations with 1.8° angular sampling).将每个3D分类的良好类别组合在一起，并删除重复项，从而产生1,927,789个总粒子，每个数据集中的粒子具有不同的光学元组。与测试数据集相反，所选粒子仅占每个子集中的颗粒的40％。为了确保选择所有良好的颗粒，将最初未选择类的所有颗粒组合在一起，并以每个像素（4×binning）为4.32Å（4×binning），总计4,015,406个颗粒。将这些颗粒分成两个2,007,700个颗粒的子集，并进行第二轮的3D分类（k = 5和t = 4; t = 4; 25迭代，具有7.5°角采样，10个迭代，具有3.7°角采样和10次迭代和10次迭代，并带有1.8°角采样）。将良好的类别组合在一起，并取出重复项，从而导致1,183,364个颗粒，并将其与最初选择的1,927,789个颗粒合并。删除重复项后，将具有2,575,411个颗粒的最终粒子堆栈以每个像素（1×binning）为1.08Å重新提取，并进行了精制并进行贝叶斯抛光和对比度转移函数（CTF）的改进。随后的改进导致了2.45Å共有图。

　　为了确定共识图中存在的组成和构象异质性，使用了无比对的3D分类。初始尝试是没有掩模的，这导致了头部和身体域之间具有不同相对取向的类，反映了头部域的构象自由。但是，该策略对于区分数据的组成差异并不是最佳的，尤其是在身体，平台和头部区域中的组合差异。结果，在身体域周围用掩模进行了无对准的3D分类（k = 10和t = 30），这成功解决了存在的组成异质性。确定了四个类，代表了构图独特的组装中间体。在数据中，有10％（263,184个颗粒）代表H44流离失所的最早状态，NOA1和TFB1M的密度存在，并且平台的排序较低。我们表示数据中的这个中间状态A。19％（497,031个颗粒）代表下一个状态，其中H44存在，NOA1不存在，但是该平台仍在重塑，并且存在TFB1M，如StateA。在状态A中，我们表示该中间状态B.我们的中间状态B。数据（262,363个粒子）是10％（262,363个粒子）。我们表示数据中的这种中间状态C，27％（697,003个颗粒）代表不存在TFB1M的状态，并且平台井井有条。我们表示这个中间状态D。这些状态中的每一个都经过了另一轮CTF细化和贝叶斯抛光，并进行了精制并随后独立处理。

　　为了完全在结构上表征这些中间体，我们采用了一种策略，使用集中的分类和/或集中精炼来改善柔性区域的本地分辨率，例如由组装因子，头部和平台所占据的策略。特别是，正如其他核糖体SSU重建所示，头部域相对于人体结构域具有显着的构象自由度。对于每个状态，使用聚焦的细化来重新调整头部结构域上的颗粒，这揭示了由于存在组装因子Mettl17和MCAT而导致的rRNA重塑。所得的模块表现出额外的相对灵活性，进一步限制了这些区域的分辨率。为了解决这个问题，每个状态的头域都经过焦点3D分类，而无需对齐，以识别具有明确定义模块的粒子的子集，然后再针对分类和/或对单个模块的重点进行改进。对于状态C和D，此分类导致鉴定不存在MCAT的少量数据子集，并且H42以接近成熟的构象稳定（补充图6C和7D）。我们分别表示这些状态c*和状态E，并进一步独立处理这些粒子（补充图8和9）。我们建议状态C*代表次级途径的中间体，在该途径中，在TFB1M解离之前，MCAT解离发生（因此跳过状态D），而状态E代表直接在状态D和状态C*之后的中间体。使用溶剂扁平化进行了所有聚焦的精炼，报告的分辨率基于金标准FSC（傅立叶壳相关）-0.143标准，该标准是在Relion的后加工过程中计算得出的。在关联中计算了集合图的本地分辨率。

　　为了提供组装过程的完整视图，我们利用了人体和头部图的重叠来生成复合图和相应的模型，这些模型代表这些域之间主要的相对构象。拟合聚焦的地图并重新采样到Chimera58中的整体地图中，随后使用Phenix.combine_focused_maps59合并以创建复合图。也使用相同的步骤合并了每个集中精炼的半映射。然后将复合材料重新缩放到每个像素的校准像素尺寸为1.062Å，并计算出总体分辨率。CryoSparc60用于计算复合图的局部分辨率，并生成通过局部分辨率过滤的地图。远程3D-FSC处理服务器用于计算复合MAPS61的3D-FSC曲线。

　　对于人类状态，将包括所有核糖体蛋白和12S rRNA（PDB：6RW4）在内的起始模型被用作模型建筑的初始模板，该模型是通过将刚体对接成复合图。为了构建组装因子，将AlphaFold数据库（NOA1，METTL17，RBFA和ERAL1）以及现有X射线结构（MCAT（PDB：2C2N）和TFB1M（PDB：6AAX））中产生的同源模型的组合用作使用COOT62的手动调整之前的起始模型。RNA构象的变化通过COOT62中的手动细化考虑了每个状态。最后，使用phenix.Real_space_refine使用二级结构约束59，用近三个状态的整个模型在phenix中的三个循环进行调整。由于ERAL1 KH结构域的局部分辨率较低，因此在全部原子细化后，我们将链条的侧链缩小到Cβ。人类模型的模型改进统计数据可以在扩展数据表1中找到。

　　在Chimera58，Chimerax63和Pymol（Schrödinger，LLC）中可视化地图和模型。

　　使用Chimerax63生成数字。Pymol会议可为每个州单独和所有状态提供。

　　将冷冻酵母粉重悬于缓冲液A（25毫米Hepes-KOH pH 7.5、100 mm KCl，25 mm mgoac，0.1％Triton X-100、2 mm DTT，PMSF，Pepstatin和e64）中，并在4°C和40,000g的偏心上清除20分钟。将清除的裂解物与NHS-隔离珠（Cytiva）孵育，并在营养器上在4°C下4°C耦合3小时。通过在4°C的4°C离心1分钟，在127克以颗粒进行颗粒。在缓冲液中洗涤3次后，将配合物在缓冲液B（25 mm Hepes-KOH pH 7.5、100 mm KCl和25 mM MGOAC）中补充了TEV蛋白酶在4°C下持续1小时。

　　将冷冻酵母粉重悬于缓冲液A（25毫米Hepes-KOH pH 7.5、100 mm KCl，25 mm mgoac，0.1％Triton X-100、2 mm DTT，PMSF，Pepstatin和e64）中，并在4°C和40,000g的偏心上清除20分钟。将裂解的裂解物与抗GFP纳米珠（Chromotek）在营养器上4°C孵育3小时。通过在4°C的4°C离心1分钟，在127克以颗粒进行颗粒。在缓冲A中洗涤三次后，将复合物在缓冲液B（25 mm HEPES-KOH pH 7.5、100 mM KCl和25 mM MGOAC）中补充了3C蛋白酶在4°C下持续1小时。

　　将冷冻酵母粉重悬于缓冲液A（25毫米Hepes-KOH pH 7.5、100 mm KCl，25 mm mgoac，0.1％Triton X-100、2 mm DTT，PMSF，Pepstatin和e64）中，并在4°C和40,000g的偏心上清除20分钟。将清除的裂解物与NHS-隔离珠（Cytiva）孵育，并在营养器上在4°C下4°C耦合3小时。通过在4°C的4°C离心1分钟，在127克以颗粒进行颗粒。在缓冲液中洗涤3次后，将固定的复合物与3c蛋白酶在4°C一起孵育1小时。蛋白酶裂解后，将上清液应用于与抗alfa纳米机器化偶联并在缓冲液B中孵育的NHS-隔离珠（Cytiva）（25 mM Hepes-KOH pH 7.5、100 mm KCl和25 mm mgoac），在4°C处孵育1.5 h。随后将珠在缓冲液B中洗涤3次，并在同一缓冲液中洗脱，并补充了TEV蛋白酶。

　　将冷冻酵母粉重悬于缓冲液A（25毫米Hepes-KOH pH 7.5、100 mm KCl，25 mm mgoac，0.1％Triton X-100、2 mm DTT，PMSF，Pepstatin和e64）中，并在4°C和40,000g的偏心上清除20分钟。将裂解的裂解物与抗GFP纳米珠（Chromotek）在营养器上4°C孵育3小时。通过在4°C的4°C离心1分钟，在127克以颗粒进行颗粒。在缓冲液中洗涤3次后，将配合物在缓冲液B（25 mm Hepes-KOH pH 7.5、100 mm KCl和25 mM MGOAC）中补充了TEV蛋白酶在4°C下持续1小时。

　　使用Vitrobot Mark IV机器人（FEI公司）以100％的湿度制备网格。对于CCM1数据集，将3.5 µL洗脱的复合溶液应用于带有2 nm超薄碳层（LFH7100AR35，电子显微镜科学）的发光量化量子Au R3.5/1。将网格在玻璃体室内孵育1分钟，然后手动将多余的溶液印刷。在新鲜的样品中，然后重新涂3.5 µL，然后再孵育1分钟和手动印迹。在将CHAPSO添加到CMC（8毫米）之前，完成了最终的3.5 µL样品应用和1分钟的孵育。然后将网格印迹（8 s的斑点力量和打印时间为8 s），然后浸入液态乙烷中。

　　对于RSM22数据集，将3.5 µL洗脱的复合溶液应用于带有2-nm Ultrathin碳层（LFH7100AR35，Electron显微镜科学）的发光量化量子Au R3.5/1网格。在将CHAPSO添加到CMC（8毫米）之前，将网格在Vitrobot室内孵育2.5分钟。然后将网格印迹（斑点的8和3.5 s的印迹时间），然后浸入液态乙烷中。

　　在具有能量滤波器（缝隙宽度为20 eV）的Titan Krios Electron显微镜（FEI）上成像网格，并在300 kV下运行的K3 Summit检测器（GATAN），名义放大倍率为×64,000。SeriaLEM53用于收集两个数据集，总计31,995（CCM1）和14,111（RSM22）显微照片，散焦范围为-1至-2.5 µm，超分辨率像素大小为0.54。显微照片使用40帧，使用总剂量为每秒36 e -per像素（标本像素大小为每像素1.08Å），暴露时间为2 s，总剂量为61.73 e -2。每个数据集都使用了不同的多拍策略。对于CCM1数据集，使用了一个多拍策略，每个孔收集了9个显微照片，并在每个单阶段位置成像了9个孔。对于RSM22数据集，每个孔收集了十个显微照片，并在每个阶段位置成像四个孔。

　　除非指出，否则使用Relion 3.1.1（参考文献54）完成所有冷冻EM处理步骤，并在补充图2中进行了总结。21–25。对于每个数据集，使用MotionCor2实现在Relion55中校正了图像，加权剂量加权，对齐和归纳为1.08Å，并使用GCTF1.18（参考文献56）估算了显微照片Defocus。

　　对于与CCM1相关的MTSSU中间体，通过使用8,189个显微照片的测试子集产生了一个用于3D分类的初始模型，如下所示：Cryolo57经过训练，并用于从这些显微照片中挑选830,061个粒子，并以4.32Å的pixel（4×binnning）提取这些粒子。在两轮2D分类（K = 100和T = 2）之后，保守选择了四个类，类似于成熟的MTSSU的不同视图，导致23,206个粒子。这些颗粒在Cryosparc60中经过了两轮的缩短重建。在CryoSparc中的7,263个选定颗粒的细化允许从头开始生成初始模型。

　　冰冻训练并用于从所有显微照片中摘取颗粒，从而产生3,286,640个颗粒。将这些颗粒以每个像素（4×binning）为4.32Å提取，并分成5个子集，每个子​​集，每个子​​集中有357,328个颗粒。为了清洁粒子堆栈，将每个子集进行3D分类（k = 5和t = 4; 25迭代，具有7.5°角采样，10个具有3.7°角采样的迭代，并进行10次迭代，并具有1.8°角采样的迭代）。将每个3D分类中的良好类别组合在一起，并删除重复项，从而总计316,817个颗粒。将这些颗粒以每像素（1×binning）为1.08Å重新提取，并进行精制并进行贝叶斯抛光和CTF细化。随后的改进导致了3.13Å共有图。为了识别数据中的构象不同状态，在身体域周围用掩模进行了两轮3D分类（k = 3和t = 50）。确定了两个不同的类别，这些类别代表了构图独特的组装中间体。两种状态都包含与MTSSU装配因子CCM1结合的5'前体。19,730个颗粒代表了平台无序的最早状态和一组核糖体蛋白（我们称之为背包（BS1M，200M，MS23，MS23，MS37，MS42和MS43），它与15S RRNA的3'端结合。我们将此中间体称为状态1。54,519个粒子代表了后来的状态，在该状态中，平台有序良好，背包蛋白是绑定的。我们将该中间体表示为状态2。这些状态中的每一个都进行了完善并随后独立处理。

　　为了完全在结构上表征这些中间体，我们采用了一种策略，使用集中的分类和/或集中精炼来改善柔性区域的本地分辨率，例如由组装因子，头部和平台所占据的策略。使用溶剂扁平化进行了所有聚焦的改进，报告的决议基于金标准的FSC-0.143标准，如在后续过程中所计算的。重点地图的局部分辨率是在关联中计算的。

　　对于与RSM22相关的MTSSU中间体，使用3,982个显微照片的测试子集生成了3D分类的初始模型，如下所示：Crololo经过培训，并用于从这些显微照片中挑选出891,434个颗粒，并以4.32Å的pixel（4 r binnning）提取这些粒子。2D分类（K = 100和T = 2）后，选择了17个类，类似于成熟的MTSSU的不同视图，导致635,817个颗粒。这些粒子在CryoSparc中经过了从头算的重建，从而使初始模型产生。

　　对冰冻的训练并用于从所有显微照片中摘取颗粒，从而产生3,544,843个颗粒，每像素（8×binning）以8.64Å的含量提取。为了清洁粒子堆栈，所有颗粒均进行2D分类（K = 100和T = 2），然后进行3D分类（k = 5和t = 4; 20迭代，具有7.5°角采样，10个迭代，10次迭代，具有3.7°角采样和10次迭代，并具有1.8°°角采样）。该分类的良好类别结合起来，导致1,656,825个总颗粒。将这些颗粒以每像素（1×binning）为1.08Å重新提取，并进行精制并进行贝叶斯抛光和CTF细化。随后的细化导致了2.84Å的共识图。从共识图可以清楚地看出，该粒子子集的头部结构域具有相当大的灵活性。为了可视化该区域，在头域周围用掩码进行了无对准的3D分类（k = 3和t = 50）。从该状态组合了两个良好的类别，并进行了贝叶斯抛光，CTF细化和3D细化，从而获得2.65Å的地图。为了完全在结构上表征此中间体，我们使用了多体细化，并在头部和身体域周围使用口罩，从而产生了两个单独的地图。这改善了本地分辨率，最著名的是在头部域中。这些地图的分辨率基于金标准的FSC-0.143标准，如在依赖后处理期间所计算的。重点地图的局部分辨率是在关联中计算的。

　　我们利用体内的重叠和头部图来生成复合图和相应的模型，这些模型代表每个单个状态的这些域之间主要的相对构象。拟合聚焦的地图并重新采样到Chimera58中的整体地图，然后使用phenix.combine_focused_maps59合并以创建复合图。还使用相同的步骤合并了每个集中精炼或多体细化的半映射。然后将复合材料重新缩放至每个像素的校准像素尺寸为1.057Å，并计算了整体分辨率。CryoSparc用于计算复合图的局部分辨率，并生成通过局部分辨率过滤的地图。远程3D-FSC处理服务器用于计算复合MAPS61的3D-FSC曲线。

　　对于酵母状态，包括所有核糖体蛋白和15S rRNA（PDB：5MRC）在内的起始模型被用作模型构建的初始模板，该模型通过将刚体扩展到复合图中。为了构建组装因子，使用Alphafold64生成的RSM22和CCM1的同源模型被用作使用COOT62手动调整之前的启动模型。RNA构象的变化通过COOT62中的手动细化考虑了每个状态。最后，使用phenix.Real_space_refine使用二级结构约束59，用近三个状态的整个模型在phenix中的三个循环进行调整。由于状态1中RSM22的局部分辨率较低，因此我们将该蛋白的侧链修剪为全部原子细化后的Cβ，不包括对铁 - 硫簇协调必不可少的残基。酵母模型的模型完善统计数据可以在扩展数据表2中找到。

　　在Chimera58，Chimerax63和Pymol（Schrödinger，LLC）中可视化地图和模型。使用Chimerax63生成数字。Pymol会议可为每个州单独和所有状态提供。

　　通过在1 ml Trizol（Ambion）中珠子跳动后，从0.2 g冷冻酵母细胞中提取总细胞RNA。为了通过北印迹分析前RRNA加工状态，将3μg总细胞RNA加载到一个定性的1.2％甲醛 - 琼脂糖凝胶（Seakem le，lonza）中，并在75 V处分离3 h。跑步后，将分离的RNA转移到使用向下毛细管转移的阳离子尼龙膜（Zeta-Probe GT，Bio-Rad）上，并通过在254 nm处通过254 nm的紫外线辐照到膜上，总暴露于uv riflot，总暴露于紫外线分层的120 mJ cm-2，UVStratalinker 2400（Stateralinker 2400（Strate））。

　　在添加γ-32P末端的DNA寡核苷酸探针之前，将交联的膜与杂交缓冲液（750 mM NaCl，75 mM柠檬酸三钠，1％（w/v）SDS，10％（W/V）dextran sulfate和25％（V/V/V）孵育。将标记的杂交探针与膜首先在65°C下孵育1小时，然后在37-45°C下过夜。Blotted membranes were washed once with wash buffer 1 (300 mM NaCl, 30 mM trisodium citrate and 1% (w/v) SDS) and once with wash buffer 2 (30 mM NaCl, 3 mM trisodium citrate and 1% (w/v) SDS) for 30 min each at 45 °C, before the radioactive signal was read out by exposure of the washed membranes to a storage随后用台风9400可变模式成像仪（GE Healthcare）扫描的磷光屏幕。寡核苷酸探针序列如下：15S，GTTTACTACTACACACACACGGGGTATCG；5'前体，atttttttttttccttattata。

　　将纯化的核糖核蛋白样品干燥并溶解在8 m尿素，0.1 m碳酸氢铵和10 mM DTT中。还原后，在30 mM碘乙酰胺（Sigma）中将半胱氨酸烷基烷基化。在小于4 m的尿素中，用LYSC（内蛋白酶LYSC，WAKO化学物质）消化蛋白质，然后在小于2 m的尿素中胰蛋白酶（胰蛋白酶黄金，promega）。通过添加TFA停止消化，并使用Fusion Lumos（Thermo Scientific）对消化剂进行脱盐65，并通过反向相反的纳米LC-MS/MS进行分析。对数据进行量化并针对酿酒酵母或H. sapiens Uniprot蛋白数据库（2019）与MS2蛋白序列和常见污染相连。为了进行搜索和定量，使用了最大v2.0.3.0（参考文献66）。允许蛋氨酸和蛋白质N末端乙酰化的氧化，因为可变修饰和所有半胱氨酸被视为氨基甲基化。启用了“运行之间的匹配”选项，蛋白质和肽的错误发现率分别设置为1％和2％。

　　对于比较的MS，蛋白质丰度表示为无标记的定量值。使用Perseus（V1.6.10.50）67分析数据。简而言之，无标签的定量值进行log2转换，然后进行过滤，要求必须在所有三个重复中匹配蛋白质，至少要在一个条件下进行匹配。进行了双面学生的t检验，以确认数据的统计显着性。

　　所有MS数据均在补充数据1-5中可用。

　　为了确定线粒体翻译是否在METTL17 – GFP标记的细胞中损坏，野生型和Mettl17 – GFP HEK293F细胞颗粒被重悬于裂解缓冲液中（25 mm HEPES-KOH pH 7.5，100 mm kcl，25 mm kcl，25 mm mg（OAC）2和1％x-1％x-00 x 1％x100 x00 x 00 x 00 x 00，（e64，pepstatin和pmsf）），在4°C下溶解30分钟。在4°C下以17,000克清除裂解液，并在4°C下清除20分钟，并通过Bio-Rad蛋白质测定试剂盒确定总蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离等量的总蛋白（20μg），并转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后在室温下用5％脱脂牛奶在TBS-T中阻塞1小时。然后将膜与TBS-T中的一抗在室温下在TBS-T中与3％脱脂牛奶一起在以下稀释下孵育2小时：MT-CO1（克隆1d6e1a8，Cat。Pat。459600，Thermo Fisher Scientific），供1：1,000β-肌动蛋白（CAT。＃PA1-183，Thermo Fisher Scientific）为1：2,000。然后，将膜在TBS-T中洗涤3次，然后与相应的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗：HRP偶联的山羊抗兔IgG（Cat。＃111-035-003，Jackson Immunoresearch），HRP-ConJUGAUSE ANTANTIG-GOUSE ANTIBAUSE IG-GG（CATAT-35-CAT-cat-cat-cat-cat-cat-cat-cat）杰克逊免疫学）以3％的脱脂牛奶在TBS-T中稀释1：5,000。然后，在使用ECL Prime检测试剂（Amersham）在Typhoon 9400 Imager（GE）上成像之前，将膜在TBS-T中两次洗涤，然后在TBS中洗涤一次。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。