没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的。在实验和结果评估中，研究人员并未对分配视而不见。

　　类似木瓜蛋白酶的蛋白酶结构域序列是从SARS-COV-2完整基因组（NCBI基因组数据库，严重急性呼吸综合症冠状病毒2分离的Wuhan-Hu-1，完整基因组； NC_045512）获得的。来自SARS-COV-2（NSP3； YP_009725299.1）的COV2 PLPRO UBL结构域（氨基酸，746–1060）的蛋白序列已通过NCOI和nCOI和XHOI进行了合成，并将其克隆到PET28B中。还对SARS和MERS的PLPRO公共结构域（PDB ID：3MJ5和5W8U）的蛋白序列进行了优化，合成，合成并用NCOI和XHOI克隆到PET28B中，以添加C-terminal His标签（Genescript）。突变体是通过PCR产生的，并通过测序验证。对于哺乳动物的表达，将PLPROS克隆到PEGFP-C1中（Clontech）。为了产生矢量速度-ISG15，将合成cDNA用于鼠ISG15（残基1-155），并带有添加的N末端His6 TAG和HRV-3C蛋白酶（Gene先生）的识别位点。

　　BL21（DE3）大肠杆菌竞争细胞（NEB）用质粒转化，并在LB培养基中生长至37°C时的OD600，为0.6-0.8。通过添加0.5 mM异丙基 - 硫代乙型甲酰胺（IPTG）和1 mM氯化锌（ZNCL2）诱导蛋白质产生。在18°C下进一步生长过夜并收集。将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，10 mM咪唑，2 mM DTT，pH 8.5），并通过超声处理裂解，并以13,000 rpm离心，以阐明上级。将上清液与用裂解缓冲液进行预取平衡的Talon珠（Takara）2小时，并用洗涤清除非特异性蛋白质。用洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，250 mM咪唑，2 mM DTT，pH 8.5）洗脱蛋白质。将洗脱蛋白的缓冲液交换为存储缓冲液（20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，2 mM DTT，pH 8.5），并存储进行生化分析。为了结晶SCOV2-PLPRO（C111S），将细胞颗粒重悬于裂解缓冲液中（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，10 mM Imidazole，1 mM TCEP，pH 7.4），并通过超声处理并以13,000 rpm的速度裂解，以澄清以透明的速度。将上清液与用裂解缓冲液进行预取平衡的Talon珠（Takara）2小时，并用洗涤清除非特异性蛋白质。用洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，250 mM咪唑，1 mM TCEP，pH 7.4）洗脱蛋白质，并在尺寸 - 脱位柱（SuperDex 75 16/60，GE Healthcare，GE Healthcare）上进一步纯化，并用20 mm Tris-Hcl，100 mm nacl，1mm tce Ph7 ph7 ph7。将蛋白浓缩至20 mg ml -1并储存以结晶。对于小鼠ISG15的表达，用PACE-ISG15转化了BL21（DE3）大肠杆菌竞争细胞（NEB）。采摘单个细菌菌落并在5 mL Dyt培养基中转移，并以0.2％（w/v）葡萄糖和100μgml -1氨苄青霉素转移，并在37°C下生长过夜。将预制在3时离心3分钟，000G离心并重悬于5毫升新鲜培养基中。将两升Dyt培养基与5 mL的培养前培养物混合，并在37°C下生长，直到达到0.6的OD600。通过添加IPTG（最终浓度1 mm）诱导蛋白质表达。将细胞在28°C下生长20小时，并通过离心（10分钟，5,000g，4°C）收集。将五克大肠杆菌颗粒（ISG15或ISG15（C76S））解冻在冰上，并重悬于30 ml的缓冲液A-ISG15（50 mM Na2HPO4，500 mM NaCl NaCl pH 7.0，1500 mm NaCl pH 7.0，1蛋白酶抑制剂片（ROCHE））。使用法国压力机将细胞破坏，并将裂解液离心1小时40,000g和4°C。所有清洁步骤均在4°C下使用äkta色谱系统（GE Healthcare）进行。将上清液应用于15 mL Ni-FFS Sepharose色谱柱（GE Healthcare）。该色谱柱充满4列体积，为50 mm Na2HPO4、500 mM NaCl，15 mm咪唑pH 7.0，洗涤，蛋白质用线性咪唑梯度在20列体积上洗脱，最终咪唑浓度为500 mm（Buffer B-ISG15）。用1 mg His6-HRV-3C处理约30 mg洗脱蛋白，并在16°C下针对缓冲液A-ISG15透析16小时。然后将蛋白质应用于包含蛋白质的同一柱，浓缩到约6 mg ML-1，并用尺寸排斥柱（SuperDex 75 16/60，GE Healthcare）进一步纯化，并用20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，1 mm TCEP，1 mm TCEP，pH7.4。

　　用激活缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，10 mM DTT）稀释PLPRO蛋白（2μM终浓度），并在25°C下孵育10分钟。并在稀释缓冲液（50 mM Tris-HCl 7.5，150 mM NaCl）中稀释基于活性的探针（0.2 mg mL-1终浓度）。通过混合相同体积的活化的PLPRO蛋白（2μM）和活性探针（0.2 mg ML-1）来制备反应混合物。在指示的温度（在冰（0°C）或37°C上）进行反应，并在指定的时间点采集样品，并通过添加SDS样品缓冲液淬灭反应。通过SDS -PAGE进一步分析样品，并用银色染色套件（Thermo Fisher）染色。

　　为了确定酶动力学（KCAT和KM），将泛素– AMC或ISG15 – AMC用作PLPRO或鼠标USP18的底物，并通过384孔微磷酸读取物（Phass）（phlas）（360/487 Nm）（360/487 Nm）通过荧光增加（激发/排放，360/487 Nm）来测量AMC的释放。将含有不同浓度的K48-UB2-AMC（76-0μM）或ISG15-AMC（40–0μm）等分的FVIE微透明溶液等分为384孔板，并通过将5μLPLPRO或小鼠USP18（20 nm）添加到孔中启动反应。将AMC释放的初始速度归一化为标准曲线，并使用kCAT功能通过上述固定值的固定值，通过Michaelis -Menten酶动力学进一步分析速度与底物浓度图。实验至少重复3次。

　　用八面的系统（Fortebio）确定结合动力学。将1μm处的SCOV2-PLPRO（C111S）或SCOV-PLPRO（C111S）加载到Ni-NTA生物传感器上，并用结合缓冲液平衡基线。为了检查关联速率，将平衡的传感器转移到包含各种浓度的K48-UB2（90-0μm），人ISG15（3-0μM）或小鼠ISG15（90-0-0μm）的溶液中。通过将传感器放置在反应缓冲液中来启动PLPRO的解离。通过OCTAT数据分析软件（Fortebio）计算关联速率常数（KON），解离速率常数（KOFF）和解离常数（KD）值的值。

　　混合了等量的SCOV2-PLPRO（C111S）和全长鼠ISG15，最终浓度为250μm。在96孔板中用坐滴矩阵筛选蛋白质混合物在293 K处用100 NL蛋白质和100 NL的沉淀剂溶液筛选。从含有20％PEG 3350，200毫米硫氰酸钾的20％PEG的溶液中出现了初始晶体，含125μm蛋白质。为了优化结晶条件，我们稀释了蛋白质以改变浓度，并在含有18％PEG 3350、100 mM Bis-Tris丙烷pH 6.5，200 mm硫氰酸钾的优化溶液中生长衍射质量。

　　使用补充25％（v/v）乙烯甘油的母液溶液来保护晶体。在瑞士光源Villigen的X06SA光束线中，在100 K的氮气中，在100 K的氮流中收集衍射数据。使用XDS43处理初始数据集，并通过用SCOV2-PLPRO和小鼠ISG15在CCP4模块中的Phaser分子替换确定相位，作为模板Model44；PDB ID：6W9C和5TLA）。结构细化和手动模型构建使用Coot和Phenix.Refine45,46（扩展数据表1）。在受青睐的拉马坎德兰地块中分别有93.26％和6.74％的残留物，并且在不允许地区未发现残留物。

　　HELA或A549细胞用IFN-α（200 U ML-1）处理48小时，以诱导IsgyLation。用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCL（pH 8.0），150 mM NaCl，1％（V/V）NP-40）裂解细胞，并使用BCA测定法（Thermo Fisher）测量浓度。将十微克裂解物与100 nm的PLPRO孵育，以在37°C下为指示的时间点孵育，并通过用指示的抗体进行免疫印迹进行分析。为了测试GRL-0617的抑制作用，反应过程中包括40μMGRL-0617。使用图像实验室软件（Bio-Rad）获得图像。

　　所有描述的蛋白质都是人类起源。如先前所述47，纯化了CUL1 – RBX1，SKP1-β-TRCP2，UBE2M，UBE2D3，UBE2D3，NEDD8，UB，APPBP1 – UBA3和UBA1。如先前所述47，生成了neddydy的cul1 – rbx1。在37°C下以pH 8.8驱动30分钟的pH 8.8，并通过尺寸排除色谱纯化。USP2催化核通过镍亲和色谱法纯化，通过隔夜凝血蛋白的裂解释放了他的标签，然后进行离子交换和尺寸排斥色谱法。DEN1通过GST亲和力色谱法纯化，通过夜间TEV裂解从GST标签中纯化，然后进行离子交换和尺寸 - 排斥色谱法。如前所述48，COP9信号体（CSN）被纯化。用1μM超基的CUL1 – RBX1和5μM蛋白酶（SCOV-PLPRO，SCOV2-PLPRO，DEN1和USP2）或20 nm CSN进行固定化测定。在2 5mm Tris 100 mm NaCl，5 mM DTT pH 8.5的2 5mm Tris在37°C下进行反应，在CSN的情况下进行，并带有另外10 mM MGCL2。在每个指示的时间点取样，并用2×SDS -PAGE样品缓冲液淬火。Gels were stained by Coomassie blue and scanned on an Amersham imager 600. IκBα deubiquitylation assays were performed by first generating a ubiquitylated IκBα, with 200 nM UBA1, 1 μM UBE2D3, 20 μM UB, 500 nM neddylated CRL1–β-TRCP, and 5 μM fluorescently labelled IκBα at37°C 50毫米Tris，50mm NaCl，10mm MGCL2，5mm DTT pH 7.5持续30分钟。通过将80 mM EDTA加入5分钟来淬灭反应。通过将3μM蛋白酶（SCOV-PLPRO，SCOV2-PLPRO或USP2）与泛素化反应混合开始，并在每个时间点采集样品，并用2×SDS-PAGE-PAGE样品样品淬火。将凝胶扫描在Amersham Typhoon（GE）上，检测荧光标记为IκBα。

　　带有绑定的K48-UB2的SCOV-PLPRO的坐标取自PDB ID：5E6J49。对于双突变体设置，使用Modeller50引入了突变S67V和L76T。对于具有绑定的K48-UB2的SCOV2-PLPRO，我们设置了两个模型。我们合并了从PDB ID：5E6J获取的底物坐标与（1）未结合形式的X射线晶体结构（PDB ID：6W9C，由T. Croll（英国剑桥大学）重新审议（英国）（https://drive.google.com/drive/folders/1JBO50CDKBU7K1PFTHUQRZHQ-NCSIAWYG）和（2）具有SCOV2-PLPRO-MOUSESG15复合物的X射线晶体结构使用模构体替换三唑连接器。

　　SCOV-PLPRO-GRL-0617复合物的坐标取自PDB ID：3E9S18。氧化的Cys112使用模块更改为还原形式（SH）。SCOV2-PLPRO – GRL-0617复合物的仿真模型是根据SCOV2-PLPRO的未结合形式的X射线结构（PDB ID：6W9C，由T. croll重新预订）的。使用Pymol在PLPRO对准后根据PDB ID：3E9S对化合物GRL-0617的坐标进行建模。使用Modeller使用Modeller的SCOV-PLPRO X射线晶体结构（PDB ID：3E9S）18重塑了GRL-0617结合位点的封闭循环2（BL2环，GNYQCGH）。GRL-0617配体用一般琥珀色场（GAFF）52进行了参数化。

　　SCOV2-PLPRO-MOUSE ISG15复合物（PDB ID：6YVA）的X射线晶体结构是起点。根据X射线晶体结构（PDB ID：6W9C，由T. croll重新构建），对SCOV2-PLPRO和一个Zn离子的缺失残基进行了建模。

　　所有设置中的缺失侧链都是使用模块材料建模的。除PDB ID中的镍离子外，所有晶体学水分子和离子均保留。5E6J。根据PKA使用ProPKA和其他视觉检查的计算，在所有SCOV2-PLPRO（SCOV-PLPRO的HIS18）和SCOV2-PLPRO（SCOV-PLPRO的HIS273）的HIS17中，都收到了。我们不能排除SCOV2-PLPRO（SCOV-PLPRO的HIS273）催化HIS272的质子化状态在带电和中性形式之间处于平衡状态。所有其他残基都以其生理质子化状态模拟。将蛋白质用150 mM NaCl溶解在TIP4P-D Water53中。使用Gromacs 201854和Amber99SB*-ILDN-Q力场55,56,57,58进行了分子动力学模拟。每个系统的能量最小化，然后是五个平衡步骤，在该步骤中，我们逐渐削弱了重原子上的位置约束，首先是在NVT集合（0.25 ns）中，然后在NPT集合（4×0.5 ns）中使用Berendsen Thermostat和Barostat59。使用Nosé-Hoover Thermostat60,61和Parrinello-Rahman Barostat62，在310 K的温度下进行生产模拟，在NPT集合中进行1 bar的压力。我们设置了具有绑定底物的SCOV2-PLPRO系统的三个独立运行，从SCOV2-PLPRO的APO样模型：K48-UB2和SCOV2-PLPRO-MOUSE ISG15 COMPLECT的不同模型开始。对于具有绑定底物和结合抑制剂的模拟，我们监视了每个骨架底物的根平方偏差（R.M.S.D.）（k48-ub2中的远端泛素远端泛素和小鼠ISG15的N端结构域）和GRL-0617（重原子）的平衡结构，以使其平衡的结构在辅助范围内，以均衡。领域）。从SCOV-PLPRO – K48-UB2的模拟中，我们提取了SARS F70和ubiquitin的F70之间的最小重原子距离。

　　对于抑制剂的IC50值，将泛素– AMC或ISG15-AMC用作PLPRO的底物，并且通过在384-Well Microplate读取器上（pherastar fsx，pherastar fsx，bmg lab）上的荧光增加（激发/发射，360/487 nm）来测量AMC的释放。将含有不同浓度的GRL-0617（200-0μM）和10μM的泛素– AMC或ISG15-AMC等分的五个微透明溶液排成384孔板，并通过将5μLPLPRO（30 nm）添加到孔中引发反应。将AMC释放的初始速度用于DMSO对照。IC50值是通过使用[抑制剂]与归一化响应方程的GraphPad Prism中剂量 - 反应抑制作用函数计算得出的。实验重复了三次。

　　为了进行相互作用分析，将A549细胞用野生型或突变体（C111S）SCOV-PLPRO或SCOV2-PLPRO转染，并将两种蛋白的SARS-COV和SARS-COV和SARS-COV（C111S）版本之间进行比较。用IFN-α（200 U ML-1）刺激细胞36小时，以模仿感染情况。将细胞在冰冷的裂解缓冲液中裂解（50 mM Tris-Cl，pH 7.5; 150 mM NaCl; 1％Triton X-100），并将等量的裂解物与IP缓冲液中的GFP纳米型珠（Lysy Buffer无需洗涤剂）中孵育。孵育后，用洗涤缓冲液（50 mm Tris-HCl，PH7.5; 400 mM NaCl; 0.5 mm EDTA）和两次用IP缓冲液洗涤免疫沉淀物3次。然后，将珠子与25μl的50 mM Tris-HCl（pH 8.5）孵育，其中含有4 m尿素，1 mM TCEP，4 mM氯乙酰酰胺在37°C的黑暗中孵育1小时。之后，将样品用50 mM Tris-HCl pH 8.5稀释至最终的尿素浓度<2 m，并在37°C下用0.5μg胰蛋白酶（Promega）消化过夜。使用三氟乙酸酸化消化为2-3的pH，并使用C18阶段的TISP63脱盐。如前所述64，用串联质量标签（TMT）试剂（TMT）试剂（Thermo Fisher）标记肽。简而言之，将肽重悬于TMT标记缓冲液（0.2 M EPPS pH 8.2，20％乙腈）中，并将其与TMT试剂（2：1 TMT：肽比率）混合。在室温下进行反应一小时，然后通过在室温下将羟胺添加到最终浓度为0.5％，持续15分钟。将样品以等摩尔比，使用C18阶段的尖端进行酸化并再次清理。干燥后，将肽重悬于0.1％甲酸中以进行液相色谱 - 质谱法。所有质谱数据均以质谱模式在Orbitrap Fusion Lumos质谱仪上以纳米反射离子源（Thermofisher Scientific）为单位的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪连字符获得。将喷雾电压施加2.6 kV，转移管加热至300°C，并将漏斗RF设置为30％。启用了内部质量校准（锁定质量445.12003 m/z）。将肽在32厘米长的75μm内径融合 - 硅柱上分离，并用1.9μmC18颗粒（Reprosil-Pur，Maisch博士）包装在房屋中，并使用集成的柱OVEN（SONATION）加热至50°C。HPLC溶剂由水中的0.1％甲酸（缓冲液A）和0.1％甲酸，水中80％乙腈（缓冲液B）组成。在90分钟内，非线性梯度从7至40％缓冲液B洗脱肽，然后在6分钟内逐步增加到95％的缓冲液B，再保持9分钟。Full scan mass spectra (350–1400 m/z) were acquired with a resolution of 120,000 at m/z 200, maximum injection time of 100 ms and AGC target value of 4 × 105. The 20 most intense precursors per full scan with a charge state between 2 and 5 were selected for fragmentation (‘Top 20’), isolated with a quadrupole isolation window of 0.7 Th and fragmented via higher-energy collisional dissociation应用标准化碰撞能量为38％。使用50,000的分辨率在M/z 200，最大注射时间为86 ms和自动增益控制目标值1×105。在Orbitrap中进行MS2扫描。通过设置60 s和7 ppm的动态排斥，限制了已经获得的前体的重复测序，并限制了先进的峰值测定。使用sequest HT作为搜索引擎，用蛋白质组发现器（V.2.4，Thermofisher Scientific）分析原始质谱数据，并通过Spectrum RC节点对前体质量进行重新校准。搜索片段光谱针对人类参考蛋白质组（“每个基因的一个序列”，20,531个序列，2020年3月版本）和SARS的蛋白质序列（15序列，2020年3月版本）和COV2（14个序列（14个序列，2020年2月版本），从Uniprot下载了2020年3月，于2020年3月，从UNIPROT下载， 以及Maxquant软件提供的“污染物.fasta”中包含的常见污染物。静态修饰是在肽N末端和赖氨酸以及半胱氨酸残基上的氨基甲基的TMT，将动态修饰设置为蛋氨酸和乙酰化在蛋白N末端的氧化。用渗滤剂过滤匹配的光谱，在肽谱匹配和蛋白质水平上施加1％的假发现率。将报告基强度归一化为蛋白质组发现器中的总蛋白质强度，并假设使用normalyzerde package 65均等样品负载，并通过中位数归一化。在Perseus（v.1.6.0）中确定样品之间具有统计学意义的变化，并选择了具有p值≤0.01和log2（折叠变化）值最小值±0.5（参考文献66）的显着候选者。

　　人Caco-2细胞是从Deutsche sammlung vonmikroynismen和Zellkulturen获得的。将细胞在37°C的最小必需培养基（MEM）中生长，并补充有10％的胎牛血清（FBS），并含有100 IU ML -1青霉素和100μgML -1链霉素。A549和HeLa细胞是从ATCC（分别ATCC CCL-185和ATCC CCL-2）获得的。所有细胞系均对支原体测试为阴性。

　　我们在这项研究中使用了以下抗体和稀释液：泛素（目录（Cat。）编号3936S，细胞信号技术； 1:20:00），ISG15（Cat。No。HPA004627，Sigma Aldrich/Merck; 1,000），gapdh（cat。no。1118，Signal.1118，catt cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat dect; 1：2;GTA-100，Chromotek），GFP（Cat。No。Sc-9996，Santa Cruz Biotechnology; 1：2,000; 1：2,000），IRF3（Cat。No。4302，细胞信号技术； 1：2,000）； 1：2,000），Phosho-IRF3（Ser396）（Ser396）（Ser396）（CAT。No。4947，Cell Signal Signaling Technology; 1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1,1,000）。技术; 1：2,000），磷酸IκBα（Ser32/36）（CAT。9246，细胞信号技术； 1：1,000），TBK1（Cat。No。3013，细胞信号技术； 1：2,000），PTBK1，PTBK1（CAT。NO.3300-1EPESOMICS; 1：1：1：1：1：1：1,000），n f-b65。生物技术; 1：2,000），层lamin B1（CAT。No。SC-373918，Santa Cruz Biotechnology; 1：2,000）。

　　SARS-COV-2菌株FFM1（登录号MT358638）67是从使用Caco-2细胞从武汉（中国）返回法兰克福（德国）的旅行者中分离出来的。如先前所述，实验中使用的SARS-COV-2 FFM1库存在Caco-2细胞上经历了一段。在96孔微滴定板中的汇合细胞中，在汇合细胞中确定病毒滴度为每毫升TCID50。

　　在96孔板中，CACO-2细胞的汇合层被SARS-COV-2 FFM1感染，MOI为0.01。同时将病毒与GRL-0617同时添加，并在MEM中孵育1％的FBS，并具有不同的药物稀释液。感染后48小时对CPE进行视觉评估。为了评估GRL-0617对CACO-2细胞活力的影响，用不同的药物浓度处理汇合细胞层。细胞活力是通过MOSMAN68后修改的MTT分析确定的，如先前所述69。收集至少三个生物学重复的每个条件的数据。

　　为了分析IFN-β诱导基因的诱导，在A549细胞中使用了荧光素酶报告基因测定法。简而言之，包含荧光素酶ORF和IFN-β启动子（IFN-β-荧光素酶）的表达构建体与GFP对照质粒或指定的PLPRO质粒共转染。对于所有转染，在一个12孔板的每个孔中使用100 ng的荧光素酶质粒，400 ng的PLPRO或GFP载体，一式三份进行了所有转染，三个实验的平均值如图所示。转染后二十四小时，将细胞用500 ng poly（i：c）处理18 h或50 ng ml-1的TNF 30分钟。使用荧光素酶报告基因测定系统（Promega）测量荧光素酶表达。通过将用poly（i：c）或TNF处理为1处理的矢量来计算倍数变化。

　　用TNF（50 ng mL-1）处理表达GFP标记的PLPRO的HELA细胞45分钟。用多聚甲醛固定细胞，在5％血清中封闭，并在4°C下用抗P65的抗体在4°C下过夜。使用Zeiss LSM780显微镜系统进行共聚焦成像。使用63×1.4 Na Na Ilimmersion物镜的AR离子激光器（用于488 nm的GFP）（用于激发Alexa Fluor 546 nm）。在斐济分析了图像，以确定DAPI和免疫染色的p65之间的共定位。结果表明从3个独立实验中获取50个细胞。误差线表示标准偏差。

　　用GFP标记的PLPRO瞬时转染来自汇合60毫米盘的A549细胞，然后用IFN-α（200 mL-1，36 h）处理。将细胞裂解在低体电缓冲液（10 mM HEPE（pH 7.4），2 mM MGCL2，25 mm KCl，1 mM DTT，1 mM DTT，1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒）上，在冰上保持30分钟，然后进行注射液和2 m糖溶液，然后添加2 m糖溶液，然后添加滴水液，然后进行1,000分钟的中心，1,000分钟。上清液保存为胞质分数。在洗涤缓冲液（10 mM HEPE（pH 7.4），2 mM MGCL2，25 mm KCl，250 mm蔗糖，1 mm DTT，1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中洗涤两次颗粒，并作为核分数保存。

　　根据制造商的说明，使用ACL缓冲液和QIAAMP 96病毒试剂盒（Qiagen）分离来自细胞培养上清液样品的SARS-COV-2 RNA。使用LightCycler多重RNA病毒主试剂盒（Roche）对RNA进行反转录（RT – QPCR）分析的ONESTEP定量PCR。根据制造商的说明，使用RLT缓冲液和RNeasy 96 HT套件分离细胞内RNA。PCR是在CFX96实时系统C1000触摸热循环器上进行的。引物和探针是根据WHO协议70的适用于SARS-COV-2：RDRP_SARSR-F2（GTGARATGGTCATGTGTGTGGCGG）的RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）的开放阅读框RDRP_SARSR_P2探针（6-Fam CaggtggaacctcatcatCaggagatgc BBQ1）使用为0.2μm。Primers for ACTB (fwd: CATCGAGCACGGCATCGTCA; rev: TAGCACAGCCTGGATAGCAAC)71, ISG15 (fwd: GAGAGGCAGCGAACTCATCT; rev: AGGGACACCTGGAATTCGTT)72 IL6 (fwd: GCAGAAAAAGGCAAAGAATC; rev:CTACATTTGCCGAAGAGC), IL8 (fwd: GTTTTTGAAGAGGGCTGAG; rev: TTTGCTTGAAGTTTCACTGG) and 18S rRNA (fwd: AGAAACGGCTACCACATCCA ; rev: CACCAGACTTGCCCTCCA) were used for SYBR green-based detection of cellular genes in a final concentration of 0.4 μM per reaction.对于每种情况，使用三个生物学重复。平均和S.D.计算每个组。对于干扰素响应基因，使用以下引物。MX1（FWD：TTTCAAGAAGGAGGCCAGCAA; REV：TCAGGAACTTCCGCTTGTCG），OAS1（FWD：TGGCCTTCTATGCCCTCTTCCCCCTATCC; REV：TCCCATCATCAGGGTGCACAGAAGA）和CGTCCCGTAGGTCAGTGAAAAA）。SARS-CoV-2 subgenomic RNA4 encoding E gene, which is processed during discontinuous transcription in productively infected cells73, was quantified using primer pairs (fwd: AACGTACCTGTCTCTTCCGA; rev: CCAACCAACTTTCGATCTCTTGT) spanning a junction of the SARS-CoV-2 subgenomic RNAs and used as a measure of viral activity.

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。