没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。

　　要替换整个鼠标VH基因座（MM10，染色体12：113,567,224–116,010,427），我们组装了一个靶向矢量（PLH28-Exchange-Cassette）和VHH小型。靶向向量是通过插入由PEF1A-PURO-TK-2A-EGFP组成的选择盒，在wtloxp和PLH28 Exchange Vector24中的WTLOXP和LOXP257位置之间构建。作为同源臂，将VH缺失域两侧的1-Kb和0.8-kb碎片克隆了5'和LOXP位点的3'。为了构建VHH微型基因，根据已发表的序列为25,26,27，选择了VHH基因（来自羊驼的18个，来自Dromedary的7个，来自Bactrian Camel的5个）。接下来选择了30个小鼠VH启动子（250 bp），基于其表达选择，如Gro-Seq在静息和活化的小鼠B细胞中测量。将VHHS进行密码子优化，并与小鼠铅外显子，内含子和重组信号序列相辅相成。30个单位由吉布森组装（NEB）拼凑成Pbelobac11载体。

　　E14 cells were cultured in Glasgow’s MEM (Thermo Fisher Scientific, 11710035) supplemented with 10% FBS (ATCC, SCRR-03-2020), Glutamax, sodium pyruvate, non-essential amino acids (NEAA), penicillin (50 units per ml)–streptomycin (50 μg ml−1) and β-mercaptoethanol（Thermo Fisher Scientific，35050061，11360070，11140050，15140122，21985023）在37°C和5％CO2处。在使用之前，MLIF（Geminibio，400-495，10,000×），Meki（stemgent，0400602，10,000×）和GSKI（stemgent，0400402，3,333×）在使用前加入培养基。在使用前，在室温下将培养皿和板涂在0.1％甘氨酸上15分钟。为了删除Cμ的CH1外显子，将靶向侧翼内含子的SGRNA克隆到CRISPR -CAS9质粒PX458中（Addgene，48138）。与两个CAS9 SGRNA质粒（每个2μg）共转染了100 nt长的单链寡核苷酸（ODN）供体（100μM，3μl），与amaxa核反射核（lonza，vph-1001，Program a030）一起转染到胚胎干细胞（ES）细胞（ES）细胞（200万细胞）中。培养24小时后，将GFPHIGH ES细胞分为FACS，并在10厘米的菜肴中培养，每盘浓度为2,000个细胞。七天后，菌落被转移到96孔板中，并培养了3天。然后将基因组DNA提取并基因分型以进行Cμ外显子缺失。选择具有纯合缺失的克隆以使用相同的策略删除Cγ1外显子。为了删除整个VH基因座，将IGHV1-86（第一个IGHV）上游的SGRNA靶向序列分别将IGHV5-1（最后一个IGHV）的下游克隆到PX458中。将选定的ES细胞（200万细胞）与两个CAS9 SGRNA质粒（每个1.5μg）和PLH28-交换质质粒（1.5μg）共转染，然后在10 cm菜肴中培养。二十四小时后，用嘌呤霉素（0.8μgml-1）选择细胞10天，并选择单个菌落以延长和基因分型为远距离PCR。阳性克隆（200万细胞）与VHH微型载体共转染 （3μg）和表达CRE的质粒（1μg），并在10厘米盘中培养3天。然后，在挑选单个菌落进行膨胀和基因分型之前，用Ganciclovir（2μgmL -1）选择细胞7天。SGRNA和ODN引物在补充表4中列出。

　　将两个具有正常核型的ES细胞克隆注入C57BL/6胚泡中，然后将其转移到伪孕激素C56BL/6受体的子宫中。将高度的嵌合体与C57BL/6小鼠配对，并将后代用于VHH Minigene敲入和Cμ和Cγ1外显子缺失的基因分型。三分之三的嵌合体产生的F1后代显示了种系传播。将三只F1雄性小鼠用C57BL/6小鼠回击。F2杂合小鼠被亲，以产生所有三种修饰的纯合子。来自同一嵌合体的两个F1后代对于IGHM的CH1而言为null，但Cγ1的VH和CH1外显子的野生型。这些小鼠被用作扩展数据的对照图3B。

　　通过补充有10％FBS，HEPES，丙酮酸钠，NEAA，NEAA，青霉素 - 链霉素和β-羟基乙醇的RPMI 1640中培养B细胞，在37°C和5％CO2的存在下，在脂多糖的情况下（LPS，SIGMA，SIGMA，SIGMA，SIGMA，L2630，50°1）（IL-4，Sigma，I1020，2.5 ng ml-1）和抗CD180（1：2,000，BD Pharmingen，552128）抗体持续72 h。对于增殖测定，将细胞用室温染色（Thermo Fisher Scientific，C34557），持续20分钟，然后培养96小时。对于所有FACS染色，将细胞在4°C的FACS缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS），2％FBS）中孵育20分钟。Antibodies used for staining were: anti-B220-PerCP–Cy5.5 (1:500, eBioscience, 45-045-82), anti-B220–APC (1:500, Invitrogen, 17-0452-83), anti-IgM–APC (1:500, eBioscience, 17-5790-82), anti-Igκ–PE (1:500,BD Pharmingen，559940），抗Igκ– FITC（1：500，BD Pharmingen，550003），抗Igλ-FITC（1：200，BD Pharmingen，553434，553434），抗IgGG1 – Pe（1：200，BD Pharmingen，550083），5550083），抗iggg1-anti-iggg1-200;550874), anti-IgD–FITC (1:200, BD Pharmingen, 553439), anti-CD95–PE (1:200, BD Pharmingen, 554258), anti-CD43–PE (1:200, BD Pharmingen, 553271), anti-CD23–PE (1:200, BD Pharmingen, 553139),抗CD21-FITC（1：200，Biolegend，123408）和活力染料Efluor506（1：1000，Invitrogen，1923275）。使用BD FACSCANTO和FACSDIVA软件获取数据，并使用FlowJo软件进行分析。门控策略在扩展数据中显示了图10d。

　　用Dneasy血液和组织试剂盒提取骨髓或脾样品的基因组DNA（Qiagen，69506）。VHH（d）J关节从100 ng的DNA中进行了PCR膨胀，其框架底漆是30 VHH中的每个DNA，以及一个常见的下游JH4引物。将PCR产物加载到1％的琼脂糖凝胶上，以根据大小解决它们。补充表4中列出了引物。

　　VHH（d）J的J phagemid库是通过先用Trizol（Thermo Fisher Scientific，15596026）从纳米鼠脾样品中提取RNA，并根据制造商的指令将RNA（Thermo Fisher Scientific，15596026）构建，并用Suposscript III（Thermo Fisher Scientific，18080400）的指令将其反向转换至cDNA。将10μg的总RNA变性，并用与IGHM CH2相对应的基因特异性引物退火。在50°C下伸长50分钟后，将模板切换寡核苷酸（TSO）（3'-丙基修饰）接头添加到反应中，并在42°C下再将第一个链cDNA再伸长90分钟。将反应在85°C下灭活5分钟，并将2μlcDNA用作VHH（D）J扩增的模板，该模板是用HIFI PCR PREMIX（TAKARA，639298）作为VHH（D）J扩增的。对于第一步的PCR，使用未修饰的TSO和IGHM-CH2特异性寡核苷酸。然后用30个正向引物的底漆混合物（FR1）的30个VHH基因和4个对应于JH1〜JH4的框架（FR1）的底漆混合物进行放大，然后将30 ng的第一步PCR产物放大。PMES4 phagemid（Addgene，98223）用底漆放大，以在两端引入SFII位点。然后用SFII（NEB，R0123L）消化VHH（D）J和PMES4片段，并在16°C下用T4连接酶（NEB，M0202L）连接（分别为100和200 ng），过夜。连接产物用DNA清洁与浓缩剂（Zymo Research，d4014）纯化，并洗脱12μl水。将3μl的DNA电穿孔在1.0毫米白色的Civette（Harvard Appratus，450134）中用电穿孔系统ECM 630在25μF，200欧姆，200 ONMS，1,600伏特的设置中，将TG1细胞（Lucigen，60502-2）带入1.0毫米白色的TG1细胞（Lucigen，60502-2）中。在37°C中恢复1小时后，将TG1细胞在补充有100μgml-1碳苯甲霉素（KD Medical，BPL-2400）的10 cm lb琼脂平板中的5个。将板放在37°C细菌孵化器中过夜， 将细菌从板上刮下来，并用Zymo质粒微型培养箱（Zymo Research，d4054）提取吞噬作用文库。补充表4中列出了引物。

　　如“ VHH（d）J重组者吞噬库库的构造”中所述，对来自两种纳米的脾细胞的VHH（d）J重组剂进行了PCR放大，然后直接克隆到PCR-BLUNT II-TOPO载体（Thermo Fisher Fisher Scientific，450245，450245）中，并转化为STENBABL3 COPPALT3 COPPALT3 COPPALT3 COPTABL3 CORCENTICY ESCHERICHIA CORI（THERMO 3）。随机选择了96个菌落以进行Sanger测序。将来自BG505 DS-固定免疫的纳米吞噬的TG1细胞铺在含碳纤维蛋白的板上，并选择了50个用于Sanger测序的菌落。使用Snapgene软件进行序列对齐。

　　所有与动物相关的程序均通过遵循我们的NIAMS ACUC方案进行。为了监测生发中心反应，在完全弗洛伦德（CFA）的情况下，将三个纳米香肠和两只C57BL/6小鼠用50μg的钥匙孔的lig骨血果蛋白（KLH）免疫。在第6天，在不完整的Freund佐剂（IFA）的情况下，用25μgKLH进行脚垫进行了增强注射。在第12天收集了脾样品以进行分析。

　　为了隔离识别HIV-1包膜夹板的纳米型，在第0天存在CFA的情况下，用50μgBg505ds-Sosip对一种纳米液进行了免疫腹膜内，并在每天的IFA或PBS存在下以25μgBG505DS-SOSIP进行了促进，并在每天分别在22和44的情况下进行了增强。在第48天收集骨髓，脾和血液。

　　为了隔离针对SARS-COV-2的中和纳米型，在第0天存在CFA的情况下，在14、20和42的IFA中以0.5 mg的RBD蛋白进行了0.5 mg的RBD蛋白，将Llama（辅助物质）与1 mg重组RBD蛋白皮下免疫，并在0.5 mg的RBD蛋白中进行免疫。在第56天和第70天进行IFA的存在。在第80天，收集了500毫升的全血以进行图书馆准备。

　　为了隔离纳米质体中和纳米体的中和纳米剂，用RBD和/或Spike蛋白和/或尖峰蛋白和溶质蛋白进行了62天的免疫协议，对两组小鼠（第1组和第6组）进行了免疫。在第0天存在CFA的情况下，用50μg的RBD蛋白（第1组）或尖峰蛋白（第2组）对小鼠进行免疫接种，并在142天，25μg的25μg蛋白质（第1组）或225的群中，用25μg的RBD蛋白（第1组）或42天的IFA降低了25μg的RBD蛋白（第1组），并促进腹膜内免疫。在第56天和第59天，分别静脉内和静脉内。在第62天收集了骨髓，脾和血液样本。最佳响应者（第1组）和2和3（第2组） - 选择用于噬菌体图书馆的建设。

　　如先前所述的28，构建了Llama Phage库，并进行了一些修改。简而言之，使用Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare，17-1440-03）富含300毫升的全血，并从美洲驼和外周血单核细胞（PBMC）富集。将五十μg提取的RNA反转录至带随机六聚体的cDNA，并使用2.5μl的cDNA用于第一轮RT-PCR，带有基因特异性引物CALL001和CALL002。将PCR反应分别添加到反应中的12个单个试管中重复。凝胶纯化了约700 bp的PCR片段，并用作模板（每种反应30 ng，在12个单独的试管中重复），用于第二轮PCR，带有嵌套的引物VHH-BACK和VHH-FOR。合并了来自单个反应的PCR产物并纯化凝胶。用PSTI-HF和BSTEII-HF限制性酶（NEB：R3140L，R3162L）消化纳米机片段和PMES4 phagemid，并在16°C的一夜之间用T4 Ligase结扎（分别为1μg和2μg）。连接产物被列（成12μlH2O），并将其电穿孔成360μl的TG1细胞。在37°C恢复1小时后，将细胞镀在245×245毫米菜肴中的6个（Thermo Fisher Scientific，431301）中，其中含有2-YT琼脂，其中含有100μgml-1碳酸酶素和2％（w/v）。将板放在37°C的细菌孵化器中过夜，然后将细菌从板上刮下，并存档为甘油汤。用VCSM13辅助噬菌体（Agilent Technologies，200251）感染细胞，然后在2.5 m氯化物中以20％聚乙烯甘油8000（Sigma，89510）在冰上降低培养上清液，以纯化纳米机噬菌体颗粒。将噬菌体颗粒重悬于1 mL PBS中，立即使用300μL进行筛选，并在10％甘油存在下将其余的噬菌体储存在-80°C下。

　　纳米液纳米噬菌体噬菌体库的构造方式与纳米液VHH（d）J区域吞噬图书馆的构造相同，并进行了一些修改。简而言之，从免疫小鼠的脾细胞，骨髓细胞和PBMC中提取总RNA，并分别处理直至TG1细胞电穿孔步骤。将来自脾细胞，骨髓和PBMC的RNA（分别为50μg，50μg和所有）在单独的管中用IGHG1-CH2特异性引物反向转录至cDNA。使用未修饰的TSO和IGHG1-CH2特异性寡核苷酸作为引物，将两μL的cDNA用作PCR可变结构域扩增的模板（每个反应12个）。使用30 ng的第一步PCR产物作为模板和30 fr1和4 JH寡核苷酸混合物作为引物，将第二个PCR重复在12个反应中。PCR产物被凝胶纯化，用SFII消化，并用PMES4（分别为200 ng和400 ng）结扎。将脾细胞，骨髓和PBMC样品的连接产物汇总并列（成12μl水），并将其电穿孔成360μl的TG1细胞，并如'vhh（d）J重组剂吞噬症状库中所述制备的噬菌体文库和噬菌体文库。”补充表4中列出了引物。

　　从TG1细胞文库中提取的吞噬DNA用作构造Miseq库的起始材料，以测量VHH的使用和纳米病多样性。简而言之，将1.2μg的吞噬DNA用作模板，VHH（d）J插入物用引物使用Cloneamp HIFI PCR PREPIX（TAKARA，639298）在50-μl反应（9个循环）中放大。为了避免由于初始循环的复杂性低而启用多路复用测序，因此将1-9 nt长的停滞物引入了前进引物中。没有纯化，将5μl的第一个PCR产物用作第二个PCR（9个周期）的模板，以在两端添加Illumina P5和P7引物。然后将PCR产物加载到2％琼脂糖凝胶上，并用Zymoclean Gel DNA恢复试剂盒纯化约580 bp的尺寸带（Zymo Research，d4002）。通过量子4荧光计（Thermo Fisher Scientific，Q33238）确定DNA浓度，并通过贴纸4150（Agilent）确定平均DNA大小。然后将DNA调节至含有0.1％Tween-20的洗脱缓冲液中的2 nm。对于未免疫化的纳米型VHH（D）J库，以1：1：1的比例混合了3只小鼠的DNA（2 nm），并加载了Miseq运行。对于免疫化的Llama和纳米纳米纳米型多样性分析，首先以10：1的比例混合了预选前和选择后库的DNA（2 nm），然后将来自单个动物的样品以1：1的比率汇总到Miseq测序之前，然后以1：1的比例汇总。补充表4中列出了引物。

　　对于未免疫化的纳米液使用分析，通过Miseq测序了来自3只小鼠的合并库（Pair End，270个循环×2）。配对末端读取与NGMERGE29与默认设置合并。使用PTRIMMER PROCON30修剪与PMES4相对应的核苷酸，在合并后的读取中留下清洁的VHH（D）J序列。使用不确定的N核苷酸读取，使用FastP Program31除去低质量序列或小于300 nt的读数。FastQ格式序列转换为.fasta格式以进行进一步分析。为了计算VHH使用，使用BLAST+构建了包含所有30 VHH基因的外显子序列的.fasta格式文件（vhh.exon.fa）构建的BLAST数据库。然后使用Igblast Program32将VHH（D）JS对准VHH基因。简化对齐输出文件仅保留序列标识符和VHH（D）J重组信息。

　　对于免疫化的Llama和Nanomouse Nanobody多样性分析，通过Miseq测序了总共8个文库（序列前后）（序列前后）（Pair End，300个周期×2）。使用镰刀程序（v1.33，可在https://github.com/najoshi/sickle获得）修剪3'-End低质量序列（v1.33）。对于不同的库，根据用于库构造的引物中的引物中的散落器长度来调整修剪序列的最小长度。配对序列通过Flash程序（V.1.2.11）33合并并翻译。为了提取纳米型序列并找到CDR3区域，我们使用Anarci Program34来注释具有IMGT编号的VHH基因。提取了CDR3区域中总和大于或等于100氨基酸的蛋白质序列，以进行进一步分析。通过比较序列前和选择后文库中的频率来计算单个序列的富集。使用CD-HIT程序（v.4.6.8）35选择了富集超过10次且具有大于或等于5×10-5频率的序列。

　　如先前所述36，表达并纯化了BG505 DS-SOSIP蛋白。SARS-COV-2及其RBD的尖峰蛋白被表达并纯化，如先前所述的37,38，并进行了一些修改。简而言之，将1毫克的PCAGGS尖峰或PCAGGS-RBD质粒转染到1 L的Expi293细胞（Thermo Fisher Scientific，A14528）中，带有涡轮293型转染试剂（速度生物系统，PXX1002）。转染后的第4天，通过以12,000g的培养物离心15分钟，收集了转染细胞的上清液。然后将上清液通过0.2 m的APES过滤器（Thermo Fisher Scientific，5670020）过滤，并在室温下与10 mL完整的HIS-TAG纯化树脂（Roche，05893801001）一起孵育1小时。接下来，通过重力流柱（Biorad，9704652）收集His-Tag树脂，并用100 mL洗涤缓冲液（15毫米咪唑，50 mM Trishcl，300 mM NaCl）洗涤，并用25 mL的EliTURE BUFFER洗脱，并用25 mL的洗脱缓冲液（300毫米咪唑，50 mm trish trish trish trish，300 mm trish，300 mm nacl）洗脱。将洗脱液集中在10 kDa Amicon离心单元（EMD Millipore，UFC901024）中，然后使用Slide-A-Lyzer透析盒（Thermo Fisher Scientific，66381）在PBS中进行透析。通过Nupage Gel（Thermo Fisher Scientific，NP0336Box）分析蛋白质，并通过Instantblue染色（ABCAM，AB119211）进行可视化。将可溶性尖峰三聚体或单体RBD蛋白进行等分，用液氮来捕集，并在用于免疫之前储存在-80°C下。RBD和Spike（Hexapro）蛋白用于噬菌体筛选，BLI，负污渍电子显微镜和冷冻电子显微镜（Cryo-EM），如前所述10,39进行了。

　　RBD，SPIKE和BG505 DS-SOSIP通过不同的方法涂在Maxisorp 96孔板上（Thermo Fisher Scientific，439454），以进行噬菌体筛选。对于RBD筛选，将两个孔与4°C的50μlRBD蛋白（PBS中的100μgml -1）涂覆过夜。另一个具有50μlPBS的井被用作非涂层对照。将井用PBS用0.1％Tween-20洗涤3次，并在室温下用PBS中的5％非脂肪牛奶阻塞1小时。对于尖峰或BG505 DS筛选，将三个井涂在4°C的50μl凝集素（EMD Millipore，L8275，PBS中100μgml-1）过夜。在室温下用10％的非脂肪牛奶洗涤井，并用10％的非脂肪牛奶阻塞1小时。洗涤三次后，将50μl的100μgml-1 bg505 ds-sosip或Spike添加到2孔中，在室温下孵育2小时并洗涤。第三孔包含PBS，并用作非涂层对照。将三百μl的噬菌体颗粒与300μl的10％非脂肪牛奶混合，并在室温下轻轻旋转1小时。然后将一百五十升阻塞的噬菌体颗粒添加到每个孔中，并在室温下孵育2小时，并轻轻摇动。洗15次洗涤后，用Tryple Express酶（Thero Fisher Scientific，12605010）洗脱噬菌体，在室温下以700 rpm摇动板，持续30分钟，并立即用于选择效率估计（10μL噬菌体洗脱液）和恢复感染（其余的Eluate），如前所述28，如前所述28。一旦选择了抗RBD文库，并选择了用BG505 DS-SOSIP或SPIKE免疫动物构建的库，用BG505 DS-SOSIP或SPIKE或SPIKE（HEXAPRO）蛋白选择了两次。

　　一两轮选择后，将回收的TG-1细胞铺板，并挑选菌落以制备含有粗纳米型的周质提取物，以进行酶联免疫吸附测定法（ELISA）。简而言之，在补充了100μgml-1的卡比尼霉素和0.1％葡萄糖的2年培养基中，在96个深孔板（Thermo Fisher Scientific，278743）中采摘并生长单个菌落。当在600 nm（OD600）达到1时的光密度时，添加IPTG（最终1 mM），并在30°C中诱导蛋白质表达16小时。通过在200μLPBS中重新悬浮细菌颗粒并在液氮中迅速冷冻，制备了周质提取物。冷冻细胞在室温下缓慢解冻，并以4,100克离心15分钟。用凝集素（2μgml-1）涂覆左任板，然后用BG505 ds-sosip（2μgml-1）或RBD（2μgml-1）涂覆。阻塞后，将100μl的含纳米病毒的上清液转移到板上，并在室温下孵育2小时。洗涤板，然后用马萝卜过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗阿尔帕卡VHH结构域特异性抗体（Jackson Immunoresearch，128-035-232）在室温下孵育1小时。洗涤板，然后通过添加50μl四甲基苯胺（TMB）（Thermo Fisher Scientific，34028）进行开发10分钟，然后通过添加50μl的1 M H2SO4来停止反应。用协同微孔板读取器（Biotek Gen5）测量450 nm处的吸光度。

　　从TG-1细胞中提取了来自ELISA鉴定的铅候选者的吞噬剂，并转化为WK6细胞（ATCC，47078）。在37°C和220 rpm的30 mL 2yt培养基中生长培养物（100μgml -1的碳苯霉素和0.1％葡萄糖），直到OD600达到1。蛋白质表达在30°C下于30°C诱导1 mmMM IPTG 16小时，然后在4,100G下搅拌15分钟。将所得的颗粒重悬于1 ml的PBS中，加上30μl的0.5 ML -1多粘蛋白B（Sigma，p1004），并在37°C下孵化1小时。将细胞碎片在12,000克颗粒5分钟内颗粒，并使用Capturem His标记的纯化套件（Takara，635710）纯化上清液中的纳米碎片。对于大规模的纳米身体的产生（0.2至1 L培养物），通过完整的HIS-TAG纯化树脂纯化上清液中的纳米体，并在PBS中进行透析，如“ BG505 DS-Sosip和SARS-COV-COV-2蛋白的表达和纯化”中所述。通过0.22-μmPVDF膜（EMD Millipore，UFC30GVNB）对蛋白质进行过滤，然后用于下游测定。

　　将单体或三聚体纳米病序列融合到人IgG1的FC区域，其标签在C末端末端为6倍，并将其克隆到PVRC8400载体中。以三聚体形式，通过（GGGGS）×3个柔性接头连接了纳米机构。在某些情况下，使用Llama IgG2A铰链区域代替人类IgG1铰链。从第2天到第4天，在33°C的33°C下，在33°C的“表达和纯化”中所述，FC融合构建体在Expi293细胞中表达。使用一个完整的His-Tag净化纯化树脂或蛋白质A A266457）。当使用蛋白A树脂时，通过IgG洗脱缓冲液（Thermo Fisher Scientific，21009）洗脱抗体，并通过添加1/10卷Tris-HCl（1M，pH 8）将抗体带入中性pH。将抗体浓缩，透析和过滤。纳米型– FC产量高达100 mg l -1。SARS-COV，SARS-COV-2和BAT冠状病毒WIV16峰值蛋白的RBD区域融合到人IgG1的FC区域，并克隆到PVRC8400载体中。RBD – FC蛋白在Expi293细胞中表达，并用蛋白A纯化。

　　根据制造商的说明，使用SARS-COV-2替代病毒中和试验（SVNT）试剂盒（SVNT）试剂盒（SVNT）试剂盒（Genscript）试剂盒（SARS-COV-2替代病毒）测试了RBD – ACE2相互作用阻断电位。简而言之，将HRP – RBD稀释并与特定浓度的纳米酶孵育30分钟，在37°C下孵育30分钟。然后将样品转移到ACE2涂层板上，并在37°C下孵育15分钟。洗涤板，并使用TMB试剂进行测定，并用停止溶液淬火。用协同微孔板读取器（Biotek Gen5）测量450 nm处的吸光度。根据制造商的SVNT套件的指示，使用Microsoft Excel计算并绘制抑制率。

　　以前已经描述了一组表达RBD突变剂SARS-COV-2峰值蛋白的质粒在PSARS-COV-2-SD19的背景下进行了描述1,40。突变体E484K和KEN（K417N，E484K和N501Y）是在PSARS-COV-2-SΔ19变体的背景下构建的，在Furin裂解位点（R683G）中取代。将这些假型的IC50与随后的分析中的野生型SARS-COV-2尖峰序列进行了比较。如前所述，进行了SARS-COV-2假病毒中和测定的伪病毒中和测定法。简而言之，用PNL4-3DENV-NONOLUC和PSARS-COV-2-SD19转染了293T细胞，并在转染后48小时收集伪型病毒量，过滤并存储在-80°C下。连续稀释的纳米剂在37°C下与假型病毒一起孵育1小时。将混合物添加到293TACE211（用于分析野生型中和活性）（图2）或HT1080ACE2 CL.1417细胞（用于分析峰值突变板）（图3），并用PBS用PBS洗涤48 H细胞，并用荧光素酶细胞培养物裂解裂解5X固定（Promege）（Promege）。使用Modulus II微型读取器用户界面（Turner Biosystems）测量裂解液中的纳米荧光素酶活性。将相对发光单元归一化为在没有抗体的情况下从感染了SARS-COV-2伪型病毒的细胞中的细胞。如前所述41，在HT1080/ACE2CL.14细胞中进行了基于HIV-1的SARS-COV-1和BAT冠状病毒WIV16假病毒WIV16假病毒。使用四参数非线性回归（GraphPad Prism）确定纳米体的IC50。

　　重组印第安纳囊炎病毒（RVSV）表达不同的冠状病毒尖峰（SARS-COV-2，RATG13，GDPANGOLIN，GDPANGOLIN，GXPANGOLIN，SARS-COV，WIV1，WIV1，SHC014，SHC014，SHC014，SHC014，LYRA11，LYRA11，RS7327，RS7327，RS4084和RS4084和RS4231 ,，42,42 ,，42,42 ,， 42,42，，42,42，002，，3，，3，，3，，r.42，as42,4。简而言之，在使用脂肪系3000（Invitrogen）转染尖峰基因之前，将HEK293T细胞与峰值基因转染之前生长至80％汇合。使用5％CO2在37°C培养细胞过夜，并使用VSV-G伪型ΔG-荧光素酶（G*ΔΔG-酸酸酶酶，kerafast）培养细胞，以在2 h的多种感染（MOI）（MOI）中向DMEM感染DMEM的细胞，然后用1×dpbs的1×dpbs 3次洗涤细胞。第二天，收集转染上清液并通过300克离心10分钟来阐明。然后，将每种病毒量与20％I1杂交瘤（抗VSV-G，ATCC：CRL-2700）上清液孵育1小时，在37°C下孵育1小时，以中和污染VSV-G Pseudo the typedΔG-lucififerase病毒，然后在测量滴答物并使滴答物中储存在-800°C下。中和测定是通过将​​假病毒与抗体的连续稀释液一起孵育，并通过荧光素酶基因表达的降低得分，如前所述2,42,43。简而言之，将293TACE2细胞接种在96孔板中（每个孔2×104个细胞）。将假病毒与抗体在37°C下一式三份的连续稀释液孵育30分钟。将混合物添加到培养的细胞中，并再孵育16小时。使用荧光素酶测定系统（Promega）测量发光，将IC50定义为与病毒对照井（病毒 +细胞）相比，仅使用细胞中的对照组减去背景后，相对光单元降低了50％。使用GraphPad Prism中的五参数剂量响应曲线计算IC50值。

　　The SARS-CoV-2 viruses USA-WA1/2020 (WA1), USA/CA_CDC_5574/2020 (B.1.1.7), hCoV-19/South Africa/KRISP-EC-K005321/2020 (B.1.351) and hCoV-19/Japan/TY7-503/2021 (P.1) were obtained from BEI Resources (NIAID, NIH) and使用Vero E6细胞为一个段落传播。如前所述42，病毒感染性滴定是通过对VERO E6细胞的终点稀释和细胞质效应（CPE）测定确定的。进行了终点稀释的微板中和测定法，以测量纳米体的中和活性。简而言之，从10μgml -1开始，将纳米生物剂连续进行五倍稀释液。将每种稀释的三次稀释度与SARS-COV-2的MOI在EMEM中的MOI中孵育，在37°C下以7.5％灭活的胎儿小腿血清孵育1小时。孵育后，将病毒 - 纳米病变混合物转移到过夜的Vero E6细胞的单层中。将细胞与混合物孵育约70小时。两名独立的观察者以盲目的方式对病毒感染的CPE视觉评分。然后将结果报告为在给定纳米稀释时中和的百分比。使用非线性回归（归一化响应，可变斜率）在GraphPad Prism中确定纳米体的IC50。

　　用便携式网状雾化器（Philips，Innospire GO）将纳米虫雾化，最终浓度为0.4 mg ml-1。通过冷凝水在冰上冷却的50毫升管中收集所得的气溶胶。通过Nupage凝胶分析结束前和结束后样品，并通过Instantblue染色进行可视化。还进行了SARS-COV-2替代病毒中和试验，以比较结束前和结束后样品的中和效力。为了进行热稳定性测试，将补充加载缓冲液（Thermo Fisher Scientifc，NP0007）和β-马ercaptoethanol的纳米剂在98°C加热10分钟，然后在Nupage凝胶上进行分析，并通过InternantBlue STENS进行可视化。

　　使用FortébioOctet Red384仪器进行BLI测定法，以确定纳米体与RBD的亲和力。简而言之，将生物素化RBD固定在链霉亲和素涂层的生物传感器上，然后浸入含有纳米病的溶液中30 s，然后解离2-3分钟。为了测定纳米型与RBD – FC（SARS-COV，SARS-COV-2和WIV16）的结合，将6×His标记的纳米机固定在Ni-NTA涂层的生物传感器上，然后浸入Ni-NTA涂层生物传感器上，然后浸入RBD – FC溶液中的RBD – FC溶液中，以进行1分钟，然后进行1分钟的分离。使用相应的空白曲线校正浓度序列的传感器图，并使用1：1 langmuir结合模型在全球拟合全球拟合。

　　使用fortébio八核Red384仪器进行纳米型– RBD结合竞争测定法。首先将生物素化RBD固定在链霉亲蛋白涂层的生物传感器上，并允许与六个纳米型之一相关联，然后浸入溶液中，其中包含第二个纳米病毒。

　　通过以1：1的重量比混合两种蛋白质，然后用​​含有10 mM HEPES，pH 7.4，150 mm NaCl的缓冲液稀释纳米型旋转络合物，然后将其吸附到新鲜发光的碳涂层铜网格中，并用上述缓冲液洗涤，并用0.75％的uranyl insyralsyrate浸泡。使用EPU在Thermo Fisher Talos F200C显微镜上以4K×4K CETA 16 M相机的摄像机的高度显示，以57,000的放大倍率收集图像，并以200 kV的速度运行。CETA相机的像素尺寸为2.5Å。使用CryoSparc进行了粒子拾取，无参考的2D分类，3D重建和改进。

　　通过以1：1的重量比的手动混合物制备纳米型 - Spike复合物（NB12 -S6P和NB30 – S6P），然后将其稀释至0.5 mg ML -1。将样品（2.7μl）应用于发光的量化量子R 2/2金网格，并使用玻璃体标记IV玻璃IV，在将网格插入液态乙烷中之前，斑点时间为3 s。使用安装在泰坦krios电子显微镜上的Leginon系统以300 kV运行并配备了K3-Bioquantum Direct检测装置的Leginon系统获取数据。剂量在40个原始框架上分配，并在2秒的暴露时间内收集。使用CryoSparc进行了运动校正，CTF估计，颗粒拾取，粒子拾取，粒子拾取，初始模型的产生，异质改进，3D变异性分析和均匀的3D细化。在通过粒子减法删除其余的密度后，使用掩模包含一个RBD – Nanobody络合物的一个副本来解决RBD – Nanobody界面来解决RBD – Nanobody界面。

　　对于初始拟合的冷冻EM重建地图，我们使用了来自Protein Data Bank（PDB）代码7JZL的SARS-COV-2 SPIKE的坐标，以及由AbodyBuilder Server44预测的纳米模型。使用嵌合体将这些初始模型停靠到冷冻EM图中。然后，通过使用COOT和近苯基，Molprobity和Emringer内的手动拟合和真实空间细化的手动拟合过程，将坐标更加精确地拟合到电子密度，以检查几何形状并在每个迭代步骤中评估结构。在UCSF Chimerax和Pymol（https://pymol.org）中产生了数字。使用UCSF Chimera中的拟合图形特征计算出地图拟合跨相关性。使用CryoSparc确定了冷冻EM图的总体和局部分辨率。

　　序列熵基于具有以下Uniprot标识符的9个菌株：SARS-COV-2：P0DTD1，B.1.1.7和B.1.351;SARS-COV：A7J8L4，Q202E5和P59594；和类似蝙蝠的冠状病毒：MG772933，WIV16（A0A0U2IWM2）和RSSHC014（U5WLK5）。根据与公式的对齐序列对每个残基计算熵：

　　其中XI是标准氨基酸，以及间隙。

　　使用NACCESS程序计算了RBD上的埋入表面积。

　　在Adobe Illustrator 2020中排列的数字。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。