将含有T7启动子拟合的RNA感兴趣的RNA序列的DNA模板（有关序列的补充表4，请参见补充表4）作为IDT的gblocks。旨在扩增这些序列的引物（有关序列的补充表4）也来自IDT。使用NEBNEXT Ultra II Q5 Master Mix（NEB M0544S）使用10 ng的模板每反应进行PCR扩增。热环体设置为：98°C 30 s，然后35个循环为98°C，持续10 s，55°C 30 s，然后72°C 30 s，最后一步为72°C，持续5分钟。然后使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen 28104）对PCR产物进行纯度纯化，并在2％的E-Gel琼脂糖凝胶（Thermo Scientific A42135）上运行以检查DNA质量。使用纳米体测量DNA浓度。使用转录援助T7 T7高产量转录试剂盒（Thermo Scientific K0441）用6μL的DNA模板每个反应在体外转录纯化的DNA小于515 bp。使用MEGAscript T7转录试剂盒（Thermo Scientific AM1334）在每个反应中使用6-8μLDNA模板的纯化DNA超过515 bp的纯化DNA进行体外转录。将这些体外转录反应在37°C下孵育6小时，然后在DNase处理前在4°C下孵育。然后使用RNA清洁和浓缩器-25试剂盒（Zymo Research R1017）纯化RNA，并在30μl水中洗脱。使用纳米旋转测量纯化的RNA的浓度，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer（由Stanford Pan设施运行的Nano RNA分析仪； Bioanlyzer 2100 Expert B.02.11.SI824）检查质量，如图7A所示。

　　对于所有随后的实验，使用相同的基本协议重新折叠RNA。在每个部分中都提到了使用的RNA浓度以及对该标准协议的任何其他修改。在50 mm Na-Hepes pH 8.0中将RNA变性（90°C持续3分钟，室温10分钟）。然后将RNA用10 mM MGCL2在50°C折叠20分钟，然后冷却至室温至少10分钟，然后进行测量。

　　使用Refeyn Twomp收集质量光度计数据，使用AcquiRemp版本2024-R1.1和DiscoverMP版本2024-R1收集到直方图数据。对于OLE数据，使用了MP样品制备包（MP-CON-21014）的涂层载玻片，用于与Poly-lysine涂层后，使用了ROOL和GOLLD数据质量玻璃UC载玻片（MP-CON-41001）。使用液滴稀释的仪器聚焦。使用较大的图像大小收集数据1分钟。使用千年RNA标记（Thermo Scientific AM7150）将对比度数据校准至核苷酸长度。Guassians通过DiscoverMP的自动分析拟合。所得数据和绘图代码可以在随附的GitHub存储库中找到。

　　质量光度计数据对于RAIA基序不可靠。按照上述标准程序，将RAIA基序RNA以1 µm折叠。在第2阶段，尝试了15 µL缓冲液：最终浓度为118 nm和18 µL缓冲液的2 µL样品：2 µL 10倍稀释的样品，最终浓度为10 nm。核酸样品有一个已知的问题，其中存在嘈杂的低质量峰48（与公司Refeyn的通信）。这些不单独存在于缓冲区中。因此，RAIA主题（205 nt）低于建议的质量光度法的最小尺寸，实际上，当我们尝试收集有关RAIA主题的数据时，我们观察到噪声峰，其中包含RAIA Motif单体的大小，但比任何多聚体都小，在结合和绑扎方案中，表明了不正确的结果（未显示数据）。

　　将OLE以0.25 µm折叠，并在舞台上稀释至12.5 nm。OLE折叠在各种缓冲液中，包括50 mm Na-Hepes pH 8.0，在标准协议中添加MGCL2时添加了其他组件：（1）什么都没有添加；（2）1 mm mgcl2;（3）10 mm MGCL2，标准；（4）100 mm MGCL2;（5）10 mM MGCL2和1％乙醇；（6）10 mM MGCL2和5％乙醇；（7）0 mM MGCL2和200 mM KCl;（8）10 mM MGCL2和200 mM KCl;（9）0 mM MGCL2和200 mM NaCl;（10）10 mM MGCL2和200 mM NaCl。尝试使用MNCL2缓冲液，但锰将检测器饱和。

　　将Rool和Golld以1 µm折叠。在获取数据之前，将样品稀释10×。在阶段，将样品进一步稀释（10 µL缓冲液：10 µL样品），最终浓度为50 nm。

　　使用标准折叠方案将RNA以30 ng µl -1折叠。使用Prometheus Panta收集DLS痕迹。每种RNA的两种重复（2个毛细血管为10 µl体积，纳米emper PR-C002）。使用Pr.Pantacontrol v.1.8.0获得了100％的人均DLS数据，其毛细血管的收购为100％。计算自动相关函数，并使用pr.pantanaalysis v.1.8.0中的默认参数拟合大小分布。可以在随附的GitHub存储库中找到所得的尺寸分配表和绘图代码。

　　对于所有样品，使用否。542滤纸和Quantifoil 1.2/1.3 200网格铜网，在15 mA处发出30 s的发光。使用标准折叠条件以8 µm折叠，除非在50°C孵育后，以0.1°C S -1的速率将温度降低至37°C，在37°C下保持2分钟，然后在0.1°C s -1的速率下降低至室温。为了增加冰中的戈尔德浓度，在爆发前进行了4个施加2 µL样品和印迹的周期。使用标准折叠方案以9.1 µm折叠ROOL。将网格涂在2 µl的100 mM NaCl上，该NaCl被印迹3 s。然后，立即将2 µL样品施加到网格上，并将其印迹3 s，然后浸入液态乙烷。用标准折叠方案分别在20 µm和15 µm的标准折叠方案中冷冻OLE和RAIA基序RNA；将2 µL样品施加到网格上，然后将3 s斑点插入液态乙烷中。

　　使用50μMC2光圈和100μM物镜和EPU软件（v.3.5），在Titan Krios G3显微镜上收集了所有数据集。使用Selectris Energy滤波器上的Falcon 4相机收集了OLE数据集，而在Bio Quantum Energy Filter和EPU软件上使用具有20 eV Slit的K3摄像头收集了其他数据集。可以在扩展数据表1中找到有关每个RNA的剂量，放大倍数和数据的其他信息。

　　使用CryoSparc（v.4.5.3）49实时处理数据，然后进一步完善，包括不均匀的修复50。对于OLE和RAIA基序每个粒子运动校正进行51。对于所有数据集，直到最终改进阶段才应用对称性。对于OLE，应用C2对称性。对于Rool和Golld，分别应用了D4和D7对称性，然后分别使用一个不对称单元的颗粒对称性膨胀和局部细化。最后，对于一个不对称单元的戈尔德和Rool子域，并进行了复合图，并为一个不对称单元创建了半映射，然后使用phanix.com.bine_focused_maps（v.1.21）52组合到完整的对称性。使用CryoSparc估算局部分辨率。请参阅扩展数据图。1-5有关处理管道的更多详细信息。

　　使用phenix.auto_sharpen用半图（v.1.21）锐化地图。单体的初始模型是从ModelAngelo（Rision-5.0）53获得的；由于ModelAngelo的当前版本无法在纯RNA结构上运行，因此将EMDB-17659添加到地图的角落，因此提供了相应的蛋白质序列（蛋白质数据库（PDB）：8PHE），然后从模型中删除了蛋白质残基。RNA建模的链条是手动追踪RNA序列的，在必要时添加和突变残基（特别是，通常需要C到U突变）。手动模型校正和完善是在COOT（版本0.9.8）54中完成的。使用ISOLDE和COOT54对单体进行手动细化。对对称性的应用是由于改进的限制而不对称地进行的，因此从此以后进行了对称性。通过手动分析分子间相互作用，并使用ISOLDE55和COOT54进行校正。Drrafter56（Rosetta 3.10（2020.42））用于填充低分辨率区域。对于对称的接吻循环，选择了这些模型并拟合到地图中，并使用ISOLDE55手工对称地进行了更对称的精炼。最终细化首先是通过phenix.Real_Space_refine57进行的，然后使用Erraser258（Rosetta 3.10（2020.42））进行分段校正，然后在COOT54中进行手动细化，必要时进行Isolde55。创建了一项协议，以使大型Rool和Golld复合物对精炼进行改进。首先，在使用erraser2之前，在〜30个部分中对单体进行了完善。然后将它们缝合在一起，并进一步完善缝合缝线位点的区域。最后，进一步完善了单体的有问题区域。将对称性应用于单体，并平行地进行相互作用位点，直到相互作用仅与小小的冲突相互现实为止。自始至终， 如果拆分点引起最小化错误或包括相互作用残基，则可以手动编辑分分。使用了以下erraser2命令，如果尚未收敛，请重复：

　　$ERRASER -s $PDB -edensity:mapfile $MAP -edensity::mapreso $RESOLUTION -score:weights stepwise/rna/rna_res_level_energy7beta.wts -set_weights elec_dens_fast 40 cart_bonded 5.0 linear_chainbreak 10.0 chainbreak 10.0 fa_rep 1.5 fa_intra_rep 0.5 rna_torsion10 Suiteness_bonus 5 RNA_SUGAR_CLOSE 10 -RMSD_SCREEN 3.0 -MUTE CORE.SCORE.CORE.CARTESIANBonDENERGY cORE.SCOIN.SCOIN.ELECTRON_DESSIN.XRARY_DESSION.XRAY_SCARE_SCATTERING -ROUNDS 3 -FASTA $ FASTA $ FASTA -CRYOEEM_SCASCASCASSTERS -RNA -RNA -RNA -RNA -RNA：erraser：forraser：field_ field_ress $ pidece。

　　验证指标是使用近粒（包括phenix.RNA_Validate59,60,61）计算得出的。Chimerax（版本1.8）62用于计算Q-Score61和所有视觉效果。

　　使用Rosetta RNA_MOTIF63鉴定了基本配对和基础堆叠。使用具有“ –k-turns”标志的DSSR（v.1.9.9）64鉴定了扭转和核糖拉链。通过将每个结构的每5-nt范围对齐到代表性的Z锚（4E8Q残基108-111），并手动检查每个具有根平方平方偏差（RMSD）<4Å的区域，从而手动标记了Z锚。使用手动操纵的核能绘制二级结构63。为了可视化假设的OLE RNA - 蛋白质复合物，使用Alphafold 3（服务器版本）47预测：（1）带有OAPC单体的OAPA二聚体；（2）RPSU使用（补充表4）中的序列。将OAPA二聚体手动安装到拟议的RNA位点中。OAPC接近其假定的结合位点，但与RNA发生冲突，因此其位置进行了调整。RPSU也被手动放置在其建议的结合位置中。然后将C2对称性应用于可视化完整的复合物。

　　细菌基因组于2024年2月从国家生物技术信息中心（NCBI）基因组数据库下载（https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genomes/genbank/genbank/bacteria/）。噬菌体基因组的GenBank记录于2024年3月下载（https://millardlab.org/bacteriophage-genomics/phage-genomes-march-2024/）。从RFAM数据库（ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/RFAM/）下载了Golld，Roo和Ole的序列配置文件。使用报告的Alignment63构建了RAIA Motif的自定义序列轮廓。为了从基因组序列中检索NCRNA，使用临界值为10-5（地狱1.15）65进行CMSearch进行CMSEarch。总体过程产生了以下非冗余NCRNA序列的数量：806，Golld；1,596，鲁尔；8,585，Ole;4,875，Raia主题。

　　地狱软件65（v.1.1.2）用于比较候选RNA结构与RFAM模型（CMSCAN），构建和校准新的协方差模型（CMBUILD，CMCALIBRATE），用于单独的RNA簇，并执行结构形成的同源搜索（CMSEarch）。使用CMALIGN65和肌肉（V.5）66进行了比较分析和多个候选候选物的比较，并使用Owen Program进行了成对比较67。进化史是通过Mega X68中具有不同模型的最大似然法推断出来的。DeciphersSC69对孤立簇中的代偿性取代进行了进化分析。

　　RNAALIFOLD（来自Viennarna 2.7.0）70应用于计算折叠多个RNA比对，并使用AFOLD/HYBRID71,72用于预测群集内局部折叠的二级结构或混合双链元素。用R-Scape（V.1.2.3）73进行协方差分析，该分析使用统计学上显着的协变量（E-Value <0.05）作为基础配对约束来注释RNA的多个结构比对。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。