我们应用了以表面为中心的方法来设计从头粘合剂，以瞄准SARS-COV-2 RBD。首先，我们使用MASIF位点来预测RBD上的表面位点，其易被蛋白质粘合剂参与。我们选择了一个不同于ACE2结合区域的位点，但是重叠以使推定的粘合剂可以抑制ACE2-RBD相互作用（图2A）。当时，缺乏该站点的粘合剂。我们搜索了数据库的一个子集，该数据库包含来自螺旋片段的1.4亿个表面指纹，以找到可以针对所选位点的结合种子。提供的7,713种结合种子Masif-seed显示了两个突出的特征：（1）没有具有强结合热点特征的残基（例如较大的疏水残基）；（2）在螺旋片段的两个不同方向上结合种子的等效分布，种子与彼此的180°结合（图2B），暗示两种结合模式都是合理的。值得注意的是，结合种子的两种方向在表面指纹水平（补充图5）和序列水平（图2B）上都表现出非常相似的特征。

　　我们将排名最高的结合种子之一合成为线性肽，但使用表面等离子体共振（SPR）检测到未检测到结合相互作用（补充图6）。因此，使用Rosetta矩阵方案，我们确定了与种子的两种结合模式兼容的几个蛋白支架（图2C），将种子热点侧链从顶级种子移植到支架上，并使用了rosetta（V.3.13）（V.3.13），以优化绑定界面（图1C。总共在酵母显示分析中筛选了基于20个支架的63种设计，其相对于天然蛋白质为7-23个突变（扩展数据图3A – D）。从最初的设计中，DBR3_01在酵母显示实验中显示出弱结合。此外，DBR3_01的结合与可溶性ACE2（扩展数据图3E）具有竞争力，这表明粘合剂针对正确的RBD位点。此外，与天然支架蛋白相比，DBR3_01的结合略有增加，并且在设计的界面残基处具有双点突变的变体，进一步支持种子残基参与结合相互作用（扩展数据图3F和补充表2）。接下来，我们试图通过产生两个诱变库来改善设计的结合亲和力：首先，制备了设计的界面中的一个定向库（补充图7），该库产生了DBR3_02，该DBR3_02具有四个突变，而解离常数（KD）为4.6 µm，为4.6 µm，由SPR确定（图2D和补充图7）。其次，我们筛选了一个位点饱和诱变（SSM）文库，该文库富集了三个点突变体，其中一个与第一个文库的突变重叠（补充图8）。将这三个突变添加到DBR3_02中导致DBR3_03，该突变显示为80 nm，折叠并稳定（图2D和补充图9）。这里， 我们是从酵母显示器观察到的计算设计的粘合剂开始的，但无法通过SPR检测到，在引入6个突变后，我们观察到了结合亲和力的60倍以上。突变全部发生在设计的结合螺旋中。在这些突变中，位于界面核心的A17G和S20A似乎分别缓解了空间冲突并分别减少了埋藏不满的极性原子。

　　为了在结构上表征DBR3_03的结合模式，我们在复合物中以2.9Å的局部分辨率解决了设计中设计的低温电子显微镜（Cryo-Em）结构（图2E和补充图10-12）。该结构证实了两个伙伴的预测结合位点。重要的是，粘合剂采用了螺旋结合种子的方向，而Masif的指纹描述符（下方向）对螺旋结合种子的偏爱不太支持（图2B）。值得注意的是，当在两个方向上分析界面时，初始设计DBR3_01显示出相似的指标（补充图5），指出了未结合的停靠型问题类型的表面指纹的已知局限性10。这使我们使用另一种最先进的蛋白质对接方法Alphafold Multimer26来预测DBR3_03与Spike RBD的复合物，并且我们获得了Alphafold预测和实验结构之间的1.4ÅIRMSD（图2E）。该结果纯粹是基于结构特征和利用大型序列结构数据集进行结构预测任务的机器学习技术之间的协同作用的有力演示。在结构级别，DBR3_03与RBD的埋入界面面积为1,452Å2（埋在综合体两侧的表面积），该面积比抗体的平均埋入表面积小得多（大约为2,071±456Å2）（约271±456Å227），但仍导致较高的互动互动互动。RBD通过小残留物，由21％的主链和79％的侧链接触组成。伪病毒代理分析28 （图2F，G，扩展数据图4A和补充表3）。我们将设计的广度和效力与临床认可的单克隆抗体的广度和效力进行了比较。在无病毒测定中，我们观察到FC – DBR3_03具有可比的效力（REGN10987），一种是临床上用于野生型（WT）尖峰的抗体，并且与Omicron菌株绑定，而RGN87没有RGN87（扩展数据图4A）。测试了伪病毒测定中的中和活性，FC – DBR3_03中和Omicron，尽管不如Astrazeneca临床认可的抗体混合物有效（图2G）。冷冻EM结构表明，DBR3_03-RBD（WT）复合物与DBR3_03-RBD（Omicron）复合物（补充图13-15）之间的结合模式几乎相同（1.4Å主链RMSD）。重要的是，FC – DBR3_03对许多SARS-COV-2变体显示出非常广泛的反应性（图2F），这归因于靶向位点的序列保护和设计的小结合足迹。该设计对Delta，Lambda和Kappa变体中存在的L452R/Q突变很敏感（图2F和扩展数据图4B），但引入了单点突变（L24G），以减轻L452R和L452R和粘结剂之间的冲突，从而导致设计与Delta的设计结合到Delta（扩展数据图4C）。我们的结果突出了表面指纹方法的值，以揭示病毒蛋白中的靶位点以及随后设计具有广泛活性的功能抗病毒药的值。