所有动物实验均由爱荷华大学的机构动物护理和使用委员会批准。这些研究中使用的现有转基因模型包括CFTR-KO雪貂3,36和CFTRG551D/G551D雪貂4,37。基于基因型将动物分配到实验组中，并非随机分布。在这项研究中，不需要盲目，因为测定法使用了公正的定量方法。由于难以在使用转基因雪貂时获得性别相等分布的困难，因此不认为性别。没有使用统计方法来预先确定样本量。将雪貂在黑貂涂层的颜色背景上杂交。报告摘要给出了测试的动物年龄。

　　如先前从黑貂雪貂底漆38中所述收集雪貂合子。使用FEMTOTOJET（Eppendorf）将Cas9核糖核蛋白复合物以400ngμl -1的最终浓度注射到zygote pronuclei（约3-5 pl）中。当使用DNA模板促进同源重组时，在最终浓度为40ngμl -1时添加线性DNA。为了组装CAS9/SGRNA核糖核蛋白，将1μMSGRNA与1μMCas9蛋白在IDT双链缓冲液中在室温下孵育30分钟。在TCM-199+10％FCS培养基中培养注射的胚胎过夜至两个细胞阶段，然后被转移到Primipara pseudopregnant Jills39中。这些套件在收养转移后42天自然交付（完整妊娠）。

　　使用Broad Institute GPP和/或CRIRPOR工具设计了针对FOXI1外显子1，FoxI1 3'UTR和CFTR外显子16的SGRNA。表1列出了该项目中使用的所有SGRNA。SGRNA是由通过集成DNA技术合成的体外转录Gblocks生成的，其中包括SGRNA生产所需的所有组件（即T7启动子，目标序列，目标序列，指导RNA支架和终止信号）。使用引物GRNA-FWD和GRNA-REV扩增Gblocks PCR（表1）。将T7-SGRNA PCR产物纯化纯化，并用作使用Megashortscript T7试剂盒（Ambion）进行体外转录的模板。然后，使用Megaclear试剂盒（Ambion）纯化所有SGRNA，并在无RNase水中洗脱。

　　用于插入IRES-CREERT2盒的FOXI1基因同源臂作为具有独特限制位点的Gblock产生，并将其克隆到IRES-CREERT2侧面的质粒中。同样，将包含LOXP位点的CFTR外显子16同源臂合成为gblocks，并将其克隆到质粒侧面外显子16中。在这两种情况下，将无声阻断突变引入了SGRNA结合序列中，以防止HDR后供体碎片的裂解。表1列出了SGRNA序列，基因组靶位点和具有基因组位置的同源臂的长度。

　　如前所述4，从尾夹中产生基因组DNA，并用于PCR对创始人的初始基因分型。Putative FOXI1-KO founder DNA was screened using a set of primers that resided external to the sgRNA cut sites, whereas FOXI1-CreERT2 and CFTRL/L candidate founders were screened using two sets of primers to capture genomic flanking sequences outside the right and left homology arms (that is, one primer internal and another primer external to the homology arm) (Supplementary Table 7).为了确认候选创始人中靶向序列的完整性，进行了另外两种测定：（1）对供体片段和侧翼基因组序列的整个区域进行嵌套PCR进行，并对产物进行了测序；（2）使用限制酶摘要和基因座特异性探针进行了Southern印迹，该探针映射了内源性和转基因衍生的片段的长度，用于插入两臂。还使用了CRE探针来绘制FOXI1-CREERT2基因座。最后，由CFTRL/L和野生型雪貂产生一级成纤维细胞，并用TAT-CRE（或未经处理）处理，以诱导482个碱基对（BP）CFTR EXON-16片段的缺失。通过PCR对琼脂糖凝胶的PCR进行了删除：野生型（1,230 bp），完整的LOXP等位基因（1,298 bp）和删除的LOXP等位基因（816 bp）。

　　FOXI1-KO套件非常脆弱，出生后不久显示头部倾斜/圆圈表型，可能会影响其喂养能力。FOXI1-KO雪貂在生命的早期就有平衡障碍，这可能是由于内耳缺乏pendrin（SLC26A4）表达以及内淋巴室的膨胀。由于形成囊肿而导致的肾功能受损也影响了整体健康。开发了一种饲养方案来增加FOXI1-KO套件的生存能力。从出生开始，每24小时称重一次FOXI1-KO套件。那些表现出体重增加下降的动物每4-6小时补充口服婴儿配方奶粉（雅培实验室）。根据发育中的试剂盒和兽医的重量和大小，调整了Elecare手饲料的频率和数量。当试剂盒展示能够吃固体食物的能力（大约5周龄）时，除了手喂养外，还提供了罐装补充饮食（Purina）。在8周大的时候断奶后，它们被过渡到由固体食物（Marshall Farms），一种水合的固体食物混搭和罐装猫食品（Purina）组成的固体饮食。

　　将FOXI1-CREERT2雪貂交叉至Rosa-TG Cre Reporter雪貂19，以获得谱系跟踪的半合基后代。体内FOXI1-CREERT2谱系谱图是由五个顺序的每日腹膜内腹膜腹膜注射（20 mg kg-1），至1个月大的5个月大的成年雪貂。7-10天后，将组织固定在4％PFA中24小时，在蔗糖中冷冻保护并嵌入OCT块中或加工以进行全座染色。冷冻切片（8μM）用于免疫荧光，并用DAPI溶液安装进行共聚焦成像。For lineage tracing in vitro, ALI cultures derived from FOXI1-CreERT2::ROSA-TG ferret basal cell cultures were treated with 2 μM 4-hydroxytamoxifen (OH-Tam) in ethanol or vehicle alone (ethanol) using two different experimental procedures: (1) For scRNA-seq experiments, cultures were treated with OH-Tam during differentiation at ALI from day 1 to day 17（每隔一天变化一次）和在ALI的21天收集细胞。之所以这样做，是因为它在完全分化后产生了更多的EGFP+细胞。（2）对于使用YFP传感器的功能性卤化物传输研究，在搬到ALI之后，在第14天开始用ALI培养物处理ALI培养物，并在功能成像研究之前2天（在ALI的22至28天）之前，在没有OH-TAM的情况下将培养物移至新板上。

　　在95°C下用10 mM柠檬酸盐缓冲液处理85°C的石蜡切片（5μM）和冷冻切片（8μm），持续20分钟，并用PBS中的0.1％Triton X-100透化。然后将切片在室温下在10％的驴血清/PBS中阻塞1小时，并在4°C下施加初级抗体并在4°C下孵育过夜。然后将载玻片洗涤3次，持续15分钟，并在室温下用二抗孵育1小时。将载玻片洗涤并用DAPI对其进行反染色以进行共聚焦成像。使用了以下抗体：抗BSND（1/500; AB196017，ABCAM），抗Foxi1（1/500; AB20454，ABCAM），抗Keratin 5（1/500; 905501; 905501，Biolegend），biolegend），抗syp（1/200; sc-1/200; SC-177777777770，SATRATET，SANTATANATANE，SATRATANTANETIB fIMIL）（1/1,000，T7451，Sigma-Aldrich），抗ATP6V1G3（1/500，HPA028701，Sigma-Aldrich），Anti-NKA（1/100，A5，A5，DHSB，UIOWA），Anti-Ki-67（Anti-Ki-67）（1/300，AB13970，ABCAM），抗CFTR（1/100至1/300，CFTR抗体596，cftrantibodies.web.unc.edu），抗trpm5（1/300，ACC-045，ACC-045，Alamone），Alamone），Alamone），抗P63（1/300-MonED PORY 600-clONE pORTOR6）（1/300，HPA008246，Sigma），抗MUC5AC（1/300，AB3649，ABCAM），Alexa Fluor 647驴抗小鼠IgG（1/250，A31571，A31571，分子探针），Alexa Fluor 488 Donkey tonkey tonkey tonkey tonkey tonkey tonkey anti-donkey anti-donkey tanke ant-goat goat a exg ig gig（1/25055555055505550555055050505050505岁荧光488驴抗chicken IgG（1/250，703-546-155，Jackson Immunoresearch），Alexa Fluor 488驴抗兔IgG（1/250，A21206，Invitrogen）647驴抗兔IgG（1/250，711-606-152，Jackson Immunoresearch），Alexa Fluor 555驴抗小鼠IgG（1/250，A31570，Life Technologies）。根据制造商的说明进行EDU染色（C10340，用于成像的Click-It Edu细胞增殖套件，Alexa Fluor 647 Dye）。

　　将雪貂气管和解剖的叶内气道固定在4％多聚甲醛中，然后在PBS中洗涤3次30分钟。然后可以将固定的雪貂气管在-20°C下将其放在70％乙醇中以进行扩展。Staining for ionocyte markers used CFTR (cftrantibodies.web.unc.edu, CFTR antibody 596, working dilutions: 1:100 to 1:300), ATP6V1G3 (Millipore Sigma, HPA028701, working dilution: 1:300) and NKA (dshb.biology.uiowa.edu, ATP1A1,A5，工作稀释液：1：100至1：300）。TRPM5（Alamone，ACC-045，工作稀释：1：300）和PNEC标记的染色使用SYP/突触蛋白（Santa Cruz Biotechnology，SC-17750，工作稀释：1：100）。样品需要在55°C的柠檬酸缓冲液（10 mm柠檬酸钠，0.05％Tween 20，pH 6.0）中进行抗原检索，并在免疫染色之前搅拌过夜。然后将雪貂气管和叶内气道用PBS洗涤3次，每次20分钟，并在37°C下孵化3次缓冲液（20％驴血清，0.1％Triton X-100和1 mM CaCl2）过夜。然后将雪貂组织与原代抗体（溶解在稀释缓冲液中：1％驴血清，0.1％Triton X-100和溶解在PBS中的0.1％Triton X-100）在37°C下孵育3天，并搅动。然后将气管在PBS中洗涤3次30分钟，并在37°C下与适当的二抗孵育2天，并搅拌。继发性抗体孵育后，将样品在PBS中洗涤3次30分钟，并转移到CE3D组织清除溶液（Biolegend CatalogNo。427704NO。427704），在室温下2-3小时。清除组织后，将样品安装在0.33毫米盖板下的显微镜载玻片（Fisherbrand Superfrost Plus）上，并用大猩猩胶密封边缘，并用粘合剂夹夹住30分钟，以确保粘合粘合剂。Zeiss LSM 880或980共聚焦显微镜用于成像采集。

　　野生型，FOXI1-KO和FOXI1-CREERT2 :: CFTRL/L雪貂的MCC测量是使用正电子发射断层扫描和计算机断层扫描（PET/CT）和68GA-MACRO聚集白蛋白（68GA-MAA）进行的，如前所述40。CFTRG551D/G551D雪貂4在CFTR调制器（VX-770/IVACAFTOR）上饲养或关闭，用作CFTR依赖性MCC的对照。将雪貂用氯胺酮/甲基嗪麻醉，然后插管。插管后，将动物放置在宠物/CT扫描仪的龙门（GE Discovery MI，GE Healthcare）中。获取最初的侦察计算机断层扫描术，以确认在气管远端将气管管的放置放置。启动了动态正电子发射断层扫描（15分钟），并在图像采集的第一分钟中含有50μCI68GA-MACRO聚物蛋白（约1.85 MBQ）和600μM甲基苯胺的盐水快速施用到远端气管中。然后除去注射器，导管和气管管，并连续获取图像15分钟。正电子发射断层扫描摄入之后是计算机断层扫描，用于衰减校正和解剖结构。使用三种方法使用GE Discovery Scanner的软件重建列表模式数据：（1）15分钟的静态图像；（2）具有15×1分钟帧的动态图像；（3）动态图像具有20 s延迟的动态图像，以消除剂量给药前的延迟，然后是60×10 s帧。我们使用PMOD软件v.4.2（PMOD技术）进行了数据分析，并将68GA-MAA的清除量化为示踪剂沉积后的微小间隔的PET/CT量。将数据标准化为示踪剂沉积后第一分钟的兴趣量。在野生型动物中，通常达到10.5分钟的通量高原。此时间点用于计算百分比清除率。

　　使用类似于以前的报道41的酶消化方法分离雪貂气管气道基底干细胞。所有原代细胞均测试了支原体污染阴性的阴性。将这些细胞培养在富含层粘连蛋白的804G条件培养基的塑料板上的肺化培养基（Stemcell Technologies）中。为了使细胞用ACCUTASE（Stemcell Technologies）脱离，并在804G涂层的板上以1：4的分子重新种子，如前所述42。为了在ALI上进行分化，将雪貂的基底细胞接种到肺炎EX和培养基中涂有804G的Transwell膜上24小时，然后将仅放置在Transwell基底侧放置的Pneumacult-Ali培养基（Stemcell Technologies）提升到ALI。然后在21-28天使用培养物进行实验。

　　使用Accumax（Stemcell Technologies）分离出完全分化的雪貂气道上皮培养物，然后进行DNase处理。通过20μM滤网过滤细胞，并在500g的0.04％BSA PBS中颗粒10分钟。通过使用10倍基因组学建议（文档CG00039），使用MAC死细胞去除套件去除了不可生存的死细胞。将单细胞计数在热伯爵夫人计数器上计数，并添加0.04％的BSA/PBS以达到每微片的目标浓度1,000个细胞。在OH-TAM处理的FOXI1-CREERT2 :: ROSA-TG ALI培养物上进行离子细胞富集，然后进行EGFP和番茄阳性细胞分离。使用Becton Dickinson Aria仪器和BD FACSDIVA 8.0.1软件对气道上皮细胞进行排序。根据FSC和SSC门控鉴定细胞（补充图2）。基于与非重生雪貂呼吸道基底细胞的比较，鉴定了番茄和EGFP阳性上皮细胞。基于正向散射和正向脉冲宽度鉴定单细胞。然后将FACS分离的EGFP阳性细胞与番茄阳性上皮细胞混合，以实现约10,000个总细胞进行10倍测序。EGFP-与番茄阳性细胞的比率因谱系标记细胞的产量而变化。测序库是通过以下10倍基因组建议（文档CG000315）生成的。简而言之，将单个细胞和逆转录主混合物分配到凝胶珠中，以对10倍铬控制器的油进行分区。逆转录后，扩增互补的DNA文库，然后分散，然后进行衔接子连接和样品指数PCR反应。图书馆由爱荷华大学基因组学部门在Novaseq 6000平台上进行了测序。

　　短路电流（ISC）测量是使用上皮电压夹和适应的Ussing Chamber系统（生理仪器）进行的。对称缓冲系统用于测量氯化物和碳酸氢盐电流。氯化物缓冲液由135毫米NaCl，2.4 mm K2HPO4，0.6 mm KH2PO4，1.2 mm CaCl2，1.2 mm mgcl2，10 mm右旋糖和5 mm HEPES和5 mm HEPES（pH 7.4）用37°C下的机动。碳酸氢盐缓冲液由118.9毫米葡萄糖酸钠，25 mm Nahco3，2.4 mm K2HPO4，0.6毫米KH2PO4，5毫米葡萄糖酸钙，1毫米葡萄糖酸镁钙和5毫米葡萄糖和5毫米葡萄糖（pH 7.4）（pH 7.4）（pH 7.4），含5％CO2，377°C，377°C。将以下化学品依次添加到顶端腔室中：（1）100 µm amiloride（以抑制ENAC）；（2）100 µM DIDS（抑制非CFTR阴离子通道）；（3）100 µM IBMX和10 µM Forskolin（刺激CFTR的营地激动剂）；（4）10 µm Glyh101（阻止CFTR）。计算每个刺激后的45 s，ISC平均高原测量值的差异被计算为45 s，并表示为响应相应药物的ISC（∆ISC）的变化。12。使用软件获取并分析V.2.3收集数据。

　　使用室内系统（生理仪器）来测量完整的雪貂气管的电生理特性。在解剖过程中，在温暖的F-12培养基（Gibco）下保持雪貂气管。简而言之，收集雪貂近端气管并将其安装在销钉中的“滑块”（P2304幻灯片）中，该钳位于腔室的两半之间，只需小心以处理组织的边缘。然后将组织组装到Ussing室中，并由压力夹固定。对称氯化物缓冲液（135毫米NaCl，2.4 mm K2HPO4，0.6 mm Kh2pO4，1.2 mm CaCl2，1.2 mm mgcl2，10 mm MgCl2，10 mm右旋糖和5 mm HEPES，HEPES，pH 7.4），并在37°C和空气中维持样品。将以下化学品依次添加到顶端腔室中：（1）100 µm amiloride（以抑制ENAC）；（2）100 µM DIDS（抑制非CFTR阴离子通道）；（3）100 µM IBMX和10 µM Forskolin（刺激CFTR的营地激动剂）；（4）10 µm Glyh101（阻止CFTR）。使用软件获取并分析V.2.3收集数据。

　　Taqman实时PCR用于定量mRNA。所有引物和探针均通过集成的DNA技术合成，并在补充表8中提供了引物序列。使用Rneasy Plus Minikit（Qiagen）进行总RNA分离，并使用纳米球或Qubit Assay测量RNA浓度。然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）合成cDNA。

　　完全分化的ALI培养物源自野生型，CFTR-KO（参考文献36）和FOXI1-KO原发性气管基底细胞。如前所述，评估了ASL高度和流体吸收率。12。简而言之，通过以上过量的PBS洗涤，从Ali培养物的顶部表面去除过量粘液，然后在启动实验之前，将它们平衡约16小时。然后，将10,000 da Texas的红色 - 二克染料（在18μlPBS中）应用于Ali培养物的顶部表面。然后在培养中心的五个不同的旋转轴上拍摄XZ（线）图像，在添加染料之后，然后在24小时内再次添加染料，然后在各个时间点再次添加。在共焦点上成像时，腔室在37°C下的5％二氧化碳大气中保持了加湿。为了在添加流体后的第一个小时内吸收研究，未移动腔室，并在五个方向轴上成像一个位置。对于在4和24小时的ASL高度测量值，每个样品的五个旋转轴上成像在Transwell周围的五个位置。计算每种XZ扫描的得克萨斯红色二克染料的平均ASL高度和体积/单位面积，然后为每个Transwell平均每个测量值的25个值。如前所述，通过将ASL高度转换为具有定义的体积和直径的均匀圆柱体来计算流体吸收率。然后使用ASL体积与时间的图表来计算流体吸收率（NL min -1 cm -2）作为在添加流体后的前20分钟内产生的线性斜率。平衡的ASL高度为24小时。

　　完全分化的ALI培养物源自野生型，CFTR-KO（参考文献36）和FOXI1-KO原发性气管基底细胞。对ASL pH的测量对先前描述的15进行了轻微的修改。简而言之，使用比率pH指示剂SNARF偶联的葡萄染料（Thermofisher Scientific）来生成pH标准曲线，并直接在分化的ALI培养物上测量顶端pH。在基底外侧HCO3缓冲液中维持ALI培养物，并在37°C的5％CO2大气中加湿显微镜室。通过5 µm的网格直接将融合的葡聚糖巧克力粉直接应用于顶部表面。共聚焦显微镜（Zeiss LSM 880）以488 nm的速度激发SNARF染料，并在580 nm和640 nm处测量荧光强度，从每个ALI培养的6-8个领域。如前所述43，使用标准曲线将荧光比转化为pH值。

　　完全分化的ALI培养物源自野生型，CFTR-KO（参考文献36）和FOXI1-KO原发性气管基底细胞。如前所述，测量ASL粘度14。简而言之，在荧光恢复（FRAP）（ALI分化的19天）后，用PBS的培养上皮的顶表面用PBS洗涤48小时。然后，使用100 µm的网格直接将FITC-二克粉（70 kDa，Sigma-Aldrich）直接应用于Ali培养物的顶部表面。2小时后，使用共共聚焦显微镜在37°C的5％二氧化碳大气中，在加湿的腔室中测量上皮ASL粘度（Zeiss 880）。通过将488 nm激光强度提高到100％，将8×8μm2正方形的区域被光漂白。然后获取图像，直到达到最大恢复。选择了六到九个区域，以从每个transwell的不同位置进行恢复曲线。使用Zeiss软件FRAP确定荧光恢复半个时间（T1/2）。

　　先前描述的卤化物敏感的YFP-H148Q/I152L/F46L cDNA20用于替换慢性病毒生成的plenti-loxp-sdred-lox-sred-loxp-loxp-egfp质粒（addgene）（扩展数据图2C）。FOXI1-CREERT2和FOXI1-CREERT2 :: CFTRL/L雪貂气管基底细胞用Lenti-loxp-dsred-loxp-YFP病毒转导，并由FACS选择DSRED+转导细胞。使用这些基底细胞建立了Ali培养物，然后从第14天开始用2μMOH-TAM（Sigma-Aldrich）处理，并在成像前2天终止。然后使用YFP标记的离子细胞在第22-28天进行成像研究（扩展数据图2D）。阴离子的传输测量是根据使用该YFP传感器20的先前描述的方法调整的，并用于研究阴离子吸收（顶→碘化物的基底外侧运动）和分泌（基底外侧→碘化物的顶部运动）。对于所有实验，显微镜腔室在37°C的5％CO2环境中保持不变。阴离子吸收研究：将ALI培养物的基底外侧浸入PBS（137 mM NaCl，2.7 mM Kcl，0.7 mm Cacl2，1.1 mm MgCl2，1.5 mm Kh2po4，8.1 mm Na2hpo4，pH 7.4，pH 7.4），同时维持量身粉量和基线的均值和基线。然后通过添加18μlI -PBS缓冲液（137 mm NAI，2.7 mm KCl，0.7 mm CaCl2，1.1 mm MgCl2，1.5 mm kh2po4，1.5 mm kh2po4，8.1 mm na2hpo4，pH 7.4）来启动Cl-至I-交换。研究。使用类似的条件，添加10 µM GlyH101（抑制CFTR）或将Na-葡萄糖酸盐交换为Cl-至18μLPBSPBS缓冲液的顶端。使用HQ滤光片集（488 nm激发，514 nm发射）连续获得离子荧光强度（Zeiss LSM 880）连续获得的离子荧光强度。。阴离子分泌研究在加湿条件下：ALI培养物的基底外侧浸入CL -PBS中，并获得了基线测量。然后，通过用含有100 µM IBMX/10 µM Forskolin的I -PBS灌注基底外侧的Cl-到I-交换。这些实验是在Humified条件下进行的。用脱水的ASL：培养物灌注非杀菌的5％CO2 20分钟，在存在基底外侧CL-PBS和基线测量的情况下，将ASL脱水20分钟。然后，通过用含有100 µM IBMX/10 µM Forskolin的I -PBS灌注基底外侧的Cl-到I-交换。然后在不存在或存在基底外侧的闪光（100μM）的情况下将Cl -PBS（18μL）添加到顶端腔室中以阻断NKCC1。为了评估离子细胞基底外侧I-摄取的顶端CL-依赖性，18μl葡萄糖酸PBS（137 mm葡萄糖酸钠，2.7 mM KCl，0.7 mm CaCl2，1.1 mm MgCl2，1.1 mm MgCl2，1.5 mm kh2po4，8.1 mm kh2po4，8.1 mm na2 ha2hpo4，ph 7.4）ph 7.4）在YFP荧光强度迹线的曲线上评估I-转运的定量为面积，该曲线在缓冲液交换前的起始YFP强度归一化。为了量化不同条件和基因型之间离子传输的差异，我们使用R中的“ PKNCA”封装在曲线计算下拟合了一个区域，并将该计算修改为曲线上的区域。可以根据要求获得修改的R脚本。

　　先前详细描述了μoCT和定量图像分析的方法44,45。对野生型和FOXI1-KO气管组织进行了μOTCT的测量，该组织已将其运送到阿拉巴马大学。简而言之，通过μoCT直接测量没有外源性染料的ASL深度，PCL深度，CBF和粘膜纤毛运输速率。然后处理实时μoct图像进行定量分析。通过ImageJ中的几何测量确定ASL深度和PCL深度。通过傅立叶分析测量CBF。通过通过粘液投射横截面并使用在多层上经过的时间来量化粘膜循环运输速率。在雪貂近端气管的粘膜表面上随机选择的位置可获得μoct图像。

　　在NCBI Mustela Putorius Furo注释版本102中，所有27,912个基因中只有16,579（59.4％）用基因符号正确注释。我们使用NCBI Entrez数据库来识别具有注释基因名称或别名的另外825个基因，将标记基因的数量增加到17,404（62.4％）。接下来，从集合数据库中的雪貂参考基因组（musputfur1.0）的单个基因序列与人（grch38.p13）和小鼠（GRCM39）基因组对齐，使用“ Msaclustalomega”功能从多个序列比对（MSA）中的任何序列中的序列均更大的序列置于序列的函数。在NCBI Mustela putorius furo注释版本102中。蛋酒贴剂是使用当前参考中蛋白质序列上的钻石算法运行的。将直系同源物映射到雪貂，鼠标和人类被写入输出文件。在映射一个物种的多个直系同源物的情况下，选择了最高分数的直系同源物。为了将集合基因组上的多种物种比较文件与在NCBI基因组上运行的文件结合，使用GTF文件将集合蛋白ID添加到多种物种比较文件中。接下来，将两个文件使用在Relemble蛋白ID上的R中的“合并”组合在一起。以这种方式注释雪貂基因，以这种方式鉴定了1,655个基因，总计达到19,059（68.3％）（补充表10）。由于这些变化，SCRNA-seq研究中的中值读取分配为71.3％（扩展数据图4A）。

　　为了生成数字基因表达矩阵，我们首先对原始测序数据进行了反复的反复。随后，我们对这些反复读物的读数进行了伪一致，以定制参考基因组。该参考基因组是通过将报告蛋白EGFP和TDTOMATO与​​NCBI Mustela putorius furo注释版本组合组合来组装的。在此过程中，如上所述，未经注释的基因被部分重命名。使用Kallisto Toolkit（V.0.48）46进行了伪对齐和唯一分子标识符（UMI） - 策略。我们使用“液滴”软件包的kneeplot函数估算了非空液滴的数量，该函数检测到总共94,664个单元。对于每个细胞，我们量化了检测到的基因的数量（至少有一个UMI），然后排除了所有检测到的基因少于2,000个基因的细胞，从而产生了77,099个高质量的细胞，来自n = 16个Ali培养物，来自n = 12个供体雪貂。通过将基因I的UMI计数值除以细胞j中的UMI计数的总和来计算细胞j中基因I的表达值EI，J的表达值EI，j在覆盖范围的差异中归一化，然后乘以10,000，以创建TPM样值，最后计算使用标准的'seurat function's seurat'r the seurat'r prognall'r r theceurate'r prognce'r r ponfact'为了将所有数据集合并在一起，使用“ IntegratedAta”函数47中的Seurat v.3中的内置数据集成工具进行了批处理校正。输出是一个校正的表达矩阵，用作进一步分析的输入。

　　使用拟合到样品检测部分的逻辑回归选择高度可变的基因，使用每个基因的UMIS总数作为预测因子。鉴于该基因的读取总数（即它们是特定于细胞类型，治疗，状况或状态），该曲线中的离群值的样本比例低于预期的。选择了2,000个具有最大偏差的可变基因，既可分析完整数据集和电离细胞的子集。然后使用这些变量基因计算主成分分析，并使用前十个组件的得分计算最近的邻居图（k = 20），这是聚类的输入。为了通过其表达来聚类单个上皮细胞，我们使用了使用Seurat的“ Findclusters”功能实现的Louvain无监督聚类算法。我们在77,099个单元格的主数据集上使用了r = 1的分辨率参数。根据人和小鼠气管上皮子集，使用已知标记基因映射簇为细胞类型（扩展数据图4B）。将肺部离子细胞取代以检查成熟类型的可能异质性（图4）。对于肺部离子细胞的亚聚集，我们使用r = 0.25作为离子细胞亚型并定义了三组，我们将其注释为A型，B和C离子细胞。

　　使用两部分的“障碍”模型进行所有差分表达测试，以控制使用R package MAST48实施的技术质量和雪貂 - 捕雪剂变化，并使用似然比测试来评估差异表达的重要性。通过使用R函数“ p. adjust” 49控制FDR，进行了多个假设检验校正。为了识别细胞特异性基因，我们使用了先前描述的50的过程。简而言之，在簇的所有成对组合之间进行了差异基因表达测试。对于给定的细胞类型，使用两个严格的标准对推定标记基因进行排名：最大FDR Q值（QMAX）和最小log2转换的倍数变化（FCMIN），这代表了所有比较中最弱的效果和显着性。使用QMAX = 0.05，FCMIN = 0.25获得了细胞类型的特征基因（图4，扩展数据图4和图4和补充表1和3）。为了定义更相似的离子细胞亚型的签名基因，使用了更宽松的标准，在成对测试QMAX = 0.05和FCMIN = 0.25的Fisher的组合P值（Qfisher）中（图4和补充表1）。离子频道清单是从英国爱丁堡大学的《药理学指南》（www.guidetopharmacology.org）获得的。

　　为了评估在不同条件下细胞分数变化的重要性，我们使用了使用R套件“ BRMS”估算的贝叶斯负二项式回归。这使我们能够对每个供体中检测到的每个细胞类型的数量进行建模，并在控制生物学重复（供体雪貂）之间控制遗传扰动的效果。对于每种细胞类型，我们使用负二项式分布对每个供体中检测到的细胞数量进行建模。检测速率（即该单元格类型的相对比例）是通过使用从给定供体的所有单元格的自然日志建模的（扩展数据图4D）。为了测试FOXI1缺失的效果，将供体基因型添加到回归模型中，作为分类协变量（扩展数据图6G）。使用90％，95％和99％的后可信区间评估细胞类型比例变化的显着性，以使基因型协变量的主要作用。

　　为了评估野生型（FOXI1-CREER FACS富含和未添加的样品）和FOXI1-KO样品（图6i的扩展数据）之间表达CFTR表达气道上皮细胞比例变化的重要性，我们不是从所有样品中汇总的细胞，而不是平均相对于样品的平均分析。一些样品显示某些细胞类型的比例较低。这会导致某些细胞类型数量少的样品伪装地降低了表达CFTR的细胞的平均比例（例如，在非增强样品中的单个离子细胞中的单个离子细胞，导致CFTR表达0％的比例）。r软件包“ prop.test” v.3.6.2用于计算统计显着性。由于使用了统计方法，因此不可能在图6i中的图表中绘制图形上的各个数据点。

　　为了比较罕见的细胞类型（图5），将来自培养的雪貂气道上皮细胞（本研究）的单细胞数据与来自小鼠气管和人类气道上皮细胞的已发表的单细胞数据合并，并使用SEURAT数据积分合并，如上所述。在降低维度降低之前，使用单向方差分析鉴定出所有被物种截然不同的基因。在第90个百分位上具有F统计量的基因（表明通过物种差异表达的高置信度）被去除。细胞类型标签（图5A）以及物种注释从各自的研究中获取（图5B）。为了计算每种物种的稀有细胞类型之间的转录相似性，计算了一组可变基因（定义为上述）的所有成对细胞 - 细胞皮尔逊相关性，然后使用每种细胞类型和物种组合中的平均值进行汇总（图5i）。

　　我们从我们的雪貂scrna-seq数据中分离了1,497个簇细胞，离子细胞和PNEC，以检查其从假定的公共祖细胞到成熟的稀有上皮子集的进展。使用Scanpy53实施的PAGA算法34在定义了使用Leiden算法产生的无监督簇后，用于将细胞投射到低维歧管中。然后使用弹性主图35通过PAGA坐标空间来安装分支树。卸下虚假的单节点分支。稀有祖细胞群集中的节点被手动选择为使用Elpigraph r软件包计算的假次计算的根节点。

　　将雪貂气管和肺在4％多聚甲醛中后缀18–24 h。固定后后，将组织在蔗糖中冷冻保护，嵌入为冷冻的OCT块，然后切成7–15-μm厚的切片。根据制造商的建议，使用了RNASCOPE多重荧光试剂盒（高级细胞诊断）。多重RNASCOPE分析使用三个靶标分子（CFTR，FOXI1，EGFP）使用三个探针集，并且在各种组合中使用了离子组织亚型的标记（A：CFTR，FOXI1，SLC12A2或BSND; BSND;类型cftr，slc12a2;探针分别称为通道1，通道2和通道3探针。所有扩增和检测步骤均使用套件说明完成。最后，用荧光素（通道1），氰氨酸3（通道2）和氰氨酸（通道3）检测多重测定探针集。用共聚焦显微镜（Zeiss 880或Zeiss 980）获得组织的图像。使用ImageJ将比例尺添加到每个图像中。使用ImageJ软件可视化图像。用于RNASCOPE的探针（高级细胞诊断）：CFTR（C1），EGFP（C2），SLC12A2（C2），BSND（C2），KRT7（C3）和FOXI1（C3）（C3）。

　　所有非生物信息学实验结果均表示为平均值±S.E.M.，R 4.2.0（www.r-project.org）和Prism 9（GraphPad）用于统计分析。适当的时候进行了学生的t检验和单向方差分析。p值小于0.05被认为具有统计学意义。SCRNA-seq数据的统计分析在生物信息学部分中描述了。

　　本研究中生成的所有独特和稳定的试剂和转基因雪貂都在机构MTA下可用，而不受相应作者的非营利机构的限制。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。