对于结构研究，蛋白质在expi293 gnti-细胞（Thermo Fisher）中表达。为了结合研究和功能研究，蛋白质在expi293f细胞（Thermo Fisher）中表达。所有蛋白质在含5％CO2的加湿环境中在37°C下表达。转染后3-4天收集细胞培养上清液，并在20 mm HEPES pH 7.4中使用Ni-NTA亲和色谱从上清液中纯化单个蛋白质和复合物，并用150 mM NaCl（HBS 20/150 pH 7.4）（HBS 20/150 pH 7.4），用50 mm咪唑（用于洗涤）和200毫米ImimIdiDazOle（用于洗涤）。然后使用SuperDex 200增加10/300 GL柱（Cytiva）在HBS 20/150 pH 7.4中进一步纯化蛋白质。

　　这项研究使用了人类细胞因子和受体序列。IL-25氨基酸30至177（30-177）用Igκ信号肽和C端HRV3C-蛋白酶裂解（3C）AVITAG-6×PEG BACMAM Vector33中的标签表达（3C）AVITAG-6×他的标签，该标签是由Haemagglutin和C-6的peptiminal（HA）信号替代者（HA）信号替代者（HA）信号替代者和C-6的标签。Woodchuck肝炎病毒在慢病毒载体中转录后反应元件（WPRE）。IL-17A（24–155）用HA信号肽和C末端3C-Avitag-6×His tag在PD649载体（ATUM）中表达。IL-17RB（1-288）用C末端的3C蛋白质-8×他的标签表示在PVLAD6 Vector34中或C-terminal avitag-6×他的标签在PD649载体中。IL-17RA（1-317）用C末端3C-蛋白酶-8×他的标签表达在PVLAD6载体中，或用C-末端3C-蛋白酶-8×他的标签控制在EF-1α启动子中，并在肺炎病毒载体中控制了WPRE。IL-17RC（1-468）（同工型2）（UniProt标识符Q8NAC-2）用C末端3C-蛋白酶8×His tag在PVLAD6载体中表达。

　　为了生物素化，使用生物素连接酶BiRA将具有AVITAGS的蛋白定位为特定于生物素，并使用尺寸 - 分类色谱法纯化。

　　结合研究是在Biacore T100（Cytiva）上进行的。使用BIACORE T100控制软件2.0.4收集SPR数据。将特定于特异性生物素化的IL-17RA，IL-17RB或不相关的负面控制蛋白固定在串联的S传感器芯片SA（Cytiva）上的大约300个响应单位（RU）。对于每个结合周期，使用2 M MGCL2的再生条件。使用BIACORE T100评估软件（Cytiva）处理数据。使用稳态亲和力分析计算解离常数。

　　细胞系来源如下：用于单分子成像的HeLa细胞来自德国的微生物和细胞培养物GMBH的收集（ACC 57）；Expi293f细胞（Thermo Fisher）；expi293f gnti-（Thermo Fisher）;IL-17C HEK-BLUE NF-KB报告基细胞（Invivogen）。对细胞系进行认证如下：HELA细胞（德国的微生物和细胞培养GMBH的收集），Expi293F细胞（Thermo Fisher），Expi293f Gnti-（Thermo Fisher）（Thermo Fisher）和IL-17C Hek-Blue NF-κB报告细胞（Invivogen）由供应商保证，以及其他辅助作者的表现不得保证。用于单分子成像的HeLa细胞对支原体（PCR）进行负测试。这项研究的作者未测试用于蛋白质生产的细胞（Thermo Fisher）和Expi293f GNTI-细胞（Thermo Fisher）对支原体污染的测试。制造商测试了IL-17C HEK-Blue NF-κB报告细胞（Invivogen）的支原体污染，并且该研究的作者未进行其他测试。

　　IL-17C HEK-BLUE记者细胞（Invivogen）稳定地表达人类IL-17RA，ACT1，NF-κB诱导的分泌的胚胎碱性磷酸酶（SEAP）记者基因和内源性IL-17RB用于确定IL-25或IL-17rb Mutants刺激的NF-κB活性。通过细胞外HA标签的表位染色来定量外源IL-17RB变体的表面表达，并显示出重叠但表达的差异很小。双突变体显示出大大降低的信号传导功效，这不是表面表达的差异来解释的。对于IL-25分析，在有不同剂量的IL-25（WT或突变体）存在下，将25,000个细胞播种过夜，将25,000个细胞播种到96孔平底微孔板中。对于IL-17RB测定，用编码WT或突变体IL-17RB的质粒转染细胞，然后在转染后WT IL-25 24 h存在下播种到96孔板中。过夜刺激后，根据制造商的指示（Invivogen）使用Quanti-Blue试剂（Invivogen）确定SEP活性，并在Spectramax Paradigm Plate读取器上使用SoftMax Pro V7.1（分子设备）在Spectramax Paradigm Plate读取器上以640 nm的吸光度读取。根据制造商的指示维护细胞。

　　IL-17C HEK-BLUE报道细胞（Invivogen）使用lipofofectamine crisprmax Cas9 Trectect facter（Thermo Fisher）将靶向IL17RA或IL17RB和Cas9核酸酶（Synthego）的单引导RNA和Cas9核酸酶（Synthego）转染在12孔板中。转染后五天，将细胞在有限稀释下播种成10厘米的菜肴。2-3周后，将分离良好的单个菌落（通过克隆圆盘）转移到24孔板中，然后扩展并筛选以丧失受体表达和对IL-25的反应性。

　　外周血单核细胞（PBMC）是从斯坦福血液中心的健康供体获得的。在组织收集之前，从捐助者那里获得了书面知情同意，并确保了斯坦福血液中心的道德监督。

　　从斯坦福血液中心获得了来自健康捐助者的PBMC。使用Ficoll密度离心（Cytiva）从供体LRS室中分离人PBMC，并冷冻保存直至使用时间。该测定是根据参考文献进行的。35具有以下修饰：在有1 nm MSA-HIL-2和0.7 nm（大约10 ng ML-1）RHTSP（PEPROTECH）的情况下，在96孔圆底板中刺激PBMC。72小时后，收集上清液，并使用Softramax Paradigm Plate读取器使用Softmax Pro V7.1（分子设备）在Spectramax Paradigm读磁器上以450 nm的吸光度来确定IL-5的浓度。

　　对于细胞表面标记，IL-17受体使用PSEMS矢量（包括Igκ（PSEMS-Leader）的信号序列）36将N端融合到合适的标签中。IL-17RA（24–866）与非荧光单体GFP（MXFP）37融合；IL-17RB（18-502）与Alfa-Tag38融合在一起。如前所述36，对HeLa细胞（ACC 57，DSMZ德国）进行了培养并瞬时转染。在成像前至少10分钟之前，以2 nm和2.5 nm的浓度分别以2 nm和2.5 nm的浓度添加了抗GFP和抗Alfatag纳米型位点，该位点通过C末端半胱氨酸30分别添加了ATTO 488，CY3B，RHO11或ATTO 643。

　　单分子成像是使用配备有频谱图像分配器（DualView，Optical Insight）和背面鲜艳的电气乘电乘以CCD摄像头（IXON DU897D，IXON DU897D，andor Technology）的倒置显微镜（IX71，Olympus）的双色总内反射荧光显微镜进行的。通过与561 nm激光（Crystalaser；约32 W CM-2）和642 nm激光器（Omicron：Omicron：约22 w cm-2）同时照明荧光团。每帧32毫秒的时间分辨率记录了每个单元的150帧的图像堆栈，每个实验中至少记录了10个单元格。在成像之前，将配体孵育15分钟。所有成像实验均在室温下进行。

　　使用内部开发的MATLAB软件（Slimfast4C，https://zenodo.org/record/5712332）评估双色延时图像。基于基于基准标记的校准的通道注册后，使用多目标跟踪算法39定位分子。通过时空聚类分析过滤固定发射器40。为了进行同步，应用了100 nm的截止半径内的逐帧共定位，然后使用Utrack41跟踪共定位的发射器。分子共同扩散10帧或更多帧被确定为二聚体。基于共定位的粒子的比例确定均聚二聚化和异二聚化的相对水平。使用均方根的平方位移分析对所有寿命大于10帧的轨迹分析从合并的单轨迹确定扩散性能。通过线性回归确定扩散常数。

　　将3μL的IL-25 – IL-17RB，IL-25 – IL-17RB – ILB – ILB – ILB – IL17RA或IL-17RA – IL-17A – IL-17RC配合物应用于发光的QuantaFoil或Auultrafoil（1.2/1.3）网格。IL-25 – IL-17RB，IL-25 – IL-17RB – ILB-17RA网格在100％湿度下被污染1-2 s，均为-15，并使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher）将其倒入液体乙烷中。对于IL-17RA – IL-17A – IL-17RC复合物，在玻璃化之前添加了0.01％氟麦芽糖苷（Anatrace）；将网格在100％的湿度下将3.5 s印迹，偏移为-1，并使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher）陷入液态乙烷中。IL-25–IL-17RB and IL-25–IL-17RB–IL-17RA grids were imaged on a 300 keV Titan Krios cryo-electron microscope (Thermo Fisher) equipped with a K3 camera (Gatan) at the Stanford Cryo-EM Center (cEMc) and IL-17RA–IL-17A–IL-17RC grids were imaged on a 300 keV Titan Krios在霍华德·休斯医学研究所（HHMI）Janelia Research Carkus Cryo-EM设施中配备了K3摄像头（GATAN）的冷冻电子显微镜（Thermo Fisher）。在校准的放大倍率上收集视频，该视频对应于CEMC处的每个物理像素为0.8521Å，Janelia的每个物理像素1.06Å。将剂量设置为每Å2总计50-53个电子。使用Serialem进行自动数据收集，其标称散热范围以-0.8至-2.2μm的增量设置。所有网格均在0°的阶段倾斜下成像。在40°倾斜和IL-25 – IL-17RB – IL-17RA网格的阶段倾斜度下，还对IL-25 – IL-17RB网格进行成像，并在35°的阶段倾斜下成像。

　　使用CryoSparc v3.1.0或v3.2.0（参考文献42）处理视频。视频经过运动校正，确定了对比度传输功能，并使用CryoSparc实时处理功能选择了粒子。在此处理过程中，将显微照片汇总到物理像素尺寸。

　　所有2D分类和3D重建均使用CryoSparc v3.1.0或v3.2.0进行。对于IL-25 – IL-17RB 2：2二进制复合物，进行了倾斜状态和无参考的2D分类，将颗粒分开，在定义明确的类中留下1,125,580个颗粒。从这里，选择了51,000 0°倾斜颗粒和83,439 40°倾斜颗粒的子集以生成一个从头算模型。然后，使用1,125,580个粒子堆栈中，将此从头算模型用于针对垃圾类别的两轮迭代异源精炼。这导致了一个具有712,571个颗粒的类，当用不均匀的修补剂精制时，分辨率为3.53Å43。在2：2络合物周围的宽敞掩膜中用于局部改进，并在中心质量处用支点进行支点，从而产生了3.43Å的重建。然后使用每颗粒运动校正再次校正颗粒。运动校正后，再次进行局部细化，导致3.18Å的重建。然后使用cosmic2,45 Web服务器上的DeepeMhancer44锐化了该地图。

　　对于IL-25 – IL-17RB 6：6二进制复合物，初始处理与2：2复合物一样，以生成初始2D平均值。在这一点上，将截止和倾斜的颗粒组合在一起，并以更大的盒子尺寸重新提取。运行二维分类，并选择了包含明显6：6复合物的类，留下297,300个颗粒。选择颗粒以生成三个Ab的启动模型，然后用一轮异质细化进行处理。这导致了一个具有131,696个颗粒的类，当用不均匀的修补剂精制时，分辨率为4.39Å43。然后使用cosmic2,45 Web服务器上的DeepeMhancer44锐化了该地图。

　　对于IL-25 – IL-17RB – IL-17RA 2：2：2三元复合物，通过其倾斜状态将颗粒分开，并进行无参考的2D分类，并选择了42,208 0°倾斜颗粒和55,376 35°倾斜粒子的子集，以使用C2对称的AB启动模型，选择了55,376 35°倾斜粒子。然后使用1,287,497个粒子堆栈中使用了针对垃圾类别的四轮迭代异源细化，将此从头算模型用于四轮迭代异质细化。这导致了一个具有509,311个颗粒的类，当用不均匀的修补剂精制时，分辨率为3.86Å43。然后使用每颗粒运动校正再次校正颗粒。运动校正后，再次进行了不均匀的细化，导致3.66Å的重建。然后使用cosmic2,45 Web服务器上的DeepeMhancer44锐化了该地图。

　　对于IL-17A – IL-17RA 2：2二进制复合物，进行无参考的2D分类，并选择了323,298 0°倾斜颗粒的子集以生成依据模型。然后，使用6,529,311个颗粒，将该模型用于针对垃圾类别的四轮迭代异质改进，代表三元络合物的类别。这导致了一个具有2,986,310个颗粒的类，当用不均匀的修补剂精制时，该类别的分辨率为2.51Å43。然后使用DeepeMhancer44锐化了该地图。

　　对于IL-17-RA – IL-17A – IL-17RC 2：2：1三元复合物，无参考的2D分类，并选择了代表不同三元视图的98,949 0°倾斜粒子的子集以生成缩写模型。然后，使用6,529,311个颗粒，将该模型用于六轮迭代异质改进，并用代表二进制复合物的类别代表二进制复合物。这导致了一个具有542,344个颗粒的类，当用不均匀的修补剂完善时，分辨率为3.01Å43。与二进制复合物相比，该三元图被认为具有更多的定向偏差和各向异性，这可能是由于在某些角度上分类的问题所致。然后使用DeepeMhancer44锐化了该地图。

　　通常，将晶体结构，冷冻EM结构或Alphafold46模型的模型手动停靠在UCSF Chimera或UCSF Chimerax47中的冷冻EM图中。然后，使用phenix48的刚体改进来完善模型，然后使用Isolde49进行改进，并在COOT50和PHENIX中进一步迭代手动构建和改进。

　　对于高阶二进制复合物，将精制的IL-25 – IL-17RB二进制复合物模型停靠到高阶图中，并使用近阶层的真实空间改进进行精炼。除去没有相应密度的高阶模型的区域被去除，并未对聚糖进行建模。

　　对于IL-25 – IL-17RB – IL-17RA三元络合物，IL-25 – IL-17RB二元复合物和来自蛋白质数据库（PDB）ID 3JVF的IL-17RA晶体结构被停靠到地图中，并在MAP中进行了精制，并在Phenix中使用真实的空间细化。由于IL-17RA的D2域的密度质量，将3JVF的D2结构域停靠到地图中，并且没有进行手动改进。

　　对于IL-17 – IL-17RA – IL-17RC三元络合物，将PDB ID 6HG9的IL-17 – IL-17RA二元复合物和IL-17RA晶体结构停靠到地图中，手动进行精制，并在PENIX中使用真实空间改进。由于IL-17RC的D3和D4域的电子密度质量，将6HG9的D3和D4域停靠在地图中，并且没有进行手动细化。

　　使用PISA，Chimerax和Pymol51（Schrödinger）分析界面。所有结构图都是使用Chimerax制成的。

　　未使用统计方法预先确定样本量。研究人员并未对实验样本身份视而不见。对单分子数据进行了正态性测试，并且由于某些样本的非正态性，非参数两样本Kolmogorov-Smirnov检验被用于计算样品之间的差异。绘制数据并使用Prism 9（GraphPad）计算统计。用于单分子成像数据的标准盒和晶须图显示了数据的五个数字摘要：最小，第一四分之一，中值，第三四分位数和最大值。p值在图中指示为：*p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001和**** p <0.0001。Cryo-EM数据和完善统计数据在扩展数据表1中提供。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。