以下样本量与我们和该领域中其他人以前使用的样本量相似：n = 4-6人参与者或小鼠用于确定Metformin16,31,32的药代动力学；n = 5–7只小鼠通常用于确定二甲双胍对血糖33,34和脂肪肝20,35的影响；n = 100–300蠕虫用于确定寿命36,37；当结论基于免疫荧光染色6,25时，包括2-6盘或实验的20-42个细胞。n = 3–5样品用于评估细胞和组织中的AMP，ADP和ATP水平6,15,25,27；n = 3个样品以确定特定蛋白24,38的表达水平和磷酸化水平；n = 3个样品以确定特定基因20,24,39的mRNA水平；n = 3个样品，以确定V-ATPase在体外的活性。没有使用统计方法来预先确定样本量。所有实验发现均如图传奇中所述重复，所有其他复制尝试都是成功的。对于动物实验，将每种基因型中的小鼠或线虫放置在相同的情况或位置下。对于细胞实验，使用相同的条件培养每种基因型的细胞。设计和执行每个实验以及适当的对照，并在相同条件下为相同批次的实验收集并分析了用于比较的样品。尽可能地应用随机化。例如，在MS分析过程中，处理样品并以随机顺序进行质谱仪进行。对于动物实验，对每种基因型中年龄匹配的同窝小鼠的性别匹配（仅针对小鼠）被随机分配给药理或饮食治疗。在细胞实验中，将每种基因型的细胞平行地种子并随机分配给不同的治疗方法。否则，不会进行随机化。例如，执行免疫印迹时， 需要按特定顺序加载样品才能生成最终数字。尽可能地使用盲。例如，样品收集和加工过程中的样品，笼子或琼脂板被标记为代码名称，后来被挑选和处理动物或细胞的个人揭示，但直到评估结果之前才参与样品收集和处理。同样，在显微镜数据收集和统计分析过程中，观点是随机选择的，并且经常由不同的操作员进行，从而防止对所需表型的潜在偏见选择。否则，不会进行盲目，例如在体外的V-ATPase活性的测量以及确定二甲双胍与PEN2结合的测量，在该测量过程中，操作员必须了解每个井的条件并在测量过程中相应地将试剂添加到井中。

　　在2017年9月至2020年7月在上海何乔大学（Shanghai Jiao Tong University）之间，肥胖症妇女被诊断出患有多囊卵巢综合症（PCOS）（PCOS）。这项研究得到了上海第六人医院伦理委员会的批准，并符合赫尔辛基宣布和良好的临床实践。所有参与者在入学前签署了知情同意书。这项研究已在中国临床试验注册中注册（CHICTR-EIR-17013169; http://www.chictr.org.cn/showproj.aspx?proj=21769）。

　　研究中包括的参与者符合以下标准：（1）18-40岁（包括）；（2）高于27.5 kg m – 2的身体 - 质量指数（BMI）；（3）符合PCOS的诊断标准。PCOS的诊断标准如下：（1）过去一年的月经不规则；（2）超雄激素；和/或（3）多囊卵巢的超声检查。排除具有以下疾病的参与者：（1）子宫切除术后；（2）先天性肾上腺增生，库欣综合征或雄激素分泌肿瘤在5年内；（3）母亲怀孕或哺乳；（4）与血栓形成相关的病史或危险因素，例如深静脉血栓形成，肺栓塞，心肌梗塞（心绞痛），瓣膜心脏病，心房颤动或脑血管事故（短暂性缺血性发作）；（5）肝功能异常（例如，由病毒肝炎引起）；（6）肝恶性肿瘤或腺瘤的病史，或生殖器或乳房恶性肿瘤的史；（7）严重或频繁偏头痛攻击的病史；（8）肾功能不全；（9）其他可能影响药物有效性或引起并发症的因素。

　　参与者用Diane 35（拜耳），每天一台平板电脑，加上二甲双胍（Bristol-Myers squibb），当时为2,000毫克1 – 1。这种联合治疗持续了6个月，然后将其切换到二甲双胍的治疗另外6个月。在治疗的终点，选择了六名BMI最低的参与者来确定药代动力学。可能会引入潜在的选择偏见。但是，它们的特征如下（平均值±S.D.），因此能够代表一般人群：25。5.5±6.2岁；体重，69.0±6.4公斤；BMI，26.5±1.1 kg m – 2;腰围，89.8±5.8厘米；臀部周长，102.2±11.4厘米；腰围/臀部比例为0.89±0.12;空腹血糖，5.1±0.7 mm；空腹血清胰岛素28.2±15.3μUML– 1;HBA1C，5.1±0.2％；总胆固醇，5.1±1.0 mm；标签，1.4±0.7 mm;高密度脂蛋白胆固醇，1.4±0.3 mm;低密度脂蛋白胆固醇，3.0±0.6 mm。在实验之前（从前一天的22:00开始）将参与者禁食12小时，然后每人服用0.5 g盐酸二甲双胍盐酸盐含量释放片（Bristol-Myers Squibb）。二甲双胍摄入后1、3、6和12小时采集血液样本，然后进行血清制剂。

　　如先前所述24，生成并保持Axinf/f，lamtor1f/f，axinlko和lamtor1lko小鼠。从杰克逊实验室获得了野生型C57BL/6小鼠（000664），DBA2小鼠（000671）和ROSA26-FLPE小鼠（016226）。ICR小鼠（N000294）是从Gempharmatech获得的。TRPV1 - / - 小鼠是从D. Julius（003770）提供的杰克逊实验室获得的。如先前所述，生成了具有TRPV2 – TRPV4或GFP的敲低的TRPV1 - / - 小鼠。APH1AF/FAPH1B - / - APH1CF/F小鼠是从B. de Strooper（030985）提供的Jackson实验室获得的。ATG5F/F小鼠是从N. Mizushima（BRCNO。RBRC02975）提供的Riken获得的。AMPKA1F/F（014141）和AMPKA2F/F小鼠（014142）是从S. Morrison提供的Jackson实验室获得的。

　　PEN2F/F小鼠菌株是根据基于雄激素的单倍体胚胎干细胞（AG-HAESC）基于CRISPR – CAS9介导的基因组编辑策略的基因组编辑策略，如前所述40，但进行了较小的修饰。在差异DNA甲基化区域（DKO-AG-HAESC）中携带缺失的AG-HAESC是J.-S。的礼物。李（上海生物化学与细胞生物学研究所，CAS）。单个指南RNA（SGRNA）靶向PEN2、5'-GTGGTACTGCGCACGCGCG-3'和5'-GAAAGAAGAAGAATGAGCGAACGCCT-3'（分别在内含子1和内含子2处）被克隆到PSPCAS9（BB）-P2A-MCHERRY-PURYSERCIN-S-MCHERRY-PUR MOMYCIN-SGROMEN中PSPCAS9（BB）-2A-GFP矢量（Addgene，48138）。通过将每个SGRNA的编辑效率转染到L929细胞中，然后在实验前对靶向基因组段进行测序。模板质粒是通过将0.6 kb的基因组片段（包含两个LOXP位点之间的外显子1）以及1-kb片段作为5'-总体臂和1-kb的1-kb片段作为3'-简单臂的1-kb片段来构建。在6孔盘中，用每种孔（0.1 µg µl – 1）和4 µg的6孔盘中的dko-ag-haesc和4 µg的模板质粒（0.2 µg µg µl – 1）转染了2 µg。转染后24小时，对细胞进行胰蛋白酶的作用，用PBS洗涤，并用5 mg ML – 1 Hoechst染色5分钟。将单倍体1C峰（G1期的单倍体细胞），MCHERRY阳性细胞（BD）分类。然后将大约7,000个排序的细胞在包含10％ES-FBS和非必需氨基酸的胚胎DMEM培养基中的明胶涂层的6孔盘中培养。通过测序验证了单个克隆的基因型，并选择了LoxP频线的PEN2克隆来产生二倍体ESC。首先将经过验证的克隆用0.05μgml– 1的葡萄糖治疗10小时，消化为单个细胞，然后在内部内注射到成熟的卵母细胞中 （在M2培养基中培养）源自在8-10周大的F1代生成C57BL/6×DBA2雌性小鼠。24小时后，将2细胞ESC移植到伪凝结的ICR雌性小鼠（8-10周大，> 26 g）中，并在实验前将带有LoxP的PEN2等位基因的后代进一步超过6次，至C57BL/6只小鼠。

　　根据传统的同源重组方法41产生ATP6AP1F/F小鼠。In brief, a targeting vector was generated by inserting a 1-kb genomic fragment (containing exon 3 and exon 4) and an FRT-flanked PGK-Neo-polyA sequence (as a positive selection marker), along with a 3-kb fragment as 5′-homology arm and a 3-kb fragment, followed by a MC1-TK-polyA sequence (as a negative selection marker), as a 3′-homology手臂，进入PBK矢量。然后将靶向矢量线性化并纯化。将总共​​10 µg线性化载体（1 µg µL – 1）电穿齿到1×1010 JM8A3 ESC中，然后选择G418选择，并通过Southern blotting进行基因分型。通过将loxp-Flank的ATP6AP1 ESC克隆微注射到C57BL/6胚泡（10–15 ESC到胚泡）中获得ATP6AP1F/F嵌合小鼠，然后将其移植到伪型ICR雌性小鼠中。PGK-NEO等位基因通过将嵌合小鼠与Rosa26-FLPE小鼠横断，并在实验前将六次杂交到C57BL/6小鼠。

　　然后将PEN2F/F小鼠与Alb-Creert2或Villin-Creert2小鼠交叉，以产生诱导的肝脏特异性PEN2敲除小鼠（PEN2-LKO）或诱导的肠道特异性PEN2敲除小鼠（PEN2-IKO）。将ATP6AP1F/F小鼠与Alb-Creert2交叉，以生成诱导的肝特异性ATP6AP1基因敲除小鼠（ATP6AP1-LKO）。将AMPKA1/2F/F小鼠与Villin-Creert2小鼠交叉，以产生诱导的肠道特异性AMPKA敲除小鼠（AMPKα-IKO）。PEN2，ATP6AP1和AMPKA通过腹膜内注射小鼠的他莫昔芬（溶解在玉米油中）为200 mg kg – 1，每周3次。在上次注射后1周通过蛋白质印迹分析了敲除效率。表达野生型ATP6AP1或ATP6P1Δ420–440的ATP6AP1-LKO小鼠是通过注射到尾静脉中的不同腺体相关病毒（AAVS）的指示插入的。病毒注射后4周分析了重新引入的ATP6AP1蛋白的水平。

　　为了产生TG-ALDOA和TG-ALDOA-D34S小鼠菌株，将人类Aldoa或Human Aldoa-D34S克隆到PLIV-LE6载体（包含组成型人类ApoE基因启动子及其肝控制区域）之间。然后将矢量与非I和SPE I限制酶进行线性性。使用Qiaquick凝胶提取试剂盒（28706，Qiagen）回收了6.12-kb片段，然后使用内福质粒最大套件（12362，QIAGEN）去除内毒素。将质粒稀释至2.5ngμl -1，并在胚胎天0.5 c57bl/6小鼠的胚胎天中将1 PL注入雄性核核。将两细胞的胚胎移植到伪孕的ICR雌性小鼠中。通过测序鉴定阳性F0后代，并与C57BL/6小鼠交叉。通过PCR选择了带有转基因基因组的F1小鼠，并通过免疫印迹检查了Aldoa或Aldoa-D34S的表达。选择了每种基因型的一只经过验证的F1小鼠以建立转基因小鼠菌株，然后在实验之前将其杂交到C57BL/6小鼠六次。

　　下面描述的所有小鼠实验的方案均由机构动物护理和Xamen大学动物委员会（XMULAC20180028）批准。除非另有说明，否则在特定的无病原体条件下，将小鼠自由获取水和标准饮食（65％碳水化合物，11％脂肪，24％蛋白质）。光线从8:00到20:00，温度保持在21–24°C，湿度为40–70％。在整个研究过程中，都使用了男性同立立物对照。以所需浓度在饮用水中提供二甲双胍，或以0.1％（w/w）的标准饮食提供1周。为了创建糖尿病小鼠模型，从4周大的时间开始喂食HFD（脂肪中的卡路里60％的卡路里； D12492，研究饮食）。

　　使用了以下小鼠年龄。（1）用于分离原发性肝细胞：正常饮用的野生型野生型野生型和loxp fant的Ampka小鼠4周（图1A，b，扩展数据图1C，e – g，1c，13g，13g，h和14f – h，n）;正常的滴定喂养的PEN2-LKO小鼠6周（图2B，扩展数据图3C，J和14L，J；在4周大的时候注射了他莫昔芬）；HFD喂养的野生型小鼠38周（扩展数据图12i；从4周大的HFD开始34周的HFD）；HFD喂养的PEN2-LKO小鼠38周（扩展数据图12i;在HFD治疗31周后，在4周大的HFD治疗后，在35周龄注射了他莫昔芬。表达全长ATP6AP1或ATP6P1Δ420-440年龄为8周的正常循环喂养的ATP6AP1-LKO小鼠（扩展数据。以及表达全长ATP6AP1或ATP6P1Δ420-440年龄的HFD喂养的ATP6AP1-LKO小鼠，年龄为38周（扩展数据图12p；在HFD治疗后34周内，在35周大的HFD治疗开始时，在34周龄的34周内注射了AAV，并在35周内注射了AAV。（2）用于葡萄糖耐量测试（GTTS），胰岛素耐受性测试（ITT）以及二甲双胍，GLP-1，胰岛素和TAG含量的测量：5周的野生型小鼠（扩展数据）（图1H，L，M）；PEN2-IKO和AMPKα1/2-IKO小鼠6周（图4A，B和扩展数据图12b，E; 4周龄小鼠的小鼠均注射了他莫昔芬，并接受了A HFD 1周，然后用二甲甲呈甲呈甲甲型的小鼠再治疗又一周）；HFD喂养的PEN2-LKO小鼠54周（图4C，D和扩展数据图12G，H; 4周龄小鼠的HFD喂食31周，然后用他莫昔芬注射；在38周龄时，用二甲甲呈甲状腺素将小鼠治疗16周）；HFD喂养的ATP6AP1-LKO小鼠表达全长ATP6AP1或ATP6P1Δ420-440年龄为54周（图4E，F和扩展数据图12n，O; 4周龄的小鼠HFD 30周，并在34周大的AAV中注射AAV； 在35周龄时，将小鼠注射他莫昔芬，然后用二甲双胍治疗16周）。（3）对于丙酮酸耐受性测试（PTTS）：PEN2-LKO小鼠6周（扩展数据图14K；在4周大的小鼠中注射了他莫昔芬，然后用二甲甲米昔芬治疗1周，从5周大）。（4）用于腺苷酸盐的免疫印迹和测量：5周的野生型小鼠（扩展数据图1J，K，M，M，N和13L;小鼠用二甲双胍治疗1周，从4周龄开始）；PEN2-LKO小鼠年龄6周（图4i; 4周大的小鼠被注射他莫昔芬，然后用二甲双胍治疗1周，从5周大）；表达全长ATP6AP1或ATP6P1Δ420-440年龄9周的ATP6AP1-LKO小鼠（图4J； 4周龄的小鼠被注入AAV；在5周大的时候，将小鼠注入他莫送，然后用他莫昔芬注射，然后用乙糖蛋白从8周开始用二甲甲蛋白处理1周）；HFD喂养的PEN2-LKO小鼠39周（扩展数据图12J；在4周大的小鼠中，将HFD喂食31周，然后用他莫昔芬注射；在38周龄时，用二甲双胍治疗1周的小鼠）；HFD-fed ATP6AP1-LKO mice expressing full-length ATP6AP1 or ATP6AP1Δ420–440 aged 39 weeks (Extended Data Fig. 12q; mice at 4 weeks old were fed a HFD for 30 weeks and then injected with an AAV at 34 weeks old; at 35 weeks old, the mice were injected with tamoxifen and then treated with metformin for 1 week starting from 38 weeks老的）;AXIN-LKO小鼠，LAMTOR1-LKO小鼠和7周龄的TG-Aldoa-D34（扩展数据图9D，E和11E；用二甲双胍治疗1周，从6周大开始使用二甲双胍）；TG-Aldoa-D34年龄6周（扩展数据图11c；小鼠饿了16小时）；肝ATP6V0C敲低小鼠7周（扩展数据图9F;小鼠用二甲双胍1周从6周龄开始处理，在该AAV中携带短的干扰siRNA（siRNA）针对ATP6V0C的AAV在4周静脉注射ATP6V0C。 和TRPV1 - / - 以及肝TRPV2 – TRPV4敲低的小鼠8周（扩展数据图11g;小鼠用二甲双胍用二甲双胍处理1周，从7周龄开始，在该AAV中携带siRNA针对TRPV -TRPV4的AAV在5周内静脉注射了TRPV -TRPV4）。（5）对于肝血久毒素和曙红（H＆E）染色：54周龄的HFD喂养的PEN2-LKO小鼠（扩展数据图12K; 4周大的小鼠HFD喂31周，然后用他莫西法喂食tamoxifen；在38周中，在38周中，用MICE用杂物素治疗16周）；HFD喂养的ATP6AP1-LKO小鼠，表达全长ATP6AP1或ATP6P1Δ420-440年龄为54周（扩展数据图12R；在4周龄时，将A HFD喂食30周，然后在34周龄时用AAV注射AAV；在35周龄中；在35周龄中，用TAMOXEFEN进行了注射，然后将其注射了16周。（6）对于所有其他实验，使用了4周的小鼠。

　　在每个实验之前，将小鼠单独笼子1周。对于GTT，将小鼠禁食6小时（8:00至14:00），然后在1.5 g kg – 1（对于瘦小的小鼠）或1 g kg-1（对于HFD诱导的糖尿病小鼠）处注射或腹膜内注射葡萄糖。使用oneTouch Ultravue自动葡萄仪（Lifescan）在指示的时间点通过尾静脉出血测量血糖。根据GTT进行ITT，除了对1 U kg -1胰岛素进行腹膜内注射。除了1 g kg-1丙酮酸钠腹膜内注入16小时的16小时（前18:00前一天至10:00）小鼠外，PTT进行了PTT。使用不同批次的小鼠进行GTT，ITT和PTT。

　　为了测量GLP-1水平，将每只老鼠的300μl血液收集在冰冷的K2EDTA喷涂管（366420，BD，BD P800血液收集系统）中，其中含有预添加50μl的蛋白蛋白（5 mg ML – 1）和50μl二磷酸蛋白A（5 mg ML – 1的浓度）和使用二蛋白）。然后，通过在4°C下以3,000克离心10分钟来制备血浆，并根据制造商的说明使用GLP-1 EIA试剂盒来确定GLP-1的水平。

　　为了测量胰岛素水平，在每个时间点（从下颌下静脉丛）收集约100μl小鼠血液，并在室温下放置20分钟，然后在4°C下以3,000g离心10分钟。根据制造商的说明，总共使用5μl血清（上清液）使用小鼠超敏感的胰岛素ELISA试剂盒来确定胰岛素水平。用于计算胰岛素浓度的五参数逻辑拟合的标准曲线是从Arigo Biolaboratories网站（https://www.arigobio.cn/elisa-calculator）生成的。

　　对于H＆E染色，在室温下将肝组织固定在4％（v/v）多聚甲醛中24小时，然后转移至嵌入盒式盒式盒子。然后将盒式盒在流水中洗涤12小时，然后连续浸泡1小时，在70％乙醇（水中的v/v），80％乙醇和95％乙醇中。将固定组织进一步在无水乙醇中脱水两次，然后浸入50％的二甲苯（乙醇中的v/v）中30分钟，二甲苯两种变化（每个15分钟），小蜡（58-60°C; 1 h）进行了两种变化。将脱水的组织嵌入石蜡上，在组核阿卡迪亚石蜡嵌入机（Leica）上。然后将石蜡块以3μm的厚度切片，在粘附显微镜载玻片上干燥，然后按以下顺序进行再合化：在70°C时两次变化10分钟10分钟；无水乙醇的两个变化5分钟；两次变化为95％乙醇5分钟；乙醇的80％变化5分钟；一个变化70％乙醇5分钟；50％乙醇的变化5分钟；并在水中短暂。然后将切片染色8分钟，然后在流水中洗涤5分钟，在1％盐酸（在乙醇中）中分化30 s，在自来水中洗涤1分钟，将0.2％（V/V中的V/V浸入水中）氢氧化物溶液中，将30 s的氢氧化物溶液用于1分钟，并在1分钟内洗涤，并在seos in seos y seosIN中洗涤。将染色的切片在70％乙醇中脱水5分钟，在95％乙醇中两次分别脱水5分钟，在无水乙醇中两次分别持续5分钟，每个二甲醇和两次变化的二甲苯和两次变化15分钟。将染色的切片与加拿大香脂板安装，并在Leica DM4 B显微镜上可视化。使用LAS X软件（V.3.0.2.16120，Leica）处理图像，并使用Photoshop 2021软件（Adobe）进行格式化。

　　为了测量标签含量，将小鼠安乐死，并立即去除肝脏并在PBS中冲洗三次。将大约50 mg的组织在含有5％（v/v）Triton X-100的1 mL PBS中匀浆。将匀浆煮沸5分钟，然后在25°C下在20,000g下离心10分钟。使用Labassay甘油三酸酯试剂确定标签含量（从上清液中）。

　　野生型（N2 Bristol），AAK-2（OK524）和UNC-76（E911）菌株从Caenorhabditis遗传学中心获得。除非另有说明，否则将蠕虫保持在线虫生长培养基（NGM）板上（1.7％（w/v）琼脂，0.3％（w/v）NaCl，0.25％（w/v）细菌肽，1 mm Cacl2，1 mm Cacl2，1 mm cacl2，1 mmgso4，1 mm mmgso4，25 mm kh2po4-kh2po4-kh2po4-k2 ph 6.0 and ph 6.0，ph 6.0，w 6.0，w/0.0（w 6.0，w and v），沃克（0.0），沃克和0.0（w and v），沃克（w 6.0，w and v）。5μgml– 1胆固醇）用大肠杆菌OP50作为标准食品扩散。在倒在板上之前，将所需浓度的二甲双胍添加到高压灭菌的NGM（冷却至50°C）中。所有蠕虫均在20°C培养。

　　Pen-2被击倒，而不是在秀丽隐杆线虫中被淘汰，因为Pen-2的完全耗竭对C. elegans7是致命的。为了击倒第2章，首先同步线虫的生长：从琼脂板上用15 ml M9缓冲液（22.1 mm KH2PO4，46.9 mm Na2hpo4，46.9 mm Na2hpo4，85.5 mm nacl和1 mm mgSO4）补充了0.05％（V/V/V/V/V/V/V/V/V/v/v/c）。2分钟。将蠕虫沉积物用6 ml的M9缓冲液悬浮，其中含有50％同步漂白溶液（通过混合25 mL NACLO溶液（5％活性氯），8.3 mL 25％（w/v）NaOH和66.7 ml M9缓冲液，总共摇动2分钟和半分钟。用12 ml的M9缓冲液洗涤沉积物两次，然后用6 ml M9缓冲液悬浮，然后在20°C旋转30 r.p.m.持续12小时。然后将同步的蠕虫（在L1阶段附近）放在RNAi板（含1 mg ML – 1 IPTG的NGM）上，并用HT115大肠杆菌染色（含有PEN-2的RNAi）（来自C. C. elekans Rnai Collection（Ahringer C. ahringer）的板86）的HT115大肠杆菌污渍扩散，可用于PEN-2（均为A05）。通过实时定量PCR（QPCR）确定PEN-2 mRNA的水平来检查敲低效率。将大约1,000蠕虫用15 ml含有Triton X-100的M9缓冲液洗净RNAi板，然后在1,000克下离心2分钟。然后将沉积物用1 mL M9缓冲液洗涤两次，然后用1 ml的Trizol裂解。然后将蠕虫冷冻在液氮中，在室温下融化，然后重复冻结 - 再进行两次。然后将蠕虫裂解物在室温下放置5分钟，然后与0.2 mL氯仿混合，然后剧烈摇动15 s。3分钟后，将裂解液在4°C下以20,000克离心15分钟，将450μl水相（上层）转移到新的无RNase无RNase离心管中， 然后与450μl异丙醇混合，然后在4°C下以20,000克离心10分钟。用1ml的75％乙醇（V/V）洗涤沉积物，然后以20,000g离心10分钟，然后用1mL无水乙醇进行离心，然后在20,000G处离心10分钟。蒸发乙醇后，将沉积物用20μl无RNase水溶解。然后，使用Revertra ACE QPCR RT Master Mix与GDNA去除剂试剂盒对溶解的RNA进行反向转录至cDNA，然后使用CFX96 Thermocycler（Bio-Rad）上使用Maxima sybr sybr Green/rox QPCR Master进行实时QPCR。使用CFX Manager软件（V.3.1，Bio-Rad）分析数据。根据获得的CT值评估敲低效率。PEN-2的引物为5'-TACGTGATCGCCAGCATTGT-3'和5'-CGTGTGGTGGACCCGATTTCCTGA-3'。AMA-1（内部对照）的引物为5'-GACATTTGGCACTGCTTTGT-3'和5'-ACGATTGATTGATTCCATGTCTCG-3'。

　　表达ATP6AP1或其Δ420–440突变体的ATP6AP1 - / - 秀丽隐杆线虫菌株如下：ATP6AP1或其Δ420-440突变体被引入UNC-76（E911）C.Elegrans菌株，该菌株已被六次折射到N2菌株中；然后，将这种产生的菌株敲除ATP6AP1（VHA-19）基因的敲除，并救出了UNC-76的未协同表型。To generate unc-76 strains expressing ATP6AP1 or the Δ420–440 mutant, cDNA of ATP6AP1 or ATP6AP1Δ420–440 was inserted into a pJM1 vector, with GFP as a selection marker, between the Nhe I and Kpn I sites (expressed under control by a sur-5 promoter), then injected into the syncytial gonad of the worm.使用配备有M-152操纵器（Narishige）和微型注射器系统（TRITECH）的Leica DMI8显微镜（TRITECH）进行显微注射。通过将2滴（约50μl）沸腾的2％琼脂糖（w/v）放在玻璃盖玻片的中心（24×50 mm，0.13-0.15 mm的厚度）中来制备注射垫，然后立即用另一个盖玻片压扁，然后在室温下干燥24小时。使用步骤2程序（使用步骤2程序（在66°C下加热器1号，在75°C下加热器1号），从玻璃毛细管（1.0×0.75毫米ID/纤维）通过PC-100拔出器（Narishige）处理了玻璃毛细管（1.0×0.75毫米ID/纤维），fhc，fhc），并在75°C下加载。ATP6P1Δ420–440质粒（200 ng µl – 1，在加载前以20,000g离心15分钟），然后以调整为20 psi的压力以调整的压力连接到氮气源。使用解剖显微镜成功地检查质粒的载荷，然后以45°角将与注射垫相关的角度加载到操作机上。对所有设备进行调整和对齐，以确保清晰， 获得了垫子和针头的居中视图。然后，通过在盖玻片的侧面轻轻敲击，打开密封的针尖，以使每次注射期间都可以制作五倍更宽的液滴。然后将年轻的成人UNC-76蠕虫带有良好区分性腺，然后将其轻轻锚定在注射垫上，上面覆盖着一层薄层的微注射油（盐油700）。然后将PJM1-ATP6AP1或ATP6P1Δ420–440质粒注入性腺（性腺鞘）的合胞臂，直到达到略有可见的肿胀。然后将一滴M9缓冲液添加到注入的蠕虫中，然后将蠕虫漂浮在微注射油上，然后在NGM板上捡起并回收了2天。选择了表达F1 GFP的雌雄同体以进行进一步培养。然后，通过注射PDD122（PEFT-3 :: cas9 + ttti5605 sgrna）的混合物，将编码ATP6AP1（VHA-19）的基因组序列从这种菌株中拆除，该混合物载有SGRNA，将SGRNA载于Vha-195'-aatgatgtcaggttttttttttctgg-3'用于内含子3，使用Chopchop网站http://chopchop.cbu.uib.no/）和P7616b（UNC-76（+））Rescue Plasmid（100μgml – 1 ers）将P7616b（UNC-76（+））升级为年轻人。具有正常姿势的F1雌雄同体蠕虫在NGM板上分别培养。产卵后，使用单个蠕虫裂解缓冲液（50 mm HEPES，pH 7.4，1 mm eGTA，1 mm mgcl2，100 mm kcl，10％（v/v）甘油，0.05％（v/v）NP-40，0.5 mm dtt and Prire prire prir ccr），随后是prirer prirers prires prire prire prire prire tike prire prire prire prire tik prire prire prire prire prire，随后是Prire ccr）5'-aactgcttttgctcgaaaata-3'和5'-aagtaaaaaaaaaaagggacaaaaagtcg-3'用于基因分型。从敲除个体产生的后代被六次到N2菌株中，并通过免疫印迹检查了ATP6AP1或ATP6AP1Δ420-440的表达水平。选择以相似水平表达ATP6AP1或ATP6AP1Δ420–440的菌株进行进一步的实验。

　　本研究中使用的线虫的年龄如下：（1）使用寿命测定，使用L4阶段的蠕虫（图4G，H，扩展数据图13A和14D，E;用二甲双胍或N-乙酰囊这氨然处理直至死亡）；（2）用于分析二甲苯蛋白，P-AMPKα和活性氧（ROS）水平（扩展数据图13b，C，E，F，I-K和14C，I），L4阶段的蠕虫（使用二甲双胍治疗1天后）的腺苷酸盐和药代动力学（ROS）（3）对于使用PEN-2敲低蠕虫的实验，使用了L1阶段的蠕虫（扩展数据图13D；用含有RNAi的HT115大肠杆菌菌株饲喂，含有RNAi对PEN-2）。

　　在转移到所需的琼脂板之前，将同步的蠕虫培养为L4阶段。每2天将蠕虫转移到新板上。在转会期间计算了活蠕虫。在与铂金采摘器轻轻接触后没有表现出任何动作的蠕虫被判断为死亡。使用Prism 9（GraphPad软件）生成Kaplan – Meier曲线，而使用SPSS 27.0（IBM）分析统计分析数据。

　　如前所述，升高并验证了针对LAMTOR1的兔多克隆抗体，并稀释1：100以进行免疫沉淀（IP）或1：500用于免疫印迹（IB）。用细菌表达并纯化ATP6AP1（氨基酸440-470，GST标签），将针对ATP6AP1的兔多克隆抗体提出，并以1：100稀释。以下抗体购自细胞信号技术：兔抗磷酸-AMPKα-T172（CAT。2535，1：1,000，IB），抗AMPKα（Cat。2532，1：1,000 for Ib），IB），抗AMPKβ1/2（抗Anti-ampkβ1/2）IB), anti-ACC (cat. 3662, 1:1,000 for IB), anti-phospho-p70 S6K-S389 (cat. 9234, 1:1,000 for IB), anti-p70 S6K (cat. 2708, 1:1,000 for IB), anti-LKB1 (cat. 3047, 1:1,000 for IB), anti-AXIN1 (cat. 2074, 1:1,000对于IB），抗presenilin 1（cat。3622，1：1,000为IB），抗presenilin 2（cat。2192，1：1,000 for Ib），抗nicastrin（cat。3632，1：1,000 for Ib），ib），抗β-纤维蛋白，抗β-抑制蛋白，抗β-抑制蛋白（cat。2128，12128，1：1：cat cat for Ib ibi for Ib ib）ant Ib ib Ib）IB或1：120用于免疫荧光（如果）染色），抗PDI（CAT。3501，1：1,000 for Ib），抗细胞色素c（cat。4280，1：1,000 for Ib），IB），抗clathrin（Cat。4796，1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：23214，cat。anti-ATG5 (cat. 12994, 1:1,000 for IB), anti-PDI (Alexa Fluor 488-conjugated, cat. 5051, 1:60 for IF), HRP-conjugated mouse anti-rabbit IgG (conformation-specific, cat. 5127, 1:2,000 for IB), HRP-conjugated goat anti-rat IgG（特定于构象，cat。98164，1：2,000用于IB）和鼠标抗Myc-tag（cat。2276，1：500 for Ib）。兔抗ATP6V0C（cat。NBP1-59654，1：1,000用于IB或IP的1：100）抗体购自Novus Biologicals。小鼠抗FLAG M2（IB的Cat。F1804，1：1,000），山羊抗兔IgG抗体和抗FLAG M2亲和凝胶（Cat。A2220，1：500用于IP）是从Sigma购买的。兔抗Pen2（Cat。AB154830，1：1,000用于IB或IP和IF），IF和IF），抗ATP6AP1（CAT。AB176609，1：500 for IB）， 抗转铁蛋白（IB的Cat。Ab1223，1：500），抗TGN46（cat。Ab76282，1：60 for If）和大鼠抗LAMP2（cat。Ab13524; 1：1000 for Ib或Ib或1：120）是从ABCAM购买的。山羊抗胺（cat。SC-8567，1：120 for If），小鼠抗HA（cat。SC-7392，1：1,000 for Ib，1：500用于IP或1：120用于IP），鼠标抗goat IgG-goat IgG-HRP抗体是从Santa Crumz Biotechnology购买的。正常的兔子控制IgG（Cat。Cr1，1：100用于IP）购自Sino Biological。山羊抗小鼠IgG（IB的CAT。115-035-003，1：1,000）和抗兔（CAT。111-035-003，1：1,000用于IB）抗体购自Jackson Immunoresearch。驴抗goat IgG（IB的Cat。A-A-111055，1：1,000），抗兔IgG（cat。A-21206，1：1,000 for Ib），抗rat IgG（cat。A21209，1：1,000 for Ib），goat anti Anti-Rat anti anti anti Anti-Rat Igg（cat。A-21247，1：1,000），cap for cat。PA1-2010，1：1,000，用于IB），小鼠抗strep-tag（CAT。MA5-17283，1：1,000用于IB）抗体购自Thermo Scientific。兔抗ATP1A1（cat。14418-1-ap，1:60 for If）和抗Tomm20（cat。11802-1-ap，1:60 for If）抗体购自proteintech。

　　葡萄糖（Cat。G7021），HEPES（CAT。H4034），溶酶体隔离试剂盒（Cat。Lysiso1），Cacl2（CaC.C5670），Pep（Cat。P7002），β-NADH，β-NADH（CAT。N8129）（CAT。N8129），pyruvate Kinase Kinase Kinase Kinase（Cat。P91136），LDHA（cat。p9136），cat。p9hha（cat。p9136），，cat。p9hadha（cat。p9136），，cat。FITC – DEXTRAN（CAT。FD10S），H2O2（CAT。323381），二甲双胍（Cat。D150959），Kcl（Cat。P9333），MGSO4（Cat。M2643），KH2PO4，KH2PO4（CAT。P5655），NAH2PPO4（CAT。P5655），NAH2PO4（CAT.S82282）（CAT.S8282）（CAT.S8282）。S7907），DAB（Cat。D8001），乙醇（Cat。459836），乙腈（Cat。34888），Isropopanol（Cat。34863），二氯甲烷（Cat。650463）（Cat。650463），SDS（Cat。436143），施加（436143），Embry（cat.sodium acem cat.898989898989898898989898989898989888988888988号）。SLM-220-m），半酸（Cat。D7385），M2培养基（Cat。M7167），玉米油（Cat。C8267），胰岛素（Cat。I1882），丙酮酸钠（Cat。P2256），盐酸盐油700（CAT。H8898），AGAR（CAT）胆固醇（CAT。C3045），次氯酸钠溶液（Cat。239305），IPTG（Cat。I6758），碳纤维蛋白（Cat。C1613），琼脂糖（CAT。A9539），胶原酶类型IV（CAT。C5138），BSA（CAT。CAT.A.A2CO.A2CO.A2153）乙酸四水合物（Cat。M5661），digitonin（Cat。D141），寡霉素A（Cat。75351），FCCP（Cat。C2920），抗霉素A（Cat。A8674），cat。Rotenone（Cat。R88875），CAC.4110001000（CAT。Rotenone）辉煌的蓝色R-250（Cat。1.12553），GLP-1 EIA Kit（Cat。Rab0201），抑制蛋白（Cat。A1153），二哌丁素A（Cat。i9759），胰蛋白酶（Cat。T1426），2- ercapto乙醇（2-甲醇（Cat。M6250），cat。M6250），cat。142cl.1433（can2）(cat. 270997), pyridine (cat. 270970), -glutamine (cat. G3126), paraformaldehyde (cat. 158127), haematoxylin solution (cat. 03971), eosin Y solution (cat. 318906), Canada balsam (cat. C1795), xylene (cat. 214736),乙醇中的盐酸（Cat。1.00327），PEG（Cat。89510），苯酚红溶液（Cat。P0290），蔗糖（Cat。S7903），CSCL（CAT。289329），Na2H2P2O7，NA2P2O7（CAT。P8135）（Cat。P8135），β-胶质磷酸盐（Cat.50020）（Cat。A9978），A23187（CAT。C7522），A-769662（Cat。Sml2578），他莫昔芬（Cat。T5648），Nahco3（Cat。S5761），Egta（CAT。E3889），聚 - 裂解液溶液 （Cat。P8920），甲醛溶液（福尔马林，f8775），Optiprep（Cat。D1556），MGCL2（Cat。M8266），四甲基硅烷（Cat。T24007），Trizma base（Tris，Cat。t1503），Glycerol（glycerol（cat），d26666 66.66666。TCEP（CAT。C4706），TBTA（CAT。678937），CUSO4（CAT。C1297），IGEPAL CA-630（NP-40，CAT。I3021），甲醇（Cat。646377），Chcl3（Chcl3β--葡萄糖吡喃糖苷（Cat。O8001），Triton X-100（Cat。T9284），依胺霉素A（Cat。C9705），DTT（Cat。43815），MEA（Cat。30070），Glucose氧化酶（Cat。G2133），cat cat.cat.cat.cat.cat。338818), FLAG peptide (cat. F3290), EDTA (cat. E6758), polybrene (cat. H9268), HCl (cat. 320331), NaCl (cat. S7653), NaOH (cat. S8045), ATP disodium salt (cat. A2383), ATP magnesium salt (cat. A9187),-mannitol（Cat。M4125），Percoll（Cat。P4937），咪唑（Cat。I5513），氯喹（Cat。C6628），细胞切拉蛋白D（CAT。C2618），N-乙酰基 - cy----------------------乙酰基 - cysteine（cat。A9165），Pertremition 5），pertorion 5）（CAT。5.43804），甲酸铵（Cat。70221），胰高血糖素（Cat。05-23-2700），DEPC处理的水（Cat。693520），谷氨酸溶液（Cat。G5882），Glycine（Cat。Glycine），Glycine（Cat。G8898），proteptavavibibin（cat。（Cat。71610-M），Myristic-D27酸（Cat。68698），甲氧胺盐酸盐（Cat。89803），MTBSTFA（具有1％T-BDMC，CAT。M-108），己烷，己烷（CAT。34859），脂肪酸BSA（CAT）（Cat。T9281）和Tween-20（Cat。P9416）购自Sigma。Westernbright ECL和过氧化物溶液（CAT。210414-73）购自Advansta。丙烯酰胺/BIS溶液，30％，29：1（Cat。1610156）购自Bio-Rad。标签（15：0/15：0/15：0，CAT。26962）购自Cayman。蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Cat。70221）购自Roche。Hoechst（Cat。H1399），Lysensor Green DND-189（Cat。L7535），延长钻石抗Fifade Mountant（Cat。P36970），延长活反射试剂（Cat。P36975），中性含量（CAT。29204），29204），29204），29204） Lipofectamine 2000（Cat。11668500），DMEM，高葡萄糖（CAT。11965175），DMEM，无葡萄糖（CAT。11966025），无苯酚红色的DMEM（CAT。21063045）（CAT。21063045），MEM氨基酸溶液（CAT。1113007777），MEM NON-NonINE AINDIERS，MEM NON-NonICAID SIDICER（CAIN-NON-NONICAID），cAINCID SIDICER（CAT CAID SICID），cat cat cat cat。（CAT。T3168），CM-H2DCFDA（CAT。C6827），Cellrox深红色（Cat。C10422），Esc配合的胎牛血清（FBS）（FBS）（CAT。30044333），Maxima sybr Green/Rox qpcr Master Mix（Cat。K02223），Tripan fl fbl flbly stain fbs fbs fls flbl flbl flbl flbly sain（cat）（cat）（cat）。10099141C），青霉素 - 链霉素（Cat。15140163），William's E培养基，无谷氨酰胺（CAT。12551032），肝灌注培养基（Cat。17701），肝脏消化培养基（CAT。17703）（CAT。17703），斑点（CAT。15596018）购自Thermo Scientific。内部标准1（CAT。H3304-1002）和内部标准3（CAT。H3304-1104）购自人类代谢组技术。RProtein A Sepharose快速流量（CAT。17127904），蛋白G Sepharose 4快速流量（CAT。17061806），Series s Sensor Chip CM5（Cat。BR100530），胺偶联试剂盒（EDC和NHS，包括Cat。Br100050）。OSO4（Cat。18465），乙酸铀酰（Cat。19481）购自Tedpella。SPI-PON 812嵌入套件（CAT。02660-AB）购自SPI。DAPT（Cat。S2215），RO4929097（Cat。S1575），Bafilomycin A1（Cat。S1413），3-MA（Cat。S2767），Dynasore（Cat。S8047）（Cat。S8047），Dyngo-4A（Cat。S7163）和Nystatin（Cat。S7163）和S1934（CAT。S7163）和NYSTATIN（CAT。S7163）。甲基-β-环糊精（CAT。HY-101461）购自Medchemexpress。Labassay甘油三酸酯试剂（CAT。290-63701）购自Wako纯化学工业。小鼠超敏感的胰岛素ELISA试剂盒（CAT。80-INSMSU-E10）购自垫科。Revertra Ace QPCR RT Master Mix搭配GDNA去除剂（Cat。FSQ-301）购自Toyobo。3-（but-3-yn-1-yl）-3-（2-碘乙基）-3h-diazirine（Cat。BD627886）购自Bide Pharmatech。SMM 293-TII表达培养基（CAT。M293TII） 购自中国生物学。Seahorse XF基础培养基（CAT。103334）购自Agilent。Paraplast高熔体石蜡（CAT。39601095）购自Leica。[U-13C] - 谷氨酰胺（CAT。184161-19-1），[U-13C] ---钙木酸（CAT。CLM-409）和[U-13C] -Glucose（CAT。CLM-1396）购自Cambridge Isotope Laboratories。

　　本研究中使用的全长cDNA是使用MEFS中的PCR或从Origene，Sino生物学或Genescript购买的。使用Primestar HS聚合酶（Takara），通过基于PCR的位置定向诱变进行PEN2和ATP6AP1的突变。在PCDNA3.3载体中构建了用于转染（异位表达）或慢病毒包装（稳定表达）的PCDNA3.3载体（异位表达）或PBOBI载体中的表达质粒。为了表达标记为链球菌的ATP6AP1，将ATP6AP1 cDNA插入了修改的PCDNA3.3-C-HA矢量中，编码HA表位标签的序列被链球菌Tag44的序列取代。通过测序（Invitrogen）验证PCR产物。基于慢病毒的矢量PLV-H1-EF1A-PURO用于在MEF和HEK293T细胞中表达siRNA，以及用于小鼠肝脏的基于AAV的矢量PAAV2。小鼠PEN2的siRNA序列如下：5'-GCCTGCCCGGAGTACTAT-3'（1）和5'-GTTTCTTTGTTGGTGTTGTGTCAACATTT-3'（2）（2）。除用于腺病毒包装的质粒外，所有质粒均使用氯化葡萄球菌密度梯度梯度超速离心方法纯化。

　　从外科手术去除的肝组织中分离出人原发性肝细胞。将新鲜组织切碎，然后在37°C下添加0.5 mg ML – 1胶原酶IV替蛋白酶的0.25％（w/v）胰蛋白酶消化10分钟。然后将细胞立即在William e培养基E加10％FBS，100 IU青霉素和100 mg ML – 1链霉菌蛋白的William's Medumed E加上胶原蛋白涂层的6孔板中（60–70％汇合）铺板。附着4小时后，将培养基用1％（w/v）BSA替换为新鲜的William媒介，然后再使用12小时。这项研究得到了赫尔辛基宣布原则的上海第六人民医院人类研究伦理委员会的批准。所有参与者获得了书面知情同意。

　　使用肝脏灌注培养基和肝脏消化缓冲液通过改良的两步灌注方法分离小鼠原发性肝细胞。在分离肝细胞之前，首先对小鼠进行麻醉，然后将插入OD插入0.72×19 mm的静脉导管静脉内导管。切断门静脉后，用50 mL的肝灌注培养基灌注小鼠，速度为5 ml – 1 – 1，然后以2.5 ml min – 1的速度为50 mL的肝脏摘要缓冲液。然后将消化的肝脏用PBS短暂冲洗，然后通过在一个6厘米的盘子上轻轻撕开Glisson的胶囊，并用两个灭菌的针头镊子撕裂，其中包含3毫升PBS。将分散的细胞与10 ml冰冷的William介质E加10％FB混合，并通过100μm细胞滤网（BD Falcon）进行过滤。然后将细胞在4°C下以50克离心2分钟，然后用10 ml冰冷的威廉培养基E加10％FBS洗涤两次。然后将细胞与人类原发性肝细胞一样铺板并培养。PEN2 - / - 肝细胞是通过感染PEN2F/F肝细胞（从Loxp-Flanked Pen2小鼠中分离出来的），其用腺病毒表达了CRE重组酶（或GFP作为对照）6小时，然后在William's Meduep中使用1％（W/V）培养1％（w/v）BSA，然后在William's培养基中孵化6小时。

　　HEK293T，AD293（ADENO-X 293）细胞，MEF和L929细胞在Dulbecco的修饰的Eagle培养基中维持了10％FBS，100 IU Penicillin，100 mg ML – ML – ML – ML – 1链霉素，含有37°C，在含Humidiedified Incubiator含有5％Co2中。从HEK293T细胞建立的悬架HEK293T细胞系是Z. Wang（Xiamen Immocell Biotechnology）的礼物。将细胞在400 mL的SMM 293-TII培养基中培养在37°C，160 r.p.m的2升圆锥玻璃瓶中。在含有5％二氧化碳的加湿孵化器中，在耐二氧化碳振动器（CAT。8881101，Thermo Scientific）上。所有细胞系都经过证实为没有支原体污染。通过STR测序对HEK293T细胞进行身份验证。最终浓度为10μM的聚乙基亚胺（PEI）用于转染HEK293T细胞。使用相关的空载体将要转染的总DNA调整为相同的量。转染后24小时收集转染的细胞。

　　使用Lipofectamine 2000转染将慢病毒，包括用于敲低或稳定表达的病毒，在HEK293T细胞中包装。转染后30小时，在转染后30小时收集培养基（约2 mL），并在室温下以5,000g的速度在5,000g处离心3分钟。将上清液与10μgml– 1（终浓度）聚甲烯混合，并将其添加到MEFS或HEK293T细胞中，然后在室温下以3,000g离心3,000克（自旋感染）。在进一步治疗之前，将细胞再孵育24小时（MEF）或12小时（HEK293T细胞）。

　　LAMTOR1F/F，AXINF/F和ATG5F/F MEF是通过使用慢病毒将SV40 T抗原引入小鼠垃圾中的培养的原代胚胎细胞中来建立的。LAMTOR1 - / - MEF是通过用腺病毒感染LAMTOR1F/F MEF来产生的，腺病毒表达CRE重组酶12小时，如Axin - / - MEFS，ATG5 - / - / - / - MEFS和APH1A – APAPH1A – APH1A -APH1C TRIPE TRIPLIPE MEFS。然后将感染的细胞在新鲜的DMEM中再孵育12小时，然后再进行进一步处理。如先前所述25，生成了TRPV1 – TRPV4四倍敲除MEF。

　　使用CRISPR -CAS9系统从MEFS或HEK293T细胞中删除了基因（PEN2，ATP6AP1，PSEN1，PSEN2，NCSTN，PRKAB1和PRKAB2）。将核苷酸退火到包含克隆TAG AAAC的补充中，并插入Lenticrisprv2载体的背对背BSMB I限制位点。每个SGRNA的序列如下：小鼠PEN2的5'-ATGAGGAGAAGTTGAACCTG-3'（1）和5'-CAGATCTACCGCCCCCGCTG-3'（2）用于小鼠PEN2；5'-catcttctggtt cttccgag-3'（1）和5'-ccggaagtactacctgggta-3'（2）用于人PEN2；5'-GGTGGCCCGTGATATAACCA-3'用于鼠标ATP6AP1;5'-gatgtagccg tggtggcgcgga-3'用于人ATP6AP1;用于小鼠PSEN1的5'-CTGAGCCAATATCT AATGGG-3';用于小鼠PSEN2的5'-cacGCTGTGTGTATGATCG-3';5'-CTGTGG AATGAACTGGGCAA-3'用于小鼠NCSTN;5'-gagatccttacc ttctcgtg-3'用于小鼠prkab1;和5'-agctCggaCg tcatgtcg-3'用于小鼠prkab2。然后，使用HEK293T细胞对植物病毒包装进行慢病毒包装，这些HEK293T细胞在Lipofectamine 2000转染试剂中每孔的6孔板中用2 µg DNA转染。转染后30小时，收集病毒（约2 mL），并用于感染MEFS或HEK293T细胞，如上所述，除了培养至15％融合的细胞与病毒孵育72小时。特别是，对于HEK293T细胞，在感染36小时后，将0.5 mL的新鲜DMEM补充到每个孔中。当细胞接近汇合时，它们被单细胞排成96孔。通过测序扩展克隆并评估敲除状态。对于葡萄糖饥饿，将细胞用PBS冲洗两次，然后在无葡萄糖的DMEM中孵育，并在37°C下添加了10％FBS和1 mM丙酮酸钠的时间。

　　使用AD293（Adeno-X 293）细胞中的腺病毒载体系统（240009，Agilent）包装腺病毒（AV）携带CRE重组酶（AD-CRE）。简而言之，将带有CRE重组酶的Padeasy载体与PAC I线性化12小时，并通过将0.2 µg的每个线性化载体对0.8％琼脂糖凝胶（w/v）（w/v）进行确认（显示约30-kb频带和4.5-kb频段）。用两个体积的乙醇沉淀线性化载体，然后用20 µL无菌水溶解。总共将5 µg线性化载体转染到Lipofectamine 2000在60毫米培养皿中培养的3×106 AD293细胞中，转染12小时后，将3 mL的培养基刷新。将细胞再培养7天，每隔一天添加1.5 mL新鲜培养基（未刷新）。将细胞与培养基一起收集，然后进行三轮冻融周期。通过以20,000克离心去除细胞碎片10分钟，并使用上清液感染两种6厘米的AD293细胞菜肴，然后进行3轮扩增，以产生滴度10倍的滴度。将病毒颗粒加载在5 ml的15％CSCL的顶部（溶解在TBS（10 mM Tris，0.9％，0.9％（w/v）NaCl，2.5％（w/v）蔗糖，pH 8.1））垫上4.5 ml 4.5 ml的40％CSCL垫子（W/V，W/V，w/v，TBS中分解为tbs）的4.4444444434444444 cat cat cat fume unber unkent cat bec bec bec cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat cat bec cat cat cat cat cat cat cat cat bec bec bec bec cat cat。样品WASE以30,000 r.p.m.在SW41转子（Beckman）中，在4°C下持续16小时。收集较重的条带，然后在4°C下在TBS中透析1小时。纯化的AD-CRE病毒存储在-80°C。

　　使用Grieger等人45的方案将AAV包装在HEK293T细胞中。简而言之，将用于内部病毒的细胞保持在150毫米菜肴中。总共7μgPAAV-RC2/9（AAV2倒末端重复（ITR）载体用AAV9 CAPSID）质子，21μgpaav-inbelper质粒和7μgpaav2质粒（携带ATP6AP1或ITS unt sirnas trop trpV2）trpv2 trpv2 trpv2红色，然后与175μl的PEI溶液（1 mg ML – 1，pH 7.5）混合。然后将混合物在室温下孵育20分钟，然后添加到菜肴中。转染后60小时，通过刮擦和离心收集细胞。如前所述45，使用optiprep梯度从颗粒中纯化病毒颗粒。通过实时qPCR确定纯化AAV的滴度（见下文）。使用前将病毒储存在-80°C下，并通过侧尾注射静脉内递送至小鼠。对于每只小鼠，注射了1×1011病毒颗粒，调节至200μl最终体积（带有PBS，pH 7.4）。

　　对于IP内源性蛋白，LAMTOR1，PEN2和ATP6AP1被免疫沉淀和分析如前所述24，但进行了较小的修饰。简而言之，收集了10个15厘米的MEF（生长到80％汇合）的LAMTOR1，或收集了两种10厘米MEF（生长到80％汇合）的PEN2和ATP6AP1的MEF（生长到80％汇合）。将细胞用每盘冰冷的ODG缓冲液用750μl裂解（对于LAMTOR1； 50 mM Tris-HCl，pH 8.0，50 mm NaCl，1 mM EDTA，1 mm EDTA，2％（W/V）ODG，5 mMβ-coercapto-mmβ-甲醇含有蛋白酶抑制剂鸡肉pen 7.7.7.7.7.7.7.7.5 mm。150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA，1％（v/w）Triton X-100，2.5 mM焦磷酸钠，1 mMβ-甘油磷酸盐，蛋白酶抑制剂鸡尾酒，然后在4°C下进行超声处理和插入15分钟。一夜之间将细胞裂解物与各自的抗体孵育。通过在20,000g下离心10分钟，预先清除蛋白质聚集体，然后将蛋白A/G珠（1：250，用ODG缓冲液或裂解缓冲液平衡）在4°C下再添加3小时。将珠子离心，并用100倍的ODG缓冲液或裂解缓冲液洗涤3次（通过在2,000g下以2,000克离心）在4°C下洗涤，然后与等体积的2×SDS样品缓冲液混合10分钟，然后在免疫印迹之前煮沸10分钟。

　　对于异位表达的PEN2或ATP6AP1的IP，用不同的表达质粒转染了6 cm的HEK293T细胞。转染后24小时，收集细胞并将其裂解在500 µL冰冷的裂解缓冲液中，然后在4°C下进行超声处理和离心15分钟。抗HA（1：100）或抗MYC（1：100）抗体，以及蛋白A/G珠（1：100）或抗FLAG M2亲和力凝胶（1：200，裂解缓冲液中的预先平衡），将其添加到上清液中，并在4°C下混合4 h。将珠子用200倍的裂解缓冲液洗涤3次，然后在4°C下用相等的体积2×SDS样品缓冲液洗涤，并在免疫印迹之前煮沸10分钟。探测APH1A和OCT1的样品未煮沸，以避免形成不溶的聚集体。

　　为了分析MEF，HEK293T细胞和原发性肝细胞中P-AMPKα和P-ACC的水平，将细胞生长至70–80％融合（除了肝细胞除外，肝细胞除外，这些细胞在6孔的孔中与250μllypeffersis cy-coff Fuffers裂解，在6孔的孔中散发至60-70％融合）。然后将裂解物在4°C下以20,000克离心10分钟，并将等体积的2×SDS样品缓冲液添加到上清液中。然后将样品煮沸10分钟，然后直接受到IB。

　　为了分析肝脏中P-AMPKα和P-ACC的水平，在指定的治疗后将小鼠麻醉。如上所述，新鲜切除的（或冷冻夹）组织用冰冷的裂解缓冲液（10μlmg-1肝脏重量）裂解，然后进行均匀化和离心液。然后将裂解物与2×SDS样品缓冲液混合，并经过IB。为了分析线虫中P-AMPKα和P-ACC的水平，为每个样品收集了在NGM板上培养的150个线虫。将蠕虫迅速用含有Triton X-100的冰冷的M9缓冲液洗涤，并用150μl冰冷的裂解缓冲液裂解。然后将裂解物与5×SDS样品缓冲液混合，然后如上所述进行均匀化和离心，然后进行IB。如前所述46进行了小鼠肠中PEN2表达的分析。简而言之，在安乐死后立即除去肠道的十二指肠段，并用含有抑制剂混合物的预先冷的PBS洗涤两次（1 mM PMSF，5μgml– 1抑制蛋白，1μgml– 1 pepstatin a，1 pepstatin a，2μgml-1 liupeptin a，2μgml– 1 liupeptin，1 ml – 1 mm na3vo4和1mm和1mMMM.然后将组织在裂解缓冲液中匀浆并超声处理，然后如上所述进行均匀化和离心。如上所述，所有样品均在制备的同一天进行IB，并避免了任何冻融周期。

　　对于IB，SDS-聚丙烯酰胺凝胶是在主场准备的。简而言之，通过将1.9 ml的30％丙烯酸/BIS溶液，1 ml的10倍较低缓冲液（3.5 m Tris，1％（w/v）SDS，pH 8.8）和0.48 mL的65％（W/V）糖（65％（w/v）糖溶解）与水与6.62 ml混合，制备了解决凝胶溶液（8％，10 mL）的制备。并通过将668μl的30％丙烯酰/BIS溶液和1.25 mL 4×4×堆叠缓冲液（0.5 m Tris，0.4％（w/v）SDS，pH 6.8）混合，制备堆叠凝胶溶液（4％，5 mL）。对于每个玻璃凝胶板（带有1.0毫米的垫片，CAT。1653308和16533311，Bio-Rad），需要大约7 mL分辨凝胶溶液和2.5 mL堆叠凝胶溶液。将APS（达到0.1％（w/v）最终浓度）和TEMED（至0.1％（v/v）最终浓度）添加到解决凝胶溶液中。在丙烯酰胺聚合之前，分辨凝胶用2 ml的75％（v/v）乙醇覆盖。大约20分钟后（看到分辨凝胶和乙醇之间的清晰线），将覆盖的乙醇倒出，用滤纸干燥，然后在室温下再放置15分钟，以使乙醇完全蒸发。然后将凝胶盒装在AP/TEMED补充的堆叠凝胶溶液中，然后放置15孔梳子，然后在室温下放置20分钟。卸下梳子后，在样品加载之前，用运行缓冲液（25 mm Tris，192毫米甘氨酸，1％（w/v）SDS，pH 8.3）冲洗凝胶。将小于10μl的样品加载到井中，并通过迷你蛋白酶四局电泳细胞（Bio-Rad）在100 V下运行电泳。在这项研究中，除了PEN2，APH1A – APH1A，PS1，PS1，PS2，PS2，LAMTOR1，CYTOCHROME C和ATP6V0C外，所有样品均在8％分解的凝胶上解析，除了15％的凝胶为8％（制备为8％）（这些凝胶为8％），除了最终浓度为15％Acryl/bis/bis/bis/bis/bis/bis/bis/bis/bis/abs ando ando ando ando and ando and and amp ando and amp ando and amps and amp。在10％的凝胶上。为了转移已解决的蛋白质，预切割的PVDF膜（0.45μm， 猫。将IPVH00010，默克）在甲醇中孵育1分钟，然后在预冷的转移缓冲液（25 mm Tris，192 mM甘氨酸，10％（V/V）甲醇）中平衡并浸泡超过5分钟。准备凝胶/膜三明治后，在小型反式印象细胞（Bio-Rad）在4°C下使用100 V的电压进行转移。然后将印迹的PVDF膜在阻塞缓冲液中孵育（5％（w/v）BSA或5％（w/v）的非脂肪牛奶（根据抗体供应商的说明）溶于TBST中，该牛奶溶于TBST，该牛奶由40 mm Tris，275μmNacl，0.2％（V/V）组成，或者是275μmNacl，v/v/v）。然后用TBST两次冲洗，每次5分钟。The PVDF membrane was incubated with the desired primary antibody (diluted in TBST supplemented with 5% BSA and 0.01% (m/v) NaN3) overnight at 4 °C on an orbital shaker with gentle shaking, followed by rinsing with TBST 3 times, 5 min each at room temperature, and then the secondary antibodies were incubated for 3 h at room temperature with gentle shaking.然后除去二抗（在TBST中稀释），并在室温下用TBST 3次，每次5分钟进一步洗涤PVDF膜。将PVDF膜在ECL混合物中孵育（通过将相等的ECL溶液和过氧化物溶液混合5分钟），然后将每个膜放在塑料包裹上，并用医疗X射线膜（Fujifilm）在轻度盒子中放置在浅色的盒子中，以实现所需的时间。然后，使用X-Amat MX开发人员和补充剂和XAMAT MX FIXER和补充溶液（Carestream）开发薄膜，并在医疗X射线处理器（Carestream型号）上开发。使用Epson扫描软件（V.3.9.3.4）使用Perfection V850 Pro扫描仪（EPSON）扫描开发的膜，并使用Photoshop 2021软件（Adobe）裁剪。在单独的凝胶上分析了总蛋白质和磷酸化蛋白的水平， 显示了代表性的免疫印迹。使用Image J软件（V.1.8.0，美国国立卫生研究院免费软件）量化了发达电影的频段强度。

　　在10厘米培养皿中培养的小鼠原发性肝细胞用二甲双胍或胰高血糖素作为对照。然后通过用1 ml的Trizol（每盘10厘米）裂解细胞制备总RNA，然后加入270 µL氯仿和剧烈混合。在4°C下以12,000克离心15分钟后，将510 µL上水层转移到干净的管中。然后通过在4°C下以12,000g的速度在12,000g下离心15分钟，从而使RNA沉淀。将沉淀用75％乙醇洗涤3次，以12,000g离心5分钟，并溶解在30 µL DEPC处理的水中。使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Scientific）确定RNA的浓度。将总共​​4 µg的RNA用经DEPC处理的水稀释至65°C的最终体积，持续5分钟，然后立即在冰上冷却。然后将随机底漆混合物，酶混合和5×RT缓冲液（全部来自Revertra ACE QPCR RT套件）添加到RNA溶液中，然后在37°C下在37°C下孵育15分钟，然后在98°C下在热环生中孵育5分钟。用Maxima Sybr绿色/ROX QPCR Master Mix在LightCycler 96系统（Roche）上用以下程序进行量子：在95°C的预污染10分钟上，将反向转录的cDNA定量；在95°C下定位10 s，然后在每个周期中退火并在60°C下延伸30 s；循环编号：40。以下引物对用于qPCR：小鼠肌动蛋白，5'-TTTGTGACCACAGCTGAGAGAGA-3'和5'-TGCCCATCATCAGGCAACTCG-3';小鼠G6PC1，5'-TTGTGGCTTCCTTGGTCCTC-3'和5'-CAAAGGGAACTGTTGCGCTC-3';小鼠PCK1，5'-CTCCTCAGCTGCATAACGGT-3'和5'-GTGGATA TACCCCGGCTGGC-3'。使用LightCycler 96软件（V.1.1，Roche）分析数据。

　　用500μl冰冷的HEPES裂解缓冲液（50 mm HEPES，pH 8.0，150 mm NaCl，1％（V/V/v/v/v/np）NP40与Protece cockeTor cocke cocketor，从六十cm菜肴中纯化的溶酶体（请参见下文，有关详细的程序，请参见下面的“溶酶体纯化”部分）裂解。离心后，将上清液与10μM合成的二甲双胍探针（MET-PS）在4°C下孵育2小时，然后暴露于365 nm波长UV（CX-2000，UVP）10分钟。然后将上清液调节至最终浓度为1 mM TCEP，0.1 mM TBTA，1 mM CUSO4和1 mM Biotin-N3接头，并在4°C下孵育1小时。通过在20,000克离心15分钟通过离心清除蛋白质聚集体，然后将中性蛋白珠（1：100）添加到裂解液中，持续2小时，并轻轻旋转。然后，用100×体积的HEPES裂解缓冲液在4°C洗涤3次，然后与等体积的2×SDS样品缓冲液，然后用SDS凝胶电泳混合。用染色溶液（1％（m/v）Coomassie亮蓝色R-250染料溶解在45％（v/v）甲醇中，水中的10％（v/v）乙酸）染色30分钟，然后在接受MS分析之前将无R-250染料脱色，无需R-250染料染色。

　　为了验证通过下拉的二甲双胍结合，从10厘米的HEK293T细胞（生长至80％汇合）中制备了蛋白质，每盘中用10μg指示的质粒转染了24小时。样品与使用溶酶体的样品类似制备，并使用指定的抗体进行免疫印迹。

　　为了通过MS鉴定PEN2上的二甲双胍结合位点，使用了10μg标记的PEN2（从HEK293T细胞中表达和纯化）。样品与使用超声处理以外的溶酶体类似制备。

　　为了确定Axin的溶酶体定位，在室温下，在PBS中固定在6孔盘中盖上80％汇合的细胞在6孔盘子中固定20分钟。将盖玻片用PBS两次冲洗，并在4°C下用0.1％（v/v）Triton X-100透化5分钟。用PBS冲洗两次后，将盖玻片与抗Xchin和抗LAMP2抗体（均为1：100，在PBS中稀释）在4°C下孵育。然后将细胞用1 mL PBS冲洗3次，然后在黑暗中的室温下与二抗孵育8小时。将细胞用1 ml PBS再洗4次，然后使用延长的钻石抗固定植物安装在载玻片上。共聚焦显微镜图像是在Zeiss激光扫描显微镜（LSM）780上拍摄的，具有×63，1.4 Na油的目标。

　　为了检测溶酶体的pH值，将细胞在35毫米的玻璃底菜肴上生长，并培养至60-80％的融合。将细胞用1μM（终浓度）溶血传感器绿色DND-189处理1小时，然后用PBS洗涤两次，并在新鲜培养基中再孵育30分钟。同时，将2μgml– 1（最终浓度）Hoechst以及延长的活反射试剂加入到培养基中，以在拍摄图像之前染色细胞核。为了确定线粒体膜电位，将细胞与10μMJC-1染料在37°C下孵育20分钟，用PBS洗涤两次，然后在拍摄图像之前在新鲜培养基中孵育。通过红色（在590 nm处发射）分析线粒体膜电位：JC-1染料的绿色（在529 nm）荧光强度比（在488 nm处激发）。为了确定MEF中的ROS，将细胞与5μm的Cellrox深红色在37°C下孵育30分钟，用PBS洗涤两次，然后在拍摄图像之前在新鲜培养基中孵育。在成像过程中，将活细胞保存在37°C，在加湿的孵化室中（Zeiss，孵化器PM S1）中保持5％CO2。使用具有×63，1.4 na油目标的蔡司LSM 780拍摄图像。

　　为了在秀丽隐杆线虫中检测ROS，将培养至L4阶段的同步蠕虫用二甲双胍处理24小时。将大约50个蠕虫浸泡在100μL的M9缓冲液中，其中含有0.05％Triton X-100和10μMCM-H2DCFDA在20°C下30分钟，然后用含有0.05％Triton X-100的M9缓冲液洗涤三倍。然后将蠕虫置于按照'C中所述的注射垫上。秀丽隐杆菌菌株的部分除外，使用了4％（w/v）琼脂糖。用带有×20，0.8 Na Plan-Apochromat空气目标的Zeiss LSM 900拍摄图像。

　　用于成像PEN2，如果使用了soptaret47，则使用半数。MEF在35毫米菜肴（猫D35-20-10-N，体外科学）上生长至50–60％的融合。用PBS用PBS冲洗细胞，并用缓冲液I（25 mM HEPES，pH 7.2，125 mm乙酸钾，5 mm乙酸镁，1 mm DTT，1 mg L – 1葡萄糖和25μgml– 1 digitonin）在冰上，然后在冰上，然后在Buffer II上2分钟（25 mmmmmmmmmmmmmmmhepes，ph），乙酸镁，1 mM DTT和1 mg L – 1葡萄糖）在冰上再持续15分钟。然后将细胞在室温下用PBS中的4％（v/v）甲醛处理10分钟。用PBS将载玻片冲洗两次，然后用0.05％（v/v）Triton X-100在PBS中透化5分钟。用PBS冲洗两次后，将载玻片在块缓冲液（10％FBS（V/V）中的PBS中封闭，含0.1％（m/v）皂苷）30分钟。将载玻片用PBS洗涤两次，并用在4°C的块缓冲液中稀释的原代抗体孵育。然后将细胞用PBS冲洗三次，然后在黑暗中在4°C下再与二抗孵育8小时，然后用PBS洗涤四次，然后使用延长的钻石抗FANTANTANT在滑梯上安装。图像是在具有×63，1.4 Na油目标的Zeiss LSM 780上拍摄的。

　　为了使用Zeiss LSM 780系统拍摄图像，使用了以下激光器：Hoechst Dye用二极管激光器设置为405 nm；Lysosensor，JC-1，Alexa 488和CM-H2DCFDA在488 nm处使用AR气体激光器（激光模块LGK 7812）可视化；用594 nm的Hene Gas激光器（LGK 7512 PF）可视化Alexa 594；在633 nm处使用Hene Gas激光器（LGK 7634）的Cellrox深红色。当使用Zeiss LSM 900拍摄图像时，CM-H2DCFDA使用激光模块urgb（CAT。400102-9301-000，Toptica，Toptica）使用10毫米激光线激发。这些参数，包括“ PMT电压”，“偏移”，“针孔”和“增益”，在每张照片之间保持不变。图像的分辨率为1,024×1,024像素。使用Zen 2012软件（用于Zeiss LSM 780）或Zen 3.1（适用于Zeiss LSM 900）的图像，并使用Photoshop 2021软件（Adobe）进行格式化。使用ImageJ软件（V.1.8.0，美国国立卫生研究院免费软件）量化了线虫肠中CM-H2DCFDA的强度。

　　MEF稳定表达的Ha – Pen2在实验室Tek II中培养。1.5德国盖玻璃系统（155409，8腔室，NUNC）至50％汇合，如果如上所述协议，则按照半完整的治疗，除了在兔抗HA TAG TAG TAG TAG抗体和大鼠抗体抗体和大鼠抗LAMP2初级抗体中孵育，然后用ATTO 488 GOAT ATTO ATTO ATTO ATTO ATTO ATTO ATTO ANTI ANTI-GOAT ANTI-RABBIT IG-RABBIT IG-MOUSE 64777.-M-647777777777777.-MOUST抗体。然后用4％（v/v）甲醛再固定载玻片再固定10分钟，然后用PBS洗涤两次。然后根据制造商的说明准备使用MEA的风暴成像缓冲液。简而言之，7μLGlox（14 mg葡萄糖氧化酶，50μL催化酶（17 mg ML – 1），200μl缓冲液A（10 mM Tris，pH 8.0和50 mM NaCl），涡旋以溶解并溶解并在冰上冷却），并添加了70μl1 MEA MEA（77 mG）（77 mg），MEL溶解为1.0 M.0 0. 0.0.0.0.0.0.0.0.25 ML溶解为1.0 ml oll oll oll oll oll oll oll oll oll oll os。在1.5-mL eppendorf管中，620μl缓冲液B（50 mM Tris，pH 8.0，10 mM NaCl和10％（m/v）葡萄糖），然后是短暂的涡流。然后将混合物添加到每个孔中，并在N-Storm（Nikon）上拍摄图像。使用倒置显微镜系统（TI-E完美焦点； Nikon）进行成像，该系统配备了单片激光组合仪（MLC400，Agilent），其中包含波长405 nm，488 nm和561 nm的固态激光器，在50 mW（最大纤维输出功率）（最大纤维输出功率）和647-Nm laser at 125555555555。找到合适的场后，获取衍射限制的TIRF图像进行参考，然后进行风暴采集。然后将647-nm激光依次以100％的功率启动，以激发所有可能的荧光团分子，然后将它们拍摄到非发射的黑暗状态，然后将其拍摄为488 nm激光。然后，由Alexa Fluor 647和Atto 488的发射波长通过Plan-Apochromat×100/1.49 TIRF物镜（Nikon）顺序收集，该物镜通过发射过滤器集（Nikon Tirf Cube（由TRF899902-EM滤膜，Chroma set，Chroma set，Chroma set，nikon tirf Cube）过滤， 并在电子式电荷耦合设备摄像头（IXON DU-897，ANDOR Technology）上检测到。在成像过程中，获取了每个通道的20,000个顺序帧。如前所述48,49，使用带有Storm软件包（V.4.30 Build 1053，Nikon）的NIS Elements软件（V.4.30 Build 1053，Nikon）进行图像采集，横向漂移校正和数据处理。

　　将细胞铺在96孔海马XF细胞培养微板（Agilent）上。对于原发性肝细胞，将微孔板与胶原蛋白预先涂在一起。将原发性肝细胞以每孔1,000个细胞的密度铺板，而MEF和HEK293T细胞的每孔以10,000个细胞为单位。在实验前一夜之间，将细胞在全培养基中孵育（Williams的E培养基E含1％（w/v）BSA，用于肝细胞的BSA，MEF和HEK293T细胞为10％FBS）孵育。然后，将培养基改为补充葡萄糖（MEFS和HEK293T细胞25 mm）的Seahorse XF碱基培养基（Agilent），肝细胞为10 mm），谷氨酰胺（4 mm）和丙酮酸（1mm）（1 mm），1 m。然后将细胞放在37°C的无二氧化碳XF96细胞外通量预备站（安捷伦）中。然后，在XF96细胞外通量分析仪（AgiLent）中在37°C下测量氧的消耗率，并在海马XF校准溶液（SeaHorse Bioscience，Agilent，Agilent）中的Seahorse XFE96传感器盒（Agilent）中进行了预定，在37-Free co2-free Concubator at 37°C C CO2-Free conubortor at Co2-Free nover intirgnight。然后在测定过程中将呼吸链抑制剂（10μM寡霉素，10μMFCCP和1μM抗霉素A和1μM鱼藤酮；所有终浓度）的混合物顺序添加到分析过程中。使用波2.6.1桌面软件（Agilent）收集数据，并根据制造商的说明导出到Prism 9（GraphPad）以进行进一步分析。

　　APEX2成像如前所述50进行，但进行了较小的修改。简而言之，将稳定表达APEX2标记蛋白的HEK293T细胞生长在3.5 cm的盘子上，其中包含1 ml DMEM至约70％的汇合。通过轻轻添加1 ml的4％（v/v）戊二醛溶液（在1倍磷酸盐缓冲液中稀释（0.1 m Na2HPO4：0.1 M NaH2PO4 = 81:19，在水中，pH 7.4），新鲜准备的）固定细胞。将细胞在戊二醛溶液中孵育10分钟，然后在冰上取代1 ml冰冷的2％（v/v）2％（v/v）戊二醛溶液（新鲜制备），再用1小时，然后在4°C的4°C下在4°C下溶于0.67％（v/v）戊二醛（新鲜准备的）溶液。然后，用1 ml冰冷的1倍磷酸盐缓冲液洗涤细胞5次，每个2分钟，然后在冰上添加1 ml 1 ml冰冷的20 mM甘氨酸溶液（在1次磷酸盐缓冲液中），然后在冰上用1×磷酸盐的缓冲液洗涤5次，每个2分钟。然后将细胞在1 mL新鲜制备的1×DAB溶液（0.5 mg ML – 1）中孵育，并补充了10 mM H2O2（全部溶解在1倍磷酸盐缓冲液中）40分钟，然后用1×磷酸盐缓冲液洗涤5次，每2分钟。然后将细胞用2％（w/v）的OSO4溶液在冰上1倍的磷酸盐缓冲液中染色30分钟，然后用冰冷的水洗涤5次，每只2分钟。然后将细胞在冰冷的2％（w/v）乙酸铀酰溶液中染色，在黑暗中在4°C下过夜，然后用冰冷的水洗涤5次，每个2分钟。然后通过在以下冰冷溶液中依次孵育细胞来进行脱水：20、50、70、90和100％（v/v）乙醇（在水中），每个乙醇（在水中），然后在室温下在无水乙醇中孵育5分钟。然后在室温下快速浸入乙醇/纺丝812个树脂（3：1）的混合物，以进行45分钟的孵育，然后在乙醇/树脂（1：1）在室温下混合2小时，然后在乙醇/树脂（1：3）中（1：3） 在室温2小时，最后在室温下100％树脂进行两轮树脂：第一轮一夜，下一轮4小时。然后将树脂完全排干，并用薄层的树脂层（总体积约为400μl，厚度低于1 mm），然后在热风烤箱中在60°C下烘烤48小时。冷却至室温后，将嵌入的细胞切成75 nm切片。图像是在电子显微镜上拍摄的（Hitachi，HT-7800）。

　　根据制造商的说明，使用溶酶体隔离试剂盒纯化溶酶体，但修改了。简而言之，通过直接在室温下取消收集60厘米（60-80％汇合）或200 mg小鼠肝的MEF，然后在37°C下500克离心5分钟。将细胞重悬于室温下含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的1倍提取缓冲液中，并在7毫升的Dounce均质均匀均匀均匀（Sigma，Cat。P0610）中浸入冰上，在冰上进行120杆，然后在1,000g，4°C下进行10分钟，然后在10分钟内进行离心率，产生了4°C，产生了辛酸后（pn）。然后将PNS在20,000g下离心20分钟，并通过轻柔的移液悬浮在1×提取缓冲液中，产生粗溶酶体分数（CLF）。将CLF的体积调节为2.4 mL，然后平均分为六个1.5 ml Eppendorf管（每管400μl）。将253μl的零件和137μl的1×optiprep稀释缓冲液加入每个CLF，并通过轻柔的移液添加。该混合物定义为稀释的OptiPrep馏分（DOF）。将每个DOF（0.8 mL）加载到一个11×60 mm离心管中，顶部为27％（0.4 mL）和22.5％（0.5 ml）OptiPrep溶液垫，然后用16％（1 mL），12％（0.9 mL）和8％（0.3 mL）替代覆盖。然后将管子在150,000g的SW60 Ti转子（Beckman）上离心4°C，并在4°C下4小时离心，并以12％OptiPREP溶液的顶部作为CLF收集。将馏分用两量PBS稀释，然后以20,000克离心20分钟。然后吸出上清液，沉积物是溶酶体的分数。

　　对于每种测定，使用了从MEF的两个10厘米菜肴中纯化的溶酶体。如前所述51，使用耦合分光光度法方法测量ATP水解活性，但进行了一些修改。In brief, lysosomes were suspended in ATPase assay buffer (50 mM NaCl, 30 mM KCl, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.0, 10% (v/v) glycerol, 1 mM MgCl2, 1.5 mM phosphoenolpyruvate, 0.35 mM NADH, 20 U ml–1 pyruvate kinase and 10 U ml–1 lactate脱氢酶）具有5μM氯霉素A（用于计算V-ATPase特异性ATP水解活性）或DMSO，并在37°C下预热10分钟。该测定是通过添加5 mM ATP启动的，并且OD341由Spectramax M5微板读取器连续记录。

　　如前所述52,53，通过测量ATP依赖性的FITC-DEXTRAN荧光淬灭的初始速度（在测定过程中的早期反应周期，在测定过程中的早期反应周期，在升级之前逐步升级）来评估ATP依赖性质子转运活性。简而言之，通过在DMEM中孵育补充2 mg ML – 1 FITC -DECTRAN（最终浓度）的DMEM中的细胞在冰上加载FITC -dectran，然后转移到37°C的孵化器中30分钟。将细胞用DMEM洗涤3次，并在37°C下再与DMEM再孵育30分钟，以使FITC -DEXTRAN转运至溶酶体。收集细胞，如上所述纯化溶酶体。将溶酶体重悬于测定缓冲液中（125 mM KCl，1 mm EDTA，20 mm HEPES，pH 7.5，与KOH），并在冰上平衡1小时，然后与5μm依克纳米霉素A混合（用于计算V-ATPase特异性蛋白质转运活性）或DMSO或DMSO，然后在377°°C中进行37°°C c。使用Spectramax M5微板读取器以490 nm的激发记录FITC的荧光，并在520 nm处发射。在添加5 mM MG-ATP（最终浓度）后测量荧光猝灭的初始斜率。

　　线粒体如前所述纯化54，但修改次要27。简而言之，通过在室温下直接刮擦收集了二甲双胍处理的MEF的40厘米菜（60–80％汇合），然后在37°C下500克离心5分钟。然后将细胞重悬于20毫升冰冷的Ibcells-1缓冲液中（225毫米甘露醇，75毫米蔗糖，0.1毫米EGTA和30 mM Tris-HCl，pH 7.4），并在40 ml Dounce同层中以100杆的速度散发100盘（Sigma，cat。D9188），随后是40毫升的均值。4°C。然后在4°C下以7,000克离心上清液，并在7,000克离心10分钟。然后将颗粒用20 ml冰冷的IBCELLS-2缓冲液（225毫米甘露醇，75毫米蔗糖和30 mM Tris-HCl pH 7.4）洗涤两次。将悬浮液以7,000克离心，然后以10,000克离心，均在4°C下持续10分钟。然后将沉淀重悬于2 mL冰冷的MRB缓冲液中（250毫米甘露醇，5 mM HEPES pH 7.4和0.5毫米EGTA），并在10 mL的Percoll培养基上加载（225毫米甘露醇，225毫米甘露醇，25毫米Hepes pH 7.4，1毫米pH 7.4，1毫米EGTA和30％Percoll（14％），v/米，VIF（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）（VIF）。管（CAT。344059，贝克曼）。然后将管子在95,000克的SW41转子（贝克曼）上离心，在4°C下为0.5 h，并收集大约位于每个管子底部的密集带。将收集的馏分用10卷MRB缓冲液稀释，然后在4°C下以6,300g离心10分钟；将颗粒重悬于并用2 mL MRB缓冲液洗涤，然后在4°C下以6,300克离心10分钟。颗粒含有纯线粒体。

　　如先前所述55，纯化了细胞质。简而言之，将十个10厘米的细胞培养皿匀浆，在含有250 mM蔗糖，3 mM咪唑，pH 7.4的800μl均质化缓冲液（HB）中匀浆。然后通过连接到1-mL注射器的22号针头将匀浆穿过6次，然后以2,000克离心10分钟以产生PNS。然后将PNS样品加载到11×60 mm离心管的顶部，该管子已依次加载了1 ml的40.6％蔗糖（溶解在HB中），1 mL的35％蔗糖（溶解在HB中），HB中的1 mL，1 ml的25％碳糖（溶解在HB中）。然后将管子在35,000 r.p.m的SW60 Ti转子（Beckman）上离心。在4°C下1小时，并作为胞质分数收集顶部级分（约200μl）。

　　在悬架HEK293T细胞中表达了标记为标记的PEN2以及链球菌标记的ATP6AP1。每毫升5×106的总共200 mL细胞（通过锥虫蓝色染色确定，生存能力高于90％），用溶于2 mL的SMM 293-TII培养基中的每种质粒的200μg每个质粒转染，其中含有1,500μgPEI。48小时后，通过以2,000g离心收集细胞，然后用100 mL冰冷的裂解缓冲液裂解。然后将裂解物超声检查，并在4°C下再以20,000克离心30分钟。抗FLAG M2亲和力凝胶（1：100，在裂解缓冲液中平衡）或链霉亲和素琼脂糖（1：100，在裂解缓冲液中平衡）将其添加到上清液中，并在4°C下混合4 h。然后将珠子用200倍的裂解缓冲液洗涤3次，在4°C下洗涤3次。然后将蛋白质用1 ml的FLAG肽（400μgml -1终浓度）或Desthiobiotin（2.5 mM终浓度）洗脱，在4°C下再1 h。用15 mL的PBS缓冲液进一步稀释洗脱液，然后使用Amicon Ultra Ultra-15离心滤清器浓缩至1 mL，其Ultracel-10再生纤维素膜。在实验之前，进行了两次缓冲液交换的过程。值得注意的是，应在纯化后的同一天进行涉及上述蛋白质和纯化的蛋白质的实验，应避免任何冻融周期。

　　在VP-DSC（GE Healthcare）上进行了差异扫描量热法测定。VP-DSC在无反馈的模式下运行，并且在每次扫描之间和之间进行了20°C时的平衡15分钟。扫描范围从20到80°C设置为90°C H – 1的加热速率。该仪器通过与样品单元和带有PBS的参考细胞一起运行五个加热循环，可以预先校准该仪器。然后将样品单元在20μM二甲双胍（以PBS）或PBS中的1 mg Ml – 1处加载380μl标记的PEN2蛋白，并记录热容量（CP）的曲线与温度相比。使用VPViewer 2000软件（v2.66.7，GE Healthcare）收集数据，然后使用Origin 7软件（v.7.0552，Originlab）校正PBS基准并归一化扫描速率和蛋白质浓度56。

　　使用微局部ITC200等温滴定量热计（GE Healthcare）进行ITC，样品单元和参考细胞保持在25°C。在实验之前对该仪器进行了预定。将总共​​280μl标记的PEN2（在60μm处）和40μl二甲双胍（2 mM储备溶液），全部在PBS缓冲液中，分别加载到样品单元和注射器中，并将PBS加载到参考单元中。然后将二甲双胍滴定逐步滴定（第一次注射为0.4μl，在0.8 s的时间为0.8 s，在4个注射的其余注射中，在4 s期间为2μl，全部以恒定速度注射，每次注射之间的间隔为150 s），或者将PEN2溶液的间隔为150 s，或PBS作为对照。在滴定过程中，样品单元在1,000 r.p.m.使用ITC200软件（v.1.26.1，GE Healthcare）收集了二甲双胍– PEN2滴定期间获得的热变化的数据，并被二甲苯蛋白– PBS的滴定性数据减去，然后使用Origin 7软件（V.7.05552，OriginLAB）进行分析，该软件拟合了“两套站点”模型。

　　使用CM5传感器芯片在BIACORE T200上以25°C进行一式三份进行实验，并根据制造商的指示使用Biacore T200评估软件（GE Healthcare）分析数据。简而言之，用200μM1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基丙基）碳二酰亚胺（EDC）和50μMN-羟基糖糖酰亚胺（NHS）的混合物激活CM5传感器芯片上的细胞，在10μlmin-1 min – 1中激活。如上所述，总共纯化了20μl标记的PEN2或PEN2-2-2A蛋白（1 mg ML – 1），并调整为pH 4.0（通过与180μl10 mM乙酸钠溶液混合，pH 4.0），然后在10μl-1 min-1 min-1 min-1 min-min-1 min tus-min – 1 receTiver Runs上固定在细胞表面上。然后用1 M乙醇胺（10μlmin – 1 – 1持续10分钟）将细胞封闭。用作参考的相邻细胞被类似地激活和阻塞，除了调整为pH 4.0的PBS用于固定。然后用PBS平衡两个细胞。将二甲双胍储备溶液（2 mm）稀释至一系列浓度（6.25、3.125、1.5625、0.78125和0.05μm（全部为PBS）），并在每次运行中以30μl -min – 1的速度流动150 s。在每种流的结束时，将细胞用10μlmin – 1的10 mM甘氨酸-HCL（pH 2.0）溶液再生5分钟。使用BIACORE T200对照软件（v。2.0，GE Healthcare）收集了来自样品单元的数据，并被参考单元中的数据收集。通过使用BIACORE T200评估软件（V.2.0，GE Healthcare）将数据全局拟合到1：1 Langmuir结合模型中获得关联和解离常数。将数据导出到Origin 7软件（V.7.0552，OriginLAB）以生成最终数字。

　　使用配备有XB-C18色谱柱（30×250 mm，5μm，Welch材料）的制备HPLC（帆1000，Welch材料）纯化化合物。使用配备有ACDA检测器（Waters）具有ESI模式的自动化LC Prep系统收集了用于化合物表征的质谱。高分辨率质谱是在Q Quartive Orbibrap质谱仪（Thermo Scientific）上获得的。NMR spectra were measured on an Avance III 600 MHz NMR spectrometer (Bruker) using tetramethylsilane as the internal standard, and the chemical shift was reported in δ (ppm), multiplicities (s = singlet, d = doublet, t = triplet, q = quartet, p = pentet, m = multiplet and br = broad), integration and coupling constants (J in Hz).1H和13C化学位移相对于DMSO-D6的溶剂：ΔH2.50和ΔC39.5。

　　如先前所述57合成了生物素-N3连接器，如前所述58，光活性二甲双胍探针。In brief, metformin (converted from its hydrochloride form as previously described59; 50 mg, 0.387 mM, 1.0 eq), 3-(but-3-yn-1-yl)-3-(2-iodoethyl)-3H-diazirine (189.8 mg, 0.120 ml, 0.765 mM, 1.98 eq) and anhydrous acetone (1.0 ml) were stirred at23°C持续18小时。然后将混合物在室温下降低的压力下蒸发，然后在制备HPLC上纯化。流动相缓冲液为H2O，流动相缓冲液B为甲醇。梯度如下：t = 0分钟，0％b;t = 3分钟，0％b;t = 18分钟，100％b;t = 30分钟，100％b，在20 mL min – 1时恒定流速。I型（以80％B期在Be期，称为MET-P1）和II型（以93％B期，Met-P2的洗脱）形式的二甲双胍探针作为白色固体获得，其产率分别为12.7％（18.5 mg）和3.2％（4.7 mg）。

　　I型（Met-P1），1H-NMR（600 MHz，DMSO-D6）：δ7.52（t，j = 5.4 Hz，1H），6.57（S，4H），2.97（DT，J = 7.5，5.4 Hz，2H），2H），2.90（s，6h），2.85（s，6h），2.85（2.85（t，t，t，j = 2.7 = 2.7 = 2.7 = 2.7 = 2.7 = 2.7 = 2.7 = 00）2.7 Hz，2h），1.62（t，j = 7.4 Hz，2h），1.58（t，j = 7.3 Hz，2h）;13C-NMR（150 MHz，DMSO-D6）：Δ159.45，156.58，83.14，71.90，37.95，37.95，37.45，32.18，3.18，31.25，27.05，27.05，12.71;HRMS（M/Z）：[M-I]+计算C11H20N7+，250.1775;发现，250.1772。

　　II型（MET-P2），1H-NMR（600 MHz，DMSO-D6）：δ7.22（S，2H），6.96–6.26（Br M，3H），2.97-2.93（M，2H），2.92（M，2H），2.92（S，S，6H），2.851.60（DT，J = 7.4，2.2 Hz，4H）;13C-NMR（150 MHz，DMSO-D6）：δ154.20、109.53、83.14、71.82、37.48、31.99、31.41、27.13、12.70;HRMS（M/Z）：[M-I]+计算C11H20N7+，250.1775;发现，250.1770。

　　为了鉴定二甲双胍相互作用的蛋白质，将拉下来的生物素化蛋白进行SDS-page进行。用coomassie亮蓝色R-250染料染色后，将凝胶脱色，切除的凝胶片段进行了凝胶内胰蛋白酶消化并干燥。在配备了CaptivesPray源的Timstof Pro（Bruker）上分析样品（BRUKER），或者是nanolc 425 System（SCIEX）与5600+质量光谱仪（SCIEX）耦合的Nanolc 425 System（SCIEX）。将肽溶解在10μl0.1％甲酸（V/V）中，并加载到自制的C18柱上（35 cm×75μm，ID为1.9μm，100Å）。然后将样品用3–35％乙腈（v/v，0.1％甲酸）的线性梯度以0.3μlmin – 1的速度洗脱60分钟。使用以PaseF模式运行的TIMSTOF PRO质谱仪（BRUKER）获取MS数据，并使用峰工作室软件（X+，生物信息技术解决方案）或5600+质谱仪进行分析，并使用ProteinPiLot软件（V.5.0，SCIEX）分析。在数据分析过程中使用了小鼠Uniprot参考蛋白质组数据库。

　　为了确定PEN2相互作用的蛋白，将HA标记的PEN2免疫沉淀剂（从稳定表达HA标记的PEN2的21 cm菜肴中免疫沉淀）进行了SDS-PAGE，并处理如上所述。如上所述进行了数据采集，只是使用了配备了易于涂抹纳米库的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Spectmometer（Thermo Scientific）耦合到Orbitrap Fusion Lumos Tribrid频谱仪（Thermo Scientific）。使用蛋白质组发现器（V.2.2，Thermo Scientific）对小鼠Uniprot参考蛋白质组数据库分析数据。

　　为了鉴定PEN2上的二甲双胍结合位点，对Met-P1偶联的标记PEN2（从悬浮液HEK293T细胞中纯化）进行了SDS-PAGE，并如上所述进行处理。对Timstof Pro进行了MS分析，只是设置了峰X+软件的以下参数：（1）前体离子质量公差：15 ppm;（2）碎片离子质量耐受性（误差耐度）：0.05 DA;（3）两种漏洞的胰蛋白酶特异性：允许；（4）选择单异位素前体质量和片段离子质量的模式；（5）选择半胱氨酸氨基甲基化的固定修饰模式；（6）可变修饰，包括蛋白质的N-乙酰化，氧化@m和222.17@x。

　　如前所述6，通过基于毛细管电泳的MS分析了来自细胞或组织的ATP，ADP和AMP。简而言之，每个测量所需的细胞从10厘米盘（60–70％汇合）或100 mg肝组织通过冻结夹解剖。为了分析代谢产物，将细胞用20 ml的5％（m/v）甘露醇溶液（溶于水）冲洗，并立即冷冻在液氮中。然后将细胞用1 ml含有内部标准的甲醇1（IS1（人代谢组技术，H3304-1002，1：200）裂解，用于标准化代谢物强度并调整迁移时间），并从菜肴中刮除。为了分析肝脏中的代谢产物，在指定的治疗后将小鼠麻醉。通过冻结夹切除组织，然后用50μMIS1磨碎1 mL甲醇。然后将裂解液与20 s的涡旋与1 ml氯仿和400μl水混合。在4°C下以15,000克离心15分钟后，收集450μl水相，然后通过在4°C下以12,000g的速度离心3 h h 3 h h 3 h h 3 h h 3 h h 3 h h 3 h h 3 h h。同时，通过将每个样品中的100μL水相结合，然后类似地过滤来制备质量控制（QC）样品。The filtered aqueous phase was then freeze-dried in a vacuum concentrator (Labconco, CentriVap Benchtop centrifugal vacuum concentrator, equipped with a CentriVap −84 °C Cold Trap and a Scroll vacuum pump) at 4 °C, and then dissolved in 100 μl of water containing Internal Standards 3 (IS3 (Human metabolome Technologies, H3304-1104,1：200），调整迁移时间）。然后将总共20μl的重新溶解溶液加载到带有圆锥形插入物的注射小瓶中，用于CE-QTOF MS（Agilent Technologies 7100，配备6545个质谱仪）分析。使用Masshunter LC/MS采集10.1.48（安捷伦）收集数据，并使用定性分析B.06.00（Agilent）处理。使用完整扫描模式测量AMP，ADP和ATP的水平，M/z值分别为346.0558、426.0221和505.9885。请注意，ADP和ATP的一部分可能在源源片段化过程中损失一个磷酸组，因此留下与AMP和ADP相同的M/Z比率，应根据其在毛细管中不同的保留时间进行校正。因此，ADP的总量是M/z 346.0558频谱图的后一个峰和M/z 426.0221频谱图的前一个峰，并且适用于ATP。

　　为了分析线虫中的ATP，ADP和AMP，进行了HPLC -MS。简而言之，将150个线虫保持在NGM或siRNA板上（有或没有50 mm二甲双胍）48小时，用含有Triton X-100的冰冷M9缓冲液洗涤。通过以100克的速度迅速向下旋转5 s来去除细菌。然后将线虫立即裂解在1 ml甲醇中，然后与1 ml氯仿和400 µL水混合（含4 µg ML – 1 [U-13C] - 谷氨酰胺），然后用20 s的涡旋。在15,000g下在4°C下再离心15分钟后，收集了800 µL水相，在4°C下在真空浓缩剂中冻干，然后溶解在30 µl的50％（v/v，在水中）乙腈。AMP和ATP级别的测量基于参考。60使用QTRAP MS（SCIEX，QTRAP 5500）与UPLC系统（Sciex，exionlc AD）连接。将总共​​2 µL的每个样品加载到Hilic柱上（Zic-Philic，5μM，2.1×100 mm，PN：1.50462.0001，Millipore）。流动阶段由15 mM乙酸铵组成，其中含有3 mL L – 1氢氧化铵（> 28％，V/V），在LC-MS级水（流动A期A）和LC-MS级90％（v/v）乙腈（V/V）乙腈（在LC-MS级水中（流动B）在0.2 mL的流量下运行。用以下HPLC梯度洗脱程序分开AMP，ADP和ATP：95％B持续2分钟，然后在13分钟内持续到45％B，持续3分钟，然后返回95％B，持续4分钟。质谱仪以负模式在涡轮V离子源上运行，喷雾电压为-4,500 V，550°C时的源温度，50 psi的气体1号，在55 psi的2号气体2和40 psi的窗帘气体。使用多个反应监测模式测量代谢产物，并使用分析标准进行了重新定位的电势和碰撞能量。以下过渡用于监测每种化合物：505.9/158.9和505.9/408.0用于ATP；425.9/133.9，425.9/158.8和425.9/328.0用于ADP；345.9/79.9，345.9/96.9和345.9/133.9 for amp; [U-13C] - 谷氨酰胺为149.9/114。使用Analyst 1.7.1软件（SCIEX）收集数据，并使用多物种3.0.3软件（SCIEX）分析了代谢产物的相对量。请注意，ADP和ATP的一部分可能会在源源片段化期间损失一个或两个磷酸基团，从而留下与AMP和ADP相同的M/Z比，根据列中其不同的保留时间进行了校正。

　　为了定量细胞，组织或线虫中的AMP，ADP和ATP，[U-13C，15N] AMP，[U-13C，15N] ADP和[U-13C，15N] ATP溶解在各个裂解物中的ATP用于生成相应的标准曲线，以通过绘制标记的AMP，ADP AMP或ADP（ADP）和ATP（ADP）和ATP（ADP）的比例（或）（ADP）和ATP（ADP），或者是ADP或ATP的产品（或）（adp a）。[U-13C] - 谷氨酰胺（用于HPLC – MS），与标记的AMP，ADP或ATP相对浓度。根据标准曲线估算了AMP，ADP和ATP的量，然后除以蛋白质湿重。每个样品的蛋白质湿重在室温下以0.2 M KOH溶解自然干燥的蛋白质沉积物后，通过Bradford分析确定。

　　为了测量血清中的二甲双胍浓度，使用100μgl – 1的Bugrminin在水中与80％甲醇（v/v）收集的50μl血清与80％的甲醇（V/V）混合为内标。然后在4°C下以15,000克离心15分钟后收集水相。如在CE-MS测量中，制备了细胞，肝组织或肠道组织，除了从麻醉的，血液中的小鼠中收集肝脏和肠道组织（每个50 mg），并且不需要超滤。另外，在均匀化之前，将细胞或肝组织用PBS冲洗。线虫样品与HPLC -MS测量腺苷酸盐的测量一样。在连接到UPLC系统（SCIEX，exionLC AD）的QTRAP MS（SCIEX，QTRAP 6500+）上进行测量。将总共​​2 µL的每个样品加载到一个Philic柱上（Zic-Philic，5μM，2.1×100 mm，PN：1.50462.0001，Millipore）。流动相由在LC-MS级水（流动型A）和LC-MS级乙腈中包含0.1％甲酸盐（V/V）的10 mM氨甲酸甲酸盐组成，其中包含0.1％（v/v）甲酸甲酸（V/V）在LC – MS级水（流动相B）中以0.3 ml mil min-1 – 1的流量运行。HPLC梯度如下：95％B持续1分钟，然后在6分钟内持续到40％B，持续1分钟，然后在7.5分钟内持续到95％B，并保持2.5分钟。QTRAP质谱仪在涡轮V离子源上运行，并以 -5,500 V的喷雾电压运行，源温度为500°C，在50 psi的气体1号，55 psi的气体2号，在40 psi的窗帘气体。使用多个反应监测模式测量化合物，并使用分析标准来优化清除电势和碰撞能。使用以下过渡来监测每种化合物：二甲双胍的130/71，bugurmin的158.1/60。在每个实验中生成了标准曲线以进行定量。使用分析师1.6.3软件（SCIEX）收集数据， 并使用多物质3.0.2软件（SCIEX）分析了代谢物的相对量。MEF的平均细胞体积估计为2,263μm3，HEK293T细胞为4,240μm3和原代肝细胞，使用IMARIS 7.4.0软件（BITPLANE）17,062μm3，使用CDFA-SESE标记的细胞使用Zeiss LSMM780。

　　通过分析用[U-13C]葡萄糖或[U-13C]棕榈酸（PA）的细胞中标记的TAG的含量来确定TAG合成速率。葡萄糖溶解在PBS中，PA在使用前将PA与BSA结合。共轭PA，首先通过搅拌将200 mg的PA溶解在20 ml乙醇中，然后用156μl的5 m NaOH滴入滴水。浆液不断搅拌12小时，从而导致乙醇的完全蒸发。然后将干燥的沉积物用10％的无脂肪酸BSA溶解至最终浓度为2 mm。

　　在实验之前，将原发性肝细胞分离并在含有1％BSA的DMEM中培养。然后将细胞在补充25 mM [U-13C]葡萄糖和1％BSA的无葡萄糖DMEM中孵育，或含有100μM[U-13C] PA和1％BSA的DMEM再孵育12小时。将10厘米盘上的细胞用25 mL PBS两次冲洗，并立即冷冻在液氮中。然后将细胞用1 ml含有TAG的甲醇（15：0/15：0/15：0）裂解为内标，并从盘子中刮下来。然后通过20 s的涡旋将裂解液与1 mL氯仿和400μl水快速混合。在4°C下以15,000克离心15分钟后，收集了700μl有机相，然后在室温下用氮气在压力吹气的浓缩剂（MGS-2200，Eyela）上用氮溶液化。在Shimadzu突出的UPLC系统（Nexera UHPLC LC-30A）上与配备了ESI源配备的Tripletof 5600+系统（SCIEX）进行分析。将冻干的样品溶解在20 µL二氯甲烷/甲醇溶液（2/1，V/V）中，并用380 µL甲醇/异丙醇/H2O溶液（65/30/5，V/V/V）稀释。注射体积为5 µL。通过C8柱（2.1×100毫米，粒径为1.7μm，CAT。186002878，水域）分开标签，柱温度保持在55°C。移动相由乙腈/H2O（60/40，v/v）（流动相A）（流动相a）和10毫米胺甲酸的10毫米胺甲酸和异丙醇/乙腈（90/10，v/v）（流动相B）组成，并以0.26 ml的流量运行。梯度如下：32％B持续1.5分钟，然后在19.5分钟内增加到97％B，持续4分钟，然后返回32％B，再保持5分钟。移动相的流速设置为0.26 mL min – 1。质谱仪以信息依赖性采集（IDA）模式运行，源温度为550°C，离子源气体1和2在55 psi下，窗帘气体在35 psi处的窗帘气， 40 eV的碰撞能，离子喷雾电压漂浮在5.5 kV，质量范围为500–1,250 m/z。完整扫描的积累时间设置为150毫秒，每个IDA扫描的累积时间为45 ms。强度大于100 c.p.s的代谢产物的峰在选择10轮IDA扫描中的信号后，选择了进一步分析。使用分析师TF 1.6软件（SCIEX）收集数据，并使用MS-DIAL 4.7软件（RIKEN）分析数据，通过该软件（Riken），将反卷积和流线标准用于峰/TAG标识。

　　通过[U-13C] PA处理的细胞中的TCA循环的标记中间体确定β氧化的速率。将原发性肝细胞培养并视为用于测定TAG合成的细胞。用PBS两次冲洗细胞，在液氮中冻结，然后在含有10 µg ML – ML – 1 Myristic-D27酸的水中用1 ml的80％甲醇（V/V）裂解，作为内标，然后是20 s的涡旋。在4°C下以15,000g离心1分钟后，将600 µL上清液（水相）在4°C下冷冻干燥。然后将冻干样品与50 µL新鲜制备的盐酸甲氧基胺（吡啶中的20 mg ML – 1）混合后，将冻干样品涡旋1分钟，然后在4°C孵育1小时。通过在冰浆中沐浴10分钟，在0°C下对混合物进行超声检查，然后在37°C下孵育1.5小时，然后与50 µL MTBSTFA混合并在55°C孵育1小时。在接受GC -MS之前，将样品以15,000克离心10分钟，将60μl的上清液加载到注射瓶中。使用GC/MSD仪器（7890-5977b，Agilent），在HP-5ms柱（30 m×0.25 mm I.D.，0.25μm膜厚度）上进行GC。喷油器温度为260°C。首先在70°C保持圆柱烤箱温度2分钟，然后以7°C min – 1的速率增加到180°C，然后以5°C min -1 – 1的速率以250°C的速度，然后以25°C的速度为25°C min – 1，在其持续15分钟。MSD转移温度为280°C。MS四极和源温度分别保持在150°C和230°C下。使用MassHunter GC/MS采集软件（B.07.04.2260，Agilent）收集数据，并使用GC-MS MassHunter Workstation定性分析软件（V.B.07.01SP1，Agilent）分析数据。

　　除生存曲线外，使用Prism 9（GraphPad软件）进行了统计分析，该生存曲线使用SPSS 27.0（IBM）进行了分析。每组数据都经过Kolmogorov – Smirnov测试，Anderson -Darling测试，D'Agostino -Pearson Omnibus测试或Shapiro -Wilk – Wilk检验，以便在适用的情况下进行正态分布。未配对的两尾学生的t检验用于确定两组正态分布数据之间的重要性。韦尔奇的校正用于差异不平等的群体。未配对的两尾Mann-Whitney检验用于确定数据之间没有正态分布的数据之间的显着性。为了进行多个组之间的比较，使用了普通的单向或双向方差分析（ANOVA），然后使用Tukey's，Sidak's，Dunnett's或Dunn的测试。使用f检验测试了误差方差均匀性的假设（p> 0.05）。为了比较有两个固定因素的多个组，使用了普通的双向ANOVA或双向重复测量方差分析（用于GTT，ITT和PTT数据），然后进行Tukey或Sidak的多重比较测试，如《传奇》中指定的。Geisser – Greenhouse的校正在适用的情况下使用。调整后的手段和S.E.M.或S.D.当分析符合上述标准时，记录了记录。当p时，差异被认为是显着的< 0.05, or P >0.05，观察到的效果差异很大（如参考文献61,62中所示）。所有特定的统计细节都可以在图标题和源数据中找到。所有没有生物学重复的图像都代表了至少三个独立实验的图像。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。