本研究中使用的酿酒酵母菌株，质粒和底漆分别在补充表1-3中列出。使用质粒洗牌近21，使用TIM17洗牌菌株（YPH499TIM17Δ+YEP352-TIM17）生成表达野生型TIM17或突变蛋白的酵母菌菌株。TRP1可选的PFL39-TIM17（包含本地启动子和终结剂区域）或相关质粒编码相关突变版本，然后选择5-氟氧酸（5-FOA）板上选择的TRP1转换，或相关的质粒。没有尿嘧啶的补充混合物（CSM）氨基酸（MP生物医学），0.005％（WT/Vol）尿嘧啶（Sigma），2-3％（WT/Vol）葡萄糖和3％（WT/VOL）琼脂（Becton Dickinson）（Becton Dickinson）恢复了宽度的副本，该均具有频率。5-FOA板。可调节的tim17 lage菌是通过在TIM17启动子的上游和下游的区域的侧面含有gal启动子和抗生素抗性的PCR盒子产生的。TOM22Δ+YEP352-TOM22（参考56,57）导致Tom22Δ的产生，PGAL-TIM17+YEP352-TOM22。（可选择）使用限制性酶Ecori（NEB）转换为TOM22Δ，PGAL-TIM17+YEP352-TOM22使用上面用葡萄糖和葡萄糖交换为2％（WT/VOL）的质子2％（wt/vol）在选择中介绍了tim2 protiN ats prots a prots nater， PGAL-TIM17+PFL39-TOM22-TIM17 WT或D17A_D76A突变体通过同源重组如所述57。TIM23洗牌和TIM17 – TIM23双休息株是通过TIM23（和TIM17）通过野生型Tim23（和野生型TIM17）在URA3上补充的TIM23（和TIM17）产生的。为了在TIM17 SCF和TIM23 CF背景中研究TIM17和TIM23半胱氨酸突变体，使用ECORI（NEB）通过PFL39-TIM23CF的PCR扩增了带有天然启动子和终端区域的TIM23CF，并插入PFL39-TIM23CF，并插入PFL39-TIM23CF，并插入PFL39-TIM23CF（TRP1可选）。随后将TIM17和TIM23半胱氨酸突变体在该载体中制成，并通过上述质粒洗牌引入TIM17 – TIM23双剃管菌株。为了创建TIM172XSTREP-和HISSUMO*TIM23表达菌株，将甘氨酸 - 丙氨酸 - 甘氨酸接头（GGGGAGGGG）和2XSTREP标签放置在TIM17开放阅读框架（ORF）的下游。该区域与天然启动子和终端通过PCR扩增，并使用ECORI（NEB）连接到PFL39-TOM22中，以生成PFL39-TOM22-TOM22-TIM17linker-2xStrep。在整个研究过程中，TIM17linker-2xstrep被称为TIM172XSTREP。Hissumo*Tim23与本地启动子和终结者相比，从R737（质粒； Rehling Group的礼物）放大，并引入PFL39-TIM172XSTREP，以生成PFL39-TOM22-TOM22-HISSUMO*TIM23或PFL39-HISSUMO或PFL39-HISSUMO*TIM23-TIM23-TIM17link-2XSTREP。

　　在YPG（1％（wt/vol）酵母提取物，2％（wt/vol）bacto肽，3％（wt/vol）甘油，pH 5.0）中生长酵母细胞，YPGAL（1％（1％（wt/vol）酵母提取物），2％（wt/vol）2％（wt/vol）bacto perteptone，2％（wt/vol），2％（WT/vol）YP YP YP（WT）或YP YP（WT）或YP YP（WT）在19-23°C和130 rpm处为2％（wt/vol）Bacto肽，2％（wt/vol）葡萄糖）。为了生长分析，将酵母细胞在YPG，YPGAL或YPD中生长过夜，在23°C下过夜，并收集了与一个OD600相对应的体积，并将其重悬于无菌水中。将细胞在YPG或YPD板上的五倍连续稀释度中铺板，并在19-36°C下孵育。为了对TIM17诱导菌株进行液体培养生长分析，在23°C的YPGAL中生长酵母细胞，并采用对应于0.5的OD600的体积。将细胞在YPG中洗涤两次，并以0.1的OD600接种。读板读取器生长测定在Clariostar微板读取器（BMG LABTECH）上进行，并收集数据长达90小时。

　　使用位点定向诱变引入了TIM17或TIM23的氨基酸取代，使用centromeric质粒PFL39包含含有天然启动子，终结剂和野生型的酿酒酵母TIM17或TIM23或TIM23或TIM23（补充表2）的pcrifience pcrement（用于descortion descodient）的pcrifation（s. revisiae tim17或tim23）的开放式阅读框（S.高保真聚合酶（Novagen）。用DPNI（NEB）消化质粒模板（37°C，3 h），然后将PCR产物转化为有效的XL-1蓝色大肠杆菌细胞。选择单个菌落，并使用QIAPREP自旋微型套件（Qiagen）制备质粒，并通过测序验证。

　　对于Gibson克隆，使用KOD热启动DNA聚合酶通过PCR产生单个DNA片段。将所得的PCR产物与DPNI（NEB）在37°C下孵育1-3小时，以去除模板DNA。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化PCR产品，然后根据制造商的说明使用Gibson Assembly Master Mix（NEB）连接。

　　引入B2（84）-DHFR和B2（110）∆-DHFR中的单个半胱氨酸的引入是通过单个位点定向诱变进行的。质粒PGEM4Z-B2（84）-DHFR和PGEM4Z-B2（110）∆-DHFR用作具有Q5聚合酶Master Mix（NEB）和编码突变的引物的单播PCR反应的模板（补充表3）。PCR反应后，将匹配的反向和正向PCR混合，变性并缓慢退火，以接收包含所需突变的双链产物。在37°C下DPNI（NEB）消化2小时后，将反应转化为主管MACHT1大肠杆菌细胞。采摘单个菌落并在含氨苄青霉素或碳二利西林的LB培养基中接种，并使用QIAPREP旋转Miniprep Kit（Qiagen）分离质粒。通过测序鉴定阳性质粒。

　　在23°C和130 rpm的YPG中生长酵母细胞，直到早期对数生长阶段。通过差分离心分离线粒体58。通过离心（2,500G，10分钟）收集细胞，在水中洗涤，然后在每克2 ml的细胞中孵育2 ml，预热的DTT软化缓冲液（100 mM Tris-H2SO4，pH 9.4，10 mM DTT）在生长温度下孵育20分钟。将细胞洗涤并在每克6.5 ml的细胞中孵育酶醇酶缓冲液（16 mM K2HPO4，3.96 mM Kh2pO4，pH 7.4，1.2 m山梨糖醇（Roth）），含有3.5 mg Zymolase，每克酵母细胞在23°C下每克30-40分钟。Spheroplasts were washed once in zymolase buffer (without zymolase) and cells were mechanically opened on ice with a Teflon glass homogenizer in cold homogenization buffer (0.6 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.4% (wt/vol) bovine serum albumin (Sigma), 1 mM通过连续离心离心（150g，2分钟； 250g，2分钟和1,000g，4分钟； 1,800g，4°C），在4°C时，在4°C中，从苯基磺酰氟氟化物（PMSF； Sigma）从匀浆中取出pellets were washed in cold SEM buffer (10 mM MOPS/KOH, pH 7.2, 250 mM sucrose, 1 mM EDTA) and clarified (1,800g, 5 min at 4 °C). Mitochondria were subsequently reisolated (16,000g, 15 min, 4 °C), resuspended in SEM buffer to a protein concentration of 10 mg ml−1, snap frozen as aliquots在液氮中，存储在-80°C下直至使用。

　　如Gomkale等人的描述，重组表达的JAC1 – SFGFP被纯化。简而言之，将包含14his – Sumo – Jac1 – sfGFP过表达基因的质粒（来自rehling群的礼物）转化为合作的Rosetta（BL21 DE3）细胞，并过夜（37°C，180 rpm）培养到OD600 0.1的OD600。当细胞在37°C和180 rpm下添加1 mM IPTG时，诱导了表达。4小时后，通过离心（2,500G，15分钟）收集细胞。纯化是在äkta纯系统（Cytiva）上进行的。将细胞重悬于缓冲液A（40毫米Tris-CL，pH 7.4、500 mM NaCl，10 mM咪唑）中，通过超声和​​离心（16,000g，20分钟）裂解，并将过滤后的上一机施加到Histrap HP柱（Cytiva）的Bufferibed Buffield Bufferiper A.Tris-CL，pH 7.4，500 mm NaCl，500 mm咪唑）。通过SDS-PAGE和COOMASSIE亮蓝色染色分析含蛋白质的馏分。将相关的分数合并，并在4°C下与缓冲液A2（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，100 mm NaCl）一起过夜。通过在4°C下与His标记的SUMO蛋白酶（20 U mg-1蛋白）孵育，可以在4°C下与His标记的SUMO蛋白酶（20 U mg-1蛋白）孵育，从而实现了用于纯化的14his-Sumo*标签。为了删除未切换的14his – Sumo – jac1 – sfgfp，his标记的SUMO蛋白酶和14His-SUMO*标签，将混合物再次使用到Histrap HP柱上，并使用缓冲液A2进行平衡和缓冲液B进行列以再生。收集流动级分，并通过SDS-PAGE分析蛋白质含量，并用Coomassie Brillial Blue染色。确定蛋白质浓度，并在等分试样中冷冻纯化的蛋白质，并在-20°C下储存。

　　根据制造商的指示，使用TNT SP6耦合的网状裂解物裂解物系统（Promega）和质粒DNA生成了放射性标记的线粒体前体蛋白。在[35S]蛋氨酸的存在下，用质粒载有SP6启动子的感兴趣基因的质粒进行体外翻译。为了合成放射性标记的COX5A – SFGFP和DIC1，PCR放大了与SP6启动子序列融合的开放式阅读框架。使用Mmessage Mmachine转录试剂盒（Promega）生产mRNA转录本，并使用巨型转录清理套件（Thermo Fisher）纯化。在[35S]蛋氨酸存在下，使用TNT SP6耦合的网状细胞裂解物系统或Flexi兔网状细胞裂解物系统（Promega），将mRNA转录物用于体外翻译。

　　将分离的线粒体与进口缓冲液中的放射性标记或重组前体蛋白孵育（3％（wt/vol）无脂肪酸牛血清白蛋白，10 mm mops/koH，pH 7.2，250 mm蔗糖，250 mm蔗糖，80 mm kcl，5 mm mgcl2，5 mm mgcl2，5 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm kh24 mM NADH（ROTH），2 mM肌酸磷酸盐（Roche）和2 mM肌酸激酶（Roche）。为了耗尽膜电位（-Δψ），AVO混合物（8 µM抗霉素A（Sigma），1 µM valinomycin（Sigma）（Sigma）和20 µM寡霉素（Sigma）添加了NADH；加入6–10％（体积/体积）的兔网状细胞裂解物，并在指定的时间段内在25°C和300 rpm下孵育进口反应。通过添加AVO并将样品放在冰上来停止进口。在指示的情况下，将样品用蛋白酶K（50 µg mL -1）在冰上进行10分钟，然后在冰上添加2 mM PMSF 5-10分钟以抑制蛋白酶活性。通过使用5 µM MTX18,59的DHFR结构域的折叠和稳定来实现前体蛋白的易位停滞。分离线粒体（20,000g，5分钟），在冷SEM缓冲液中洗涤，并通过BN或变性凝胶电泳进行分析。

　　如前所述14,20,21，在TOM -TIM23超复合物处通过稳定停滞在TOM -TIM23 SUPERCLEX上形成进口中间体。放射性标记的COX5A（1-130） - SFGFP和含DHFR的前体蛋白融合B2（167）∆19-DHFR，B2（220）-DHFR，B2（84）+7-DHFR和B2（110）（110）Δ19-DHFR_C86S（B2（B2）（B2（B2（B2））或B2（B2（110）或Δ（C47至C54）最初在25°C的25°C下在含BSA的进口缓冲液（如上所述）中孵育5-10分钟，并在需要使用5 µM MTX时补充，以允许DHFR域的折叠。对于某些实验，将AVO混合添加到反应中。为了进口重组表达的JAC1 – SFGFP，将纯化的蛋白质稀释至20 mM Tris-Cl，pH 7.4和100 mM NaCl的浓度为40 µM，并添加到最终浓度为2.5 µm的反应中。随后，加入线粒体，并将进口反应在25°C（300 rpm）下孵育30分钟。通过添加AVO混合物来停止蛋白质进口反应，并通过离心分离线粒体（20,000g，5分钟，4°C）。如果随后使用线粒体进行交联或亲和力纯化，则将单个反应分层在S500EM（10 mM MOPS/KOH，pH 7.2，500 mm蔗糖，1 mm EDTA）垫（等于或两倍的总进口反应量）上，然后进行式式插入（20,000g，15，g 15分钟，4°C）。另外用SEM缓冲液洗涤所得的线粒体颗粒，以去除残留的放射性标记蛋白裂解物（20,000g，5分钟，4°C）。

　　如前所述21进行TIM17温度敏感突变体的热休克。野生型Tim17、17-4、17-5和Tim172xStrep-Hissumo*TIM23线粒体在37°C的进口缓冲液中孵育10分钟。直接添加热震动线粒体以完全进口缓冲液，并在25°C和300 rpm下进行进口。

　　将线粒体在补充有2 mM PMSF和1倍蛋白酶抑制剂（无EDTA; Roche）的100 µL SEM缓冲液中孵育，并在冰上用0.2 mm 4-DPS处理10分钟。通过添加50毫米碘乙酰胺和10 mM EDTA来停止氧化反应，并在冰上孵育10分钟。通过离心（20,000g，10分钟，4°C）分离线粒体，重悬于还原（包含50 mM DTT）或不还原的Laemmli缓冲液中，并通过SDS-PAGE进行分析，然后进行蛋白质斑点。

　　在Tom-Tim23进口位点形成了被捕的进口中间体后，将洗涤的线粒体沉淀重悬于新鲜的SEM缓冲液中，等分并补充DMSO（NO交叉链接控制），DMSO溶解的MB（Thermo Fisher; 1 mm最终浓度）或Bmoe（1 mm fisteration）或BMOE（30分钟）ince in Ice in Ice; 1MM cice; 1MM Fishere; 1MM Fishere; 1MM Fishere; 1MM Fishere; 1MM Fishere; 1MM Fishere; 1MM Fishere; 1MM Fishere）。通过在MBS交联或iodoacetamide（在蒸馏水中重悬于碘乙酰胺）的1：1比例以1：1的比例添加淬灭剂（添加100 mM Tris-HCl，pH 7.4和100 mM iodoacetamide），通过添加淬灭剂（在蒸馏水中重悬于1：1的比率），以最终的浓度为50 mm的BMOE交叉链接方法，从而淬灭反应。接下来，将淬火样品离心（20,000g，15分钟，4°C），并用新鲜的SEM缓冲液（20,000g，5分钟，4°C）再次洗涤。将洗涤后的线粒体蛋白沉淀重悬于2×Laemmli缓冲液中，添加了2 mM PMSF，以每1 µL的比例为2 µg蛋白，并在65°C（1,400 rpm，15分钟）以15分钟）进行变性。将所得的样品加载到10％Tris-tricine SDS-PAGE凝胶上（每条车道总量：70-100 µg线粒体蛋白），在120 V和30 MA（每凝胶）下运行14.5-16 h。将蛋白质蛋白半干，将蛋白质印迹到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，或将含蛋白质的凝胶干燥。将膜和凝胶暴露于磷酸ima骨筛网上，并通过放射自显影进行分析。

　　For Protein A purification of the TIM23 complex from Tim17 WT*/Tim21ProtA and D17A_D76A/Tim21ProtA, mitochondria were solubilized in digitonin solubilization buffer (20 mM Tris-Cl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10% (vol/vol) glycerol, 1× protease inhibitor cocktail (cOmplete平板电脑EDTA PLUS Easy Pack；将澄清的线粒体裂解液与平衡的IgG Sepharose结合在一起，并在4°C的末端孵育2小时。洗涤结合的蛋白质复合物（10倍柱体积），然后在含有0.3％（wt/vol）digitonin的溶解度缓冲液中与150 U烟草蚀刻病毒蛋白酶（Invitrogen）孵育16小时和1,000 rpm。通过与平衡的Ni-NTA琼脂糖（Qiagen）在4°C和1,000 rpm中孵育30分钟，从洗脱部分中除去烟草蚀刻病毒蛋白酶。在通过SDS-PAGE和免疫印迹分析之前，收集了洗脱的蛋白质，并与含有2％（VOL/vol）β-甲醇和2 mM PMSF的Laemmli缓冲液和2 mM PMSF结合。

　　通过首先通过链球菌 - tactin XT磁珠（IBA Lifesciences GMBH）或使用Ni-ni-nta琼脂糖使用NI-NTA琼脂型，使用二级纯化的二级纯化，使用二级磁珠（iba Lifesciences gmbh），使用二级磁珠（iba Lifeesciences gmbh），使用二级pulaigation（GFP）（GFP）（GFP）（gffp）（GFP），可以通过首先通过链球菌 - tactin XT磁珠（IBA LifeSciences GMBH）隔离任何任一172x链链蛋白XT型TIM172xStrep的复合物，从而实现JAC1 – SFGFP稳定的TIM23复合物的双重纯化。Chromotek）。如前所述进行了链球菌标签净化。将线粒体在链球菌溶解缓冲液中孵育（20毫米HEPES/KOH，pH 7.4、150 mM NaCl，10％（VOL/vol）甘油，0.1 mM EDTA，1倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒），其中含有1％（WT/VOR）的1％（wt/vol），在4°c处含有1％（wt/vol）。通过离心（20,000g，15分钟，4°C）去除不溶性材料，并将线粒体裂解液与链球链球菌 - tactin XT磁珠一起在4°C的末端孵育2小时。在含0.3％（wt/vol）digitonin的链球菌溶解缓冲液中洗涤结合的蛋白质复合物，并通过在1×洗脱缓冲液BXT（IBA Lifesciences GMBH）中孵育，含有0.3％（wt/vol）digitonin，10％（VOL/VOL）甘油和1×proteper in cockite cockite cocketor cocketor cockite cockeTor。将洗脱酸收集并稀释1：5，降至20 mM Tris-Cl，pH 7.4、150 mM NaCl，10％（VOL/vol）甘油，0.2 mM EDTA，10 mM Biotin，0.3％（WT/Vol）digitonin和1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒。对于Ni-NTA亲和力纯化，Hisumo*Tim23线粒体在含1％（WT/Vol）digitonin和10 mM咪唑在4°C的末端末端末端的digitonin溶解缓冲液中裂解。将澄清的线粒体裂解物添加到平衡的Ni-NTA琼脂糖中，并在4°C下孵育1小时。在含有0.1％（wt/vol）digitonin和40 mM咪唑的二核溶解缓冲液中洗涤结合的蛋白质（10次）。用含有0.1％（wt/vol）digitonin和250 mM咪唑的Digitonin溶解缓冲液洗脱蛋白质复合物。将洗脱稀释至最终浓度为20 mM Tris-Cl，pH 7.4， 150毫米NaCl，10％（体积）甘油，0.2 mm EDTA，40 mm咪唑，0.1％（WT/vol）digitonin和1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒。

　　将稀释的链球菌或ni-nta脱位与平衡的GFP纳米磁琼脂糖末端在4°C下孵育1小时。用GFP溶解缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 7.4、150 mM NaCl，0.5 mM EDTA，10％（VOL/vol）甘油，1倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒）用GFP溶解缓冲液洗涤GFP珠3次。用0.2 M甘氨酸，pH 2.5洗脱结合的蛋白质复合物，用1 M Tris-Cl，pH 9.4中和，并与含有2 mM PMSF的Laemmli缓冲液结合，在通过SDS-PAP-PAPE和免疫印迹分析之前，将2 mM PMSF和2％（VOL/VOL）β-莫克托乙醇（VOL/vol）β-莫克托乙醇结合使用。

　　使用GFP纳米磁磁琼脂糖纯化了含有Radiolabell的COX5A-SFGFP交联产物和氧化的含含含含氧化的JAC1的JAC1 – SFGFP的导入中间体。将线粒体溶解在含有1％（wt/vol）digitonin末端的GFP溶解缓冲液中，持续30分钟。将澄清的裂解物添加到平衡的GFP琼脂糖中，并在4°C的末端孵育1小时。洗涤GFP琼脂糖（三次），并在0.2 m甘氨酸中洗脱结合的蛋白质，pH 2.5。用1 M Tris-Cl（pH 9.4）与含有2 mM PMSF的Laemmli缓冲液相结合并通过SDS-PAGE进行分析。

　　使用BN – PAGE分离天然蛋白质复合物。将线粒体溶解在Digitonin缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4、50 mM NaCl，0.1 mM EDTA，10％（VOL/vol）甘油，1 mM PMSF，1％（WT/VOR）1％（WT/vol）Digitonin（Matrix Bioscience））上，覆盖15分钟。添加了BN加载染料（0.5％（wt/vol）Coomassie Blue G，50 mm 6-氨基辅实酸，10 mM Bis-Tris（Roth），pH 7.0）；阐明样品（20,000g，10分钟，4°C），并将上清液加载到不连续的梯度凝胶上（6-16.5％或3–14％丙烯酰胺（48％（WT/vol）丙烯酰胺，1.5％（WT/vol）（wt/vol）））。在BN阳极（50 mM BIS-Tris-HCl，pH 7.0）和BN阴极缓冲液（50 mm Tricine，pH 7.0，15 mm Bis-Tris）的存在下进行电泳，在4°C和15-20 mA per coel cole cool coomassie blue g中，有或没有0.02％（wt/vol）100 v和15-20 mA per evel of 3.5 – 5 – 5 – 5 – 5-20-evel和15-ef和15-per an 3.5 – 5 – ly 5 – per和15 v。对于放射性蛋白的SDS-PAGE，将样品重悬于2×Laemmli缓冲液中，该缓冲液含有2％（VOL/vol）2-甲醇和2 mM PMSF，并在65°C和1,000 rpm的65°C下孵育15分钟。将变性样品加载到10–15％的聚丙烯酰胺（Rotiphorese凝胶30（30％丙烯酰胺，0.8％Bisacrylamide（Roth））凝胶中，并在运行的SDS中运行（25 mm Tris-HCl，pH 8.8，191 mm Glycine（MP Biomedical）（MP Biomedicals），1％（WT）355555的35.35 haSDS - page是使用阳极（0.2 M tris-HCl，pH 8.9）和激素缓冲液（0.1 M tris，0.1 M Tris，0.1 M Tricine，0.1 M tricine，0.1％（WT/VER），在40-60的MA MA中，使用阳极（0.2 M Tris-HCl，pH 8.9）和激素缓冲液（0.1 M Tris，0.1 M Tris，ph.25）进行SDS-16.5％的丙烯酰胺或丙烯酰胺梯度。随后使用半齐系统在250 mA的PVDF膜中转移到PVDF膜中，在转移缓冲液中2.5 h（20 mm Tris，150 mm甘氨酸，0.02％，0.02％（wt/vol）SDS，20％（VOL/vol）的酸酯（30％乙醇）（30％乙醇）。0.2％（wt/vol）coomassie r250），直到蛋白质带变为可见为止， 切成100％甲醇的切割和完全销售。将膜用20 mM Tris-HCl，pH 7.5和125 mM NaCl洗涤，然后在印迹缓冲液中阻塞1小时（5％（wt/vol）脱脂牛奶，在20 mm Tris-HCl，pH 7.5，125 mm NaCl中）。The membranes were incubated for 2 h at room temperature or overnight at 4 °C in primary antibody, washed and placed in secondary anti-rabbit IgG antibody (1:10,000 in blotting buffer; Sigma or Jackson ImmunoResearch Laboratories) or anti-mouse IgG antibody (1:2,000 in blotting buffer; Cell Signaling Technology) for 1–2 h at room temperature.补充表4列出了抗体和稀释液。洗涤后，将膜在ECL发育的溶液中孵育，并通过LAS-3000或LAS-3000或LAS-4000相机系统（Fujifilm）或X射线膜（Amersham Hyperfilmefilm Ecl; GE Healthcare）检测到化学发光信号。Gels separating radiolabelled precursor proteins were stained to compare protein loading (30% (vol/vol) ethanol, 10% (vol/vol) acetic acid, 1% (wt/vol) Coomassie R250), destained (30% (vol/vol) ethanol, 10% (vol/vol) acetic acid, 1% (wt/vol)), dried and exposed to PhosphoImager screens (GE医疗保健）随后使用台风FLA 7000磷酸iMim仪进行放射自显影。在数字上切除非相关的凝胶车道（用较小的间隙表示）。

　　通过荧光淬火评估线粒体膜电位。Isolated mitochondria were incubated in potential buffer (0.6 M sorbitol, 0.1% (wt/vol) BSA, 10 mM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 16 mM K2HPO4, 4 mM KH2PO4, pH 7.4) supplemented with 5 mM L-malate, 5 mM succinate and 2 µM 3,3′-dipropylthiadicarbocyanine碘化物（Invitrogen）。在622 nm的激发波长下，在Aminco Bowman II发光分光光度计（Thermo Fisher Corporation）上测量吸收，发射波长为670 nm，直到达到平衡，然后添加1 µm缬氨霉素以散发膜电位。

　　使用TMCoffee60进行多个序列比对。除去了TM1和TM2之间的N-和C末端区域以及TM1和TM2之间的循环（用TM1和TM2之间的序列比对中的点表示图5A），以简化对齐图。跨膜结构域的位置是根据TIM22（参考文献25）（蛋白质数据库（PDB）ID 6LO8）的冷冻结构分配的，并遵循cerevisiae tim17与tim22的TMCOFFEE序列比对。

　　瑞士模型用于对全长TIM17单体结构进行建模。酿酒酵母和智人TIM22（PDB ID 6LO8和PDB ID 7CGP）的已发表结构用作模型模板，并将所得的预测结构导出到UCSF Chimerax（v.1.6.6.1）61中的图生成图。TIM17 – TIM23异二聚体和异驱动器的结构预测以及TIM23复合物的进一步亚基之间的相互作用（TIM17 – TIM23 – MGR2和TIM17 – TIM23 – MGR2 – MGR2 – PAM17 – TIM21 – TIM50）与ColabFold47进行。对于这些蛋白质复合物的预测，非膜预测的非结构化和部分无序区域被排除在建模之外。因此，用于建模的序列如下：TIM17（∆143–158）；Tim23（∆1-90）;mgr2（∆1-11和Δ86–113）;PAM17（∆1-47）;TIM21（δ1-60和Δ219–239）;和TIM50（∆1-101和Δ177–476）。对于包括细胞色素B2 presequence在内的结构预测，使用了1-40个残基。选择最高的模型进行分析和图形生成。对于TIM17 – TIM23异驱量，第二高排名模型是为比较选择的，因为它显示了模型的亚基的不同排列。在相关的情况下，使用Pymol（Pymol Molecular图形系统，v.2.4;SchrödingerLLC）和TIM17N16C和TIM23C98形成的二硫键进行了修饰。预测的局部距离差异测试，预测的模板建模和界面预测的模板建模得分以及预测的对齐误差（PAE）图是从ColabFold预测中获得的。使用PAE Viewer62可视化PAE图。

　　显示了代表性的图像，用于将放射性标记前体蛋白在体外进口到分离的线粒体中；化学交联；BN电泳；体外氧化和还原；酵母生长（WT和突变体）；蛋白质级分析和通过免疫应能进行纯化；和评估分离的线粒体的线粒体膜电位。通过独立实验（括号中的最小实验数量）证实了这些发现：图2。1C（2），1d（3），1F（3），1G（3），2B（2），2C（2），2D（2），2E（2），2E（2），3B（2），3C（3），4A（3），4A（2），4B（2），4B（2），4C（4C（2），4D（2），4D（2），4E（2），4E（2），4E（2），5B（2），5B（2），5C（2）和5C（2）和5C（2）和5C（2）和5C（2）和5C（2）和5C（2）和5 c（2）和5 c（2）和5 c（2）和5c（2）和5 d（2）和5 d（2）和5 c（2）（2）和5c（2）和5 d（2）和5c（2）和5c（2）和5 c（2）。1A（2），1B（2），1C（2），1D（2），2B（2），2C（2），2C（2），2D（2），2E（2），2E（2），2F（3），3C（2），3D（2），3D（3F（3），3F（3），3F（3），5C（3），5C（2），5C（2），6A（2），6A（2），6B（2），6B（2），6C（2），6C（2），6D（2），6D（2），6D（2）（2），6H（2），6i（2），7b（3），7C（3），7d（2），7E（2），7E（2），7F（2），7G（3），7H（2），7i（2），8a（2），8a（2），8b（8b（8b），8b（2），8C（2），8C（2），8D（2），8D（8E（8E），8E（2），8F（2），8F（2），8F（2），8HHH（2），8HHH（2）和8HHHH（2）和8HHH（2）和8HHH（2），和8HHH（2）和8HHH（8HH）TIM17电荷和亲水性突变体的表型的关键实验包括使用不同的线粒体制剂的生物学重复（图1F，G，3B，3B，C和4B，4B，C和4B，C和扩展数据图2C，E，E，E，F，6B和7C和7C – E，I），以及其他实验代表技术重复。

　　通过台风FLA 7000 V.1.2（构建1.2.1.93）和图像读取器FLA 7000 V.1.12收集数据；图像读取器LAS-3000 v.2.21，图像读取器LAS-4000 v.2.1和Silverfast（Microteksdk）v.6.6.6.1r7用于免疫定义信号；AB2发光分光光度计V.5.50（热电子）用于评估线粒体膜电位；Clariostar v.5.61（BMG LabTech）用于监测酵母菌的生长；Nanodrop ND-1000 v.3.5.2。（Coleman Technologies Inc.用于纳米体技术。）用于光谱；和Unicorn v.7.2。（通用电气公司）用于使用äkta纯系统。Data were analysed and processed with PyMOL v.2.4.1 for introducing other amino acid residues to the structure of Tim17 and Tim23 and Affinity Photo v.1.10.6, ColabFold v.1.5.2, Geneious Prime v.2022.1.1, GraphPad Prism v.9.0.0 (121), ImageJ v.1.49v, Jalview v.2.11.2.7, Multi GaugeV.3.0（Fujifilm），Snapgene查看器v.6.2.1，Adobe Illustrator 2023 v.27.6，Affinity Designer v.1.10.6，UCSF Chimerax v.1.6.1和Clariostar数据分析MARS V.3.41（BMG Labtech）（BMG Labtech）进行加工和图。非相关的车道或酵母生长测定通过数字处理去除，并通过分离线表示。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。