由于基于抗体的SARS-COV-2的干预措施面临着关注变体的出现的耐药性，因此具有替代作用方式的抗病毒药物的重要性增加了。Nirmatrelvir作为靶向3CLPRO的口服抗病毒，是一种治疗性，在降低处于高风险且未接种疫苗的感染者中，在降低严重疾病和住院时表现出很高的疗效1,2。实际上，这是最常用的抗病毒药物，用于治疗Covid-1932。鉴于该病毒已经对其他治疗模式展示了3,4,5,6,7,8,9的适应性，因此了解尼尔马特雷雷尔维尔耐药性的机制在临床上很重要。本文提供的结果表明，在体外高级对Nirmatrelvir的耐​​药性可以通过SARS-COV-2很容易实现，并且可以以多种方式发生这种情况。这一发现与我们先前关于3ClPro的广泛可塑性的报告一致，如深突变扫描33所示。

　　在VERO E6细胞（图1）和HuH7-ACE2细胞（图2）中，多个谱系在增加的药物压力下演变为非重叠突变，这与在类似的小规模研究中看到的谱系24,25,34,35。然而，按大规模进行选择表明，有多种突变途径通往Nirmatrelvir耐药性，但首选有几种常见的轨迹（图2C和3A，B）。大多数谱系来自获取T21I，P252L或T304I作为初始突变的病毒。重组SARS-COV-2（构建为包含这些点突变体的每个点突变体）表现出低级电阻（图4A，B），这表明这些前体突变中的每一个都可能使该病毒耐受低浓度的Nirmatrelvir，但随着药物压力的增加而需要额外的突变。值得注意的是，所有这三个突变都与Nirmatrelvir的远端（超过5Å）（图2D）（图2D）有些远端（超过5Å），并且如果没有其他研究，它们的耐药机制就不明显。但是，我们注意到T304对应于SARS-COV和SARS-COV-2的3CLPRO的NSP5/6裂解基板上的P3位点（扩展数据图2）。尽管P3位点暴露于溶剂中，因此不被认为具有严格的底物特异性，但已显示P3位点处合适的功能组（例如异亮氨酸的侧链）可以帮助提高3Clpro的抑制剂/底物效率和选择性（参考资料36,37,38）。因此，T304i可能有可能促进NSP5/6裂解位点的结合或促进自剖面过程。两条细胞系之间观察到的不同突变进一步强调了导致Nirmatrelvir抗性的复杂性和多种途径，尽管目前尚不清楚为什么某些突变特定于Vero E6细胞系。

　　与等源性突变体的分析还表明，几种突变是造成观察到的Nirmatrelvir耐药性的原因，E166V突变赋予了最大的耐药性（100倍）（图4B），如其他地方报道的33,35所报道。该突变还赋予了另一种临床相关的3CLPRO抑制剂28,29。可以解释E166V的电阻机制，因为它驻留在底物结合位点，而阀取代会破坏其氢键在Nirmatrelvir的Lactam环上的氢键（扩展数据图7B）。然而，该突变降低了病毒在体外的复制适应性（图3C），这也许是由于与邻近果实的第一个残基在二聚化中的相互作用丧失（扩展数据图7b）30。重要的是，当添加T21i或L50F时，恢复了复制性适应性（图3C），对耐药性没有显着影响（图4B）。这两个突变如何补偿E166V的适应性损失仍然未知。值得一提的是，据报道，E166V突变是在Epic-HR临床试验中的几个经Paxlovid处理的个体的病毒分离株中发现的（请参阅医疗保健提供者：Paxlovid的紧急使用授权，修订了Paxlovid，于2022年7月6日修订（参考文献39））。

　　我们还发现，许多其他突变可以在体外赋予对Nirmatrelvir的耐​​药性。T21I+S144A不仅介导了对Nirmatrelvir的显着耐药性，还介导了对替代性的交叉抗性（图4B），但该病毒表现出较慢的生长动力学（图3C）。同样，我们推断出L167F和F140L都可能在第一个体外传代实验的C-P30谱系中介导耐药性（图1F），如上所述，以及可能的结构解释。但是，很明显，我们只研究了SARS-COV-2逃避Nirmatrelvir的有限数量的突变途径。此外，我们研究所显示的许多突变目前没有直接的结构解释，实际上，其他体外或硅研究中的其他突变已经确定了诸如E166之类的残基很重要，但它们却错过了与基质结合位点相距甚远的其他残基40,41,41,42。还应该提到的是，我们的研究是用祖先的WA1菌株进行的，目前循环的Omicron变体（除BA.3外，所有其他含量均包含3clpro中的P132H突变），可能在其Nirmatrelvir逃避途径上有所不同。据报道该突变对Nirmatrelvir的耐​​药没有直接影响，但它可能影响随后的抵抗性支配突变的出现43。它将需要广泛的病毒学，生化和结构研究来描述哪些突变赋予抗性以及如何以及如何理解某些突变如何发挥补偿作用。更好地了解Nirmatrelvir耐药性的机制，可以洞悉下一代3CLPRO抑制剂的发展。

　　在撰写本文时，Nirmatrelvir在大多数国家 /地区仅用于6个月或更短的时间来治疗Covid-19。SARS-COV-2对患者中这种药物的抗性尚未报告，我们发现在紧急使用授权之前和之后我们发现的3CLPRO突变的频率没有明显差异（扩展数据图8）。迄今为止，患者的Nirmatrelvir耐药性也许是由于使用规定方案获得的高药物浓度引起的，因此病毒很难以逐步的方式积累突变。此外，在免疫系统还积极消除病毒，包括可能出现的任何抗性形式时，也会服用该药物。因此，将我们的监视努力集中在免疫功能低下的个体上，以进行耐药病毒的出现。过去患有其他病毒感染的经验告诉我们，如果可以在体外选择耐药性，那么它肯定会在体内发生。尽管目前的COVID-19疗法在很大程度上被用作单疗法，但未来的治疗可能会受益于使用使用药物的组合来最大程度地减少SARS-COV-2逃脱的可能性。