ORC, Cdc6, Mcm2–7–Cdt1, DDK, CDK, Sld2, Sld3–Sld7, Cdc45, Dpb11, Pol ε, Pol ε exo-, Pol α, TopoI, Mcm10 and yeast histone octamer were purified on the basis of previously established protocols1,11,24,33,48,49,50,51.

　　将设计的DNA片段（补充表1）从PMA矢量（补充表2）取代到PRS班车向量（补充表2），这些媒介用于产生酵母菌菌株（补充表3），用于过表达MCM2-7 – CDT1突变体。使用MLUI和XBAI限制位点将OMG25 DNA片段从PMG39到PAM38取代，以获得PMG69，该PMG69集成到YJF21酵母菌株中，从而产生用于过表达MCM2 6A突变的YJF21酵母菌菌株V580A/K582A/P584A/K587A/W589A/K633A）。使用BSIWI和SPHI限制位点将OMG27 DNA片段从PMG43到PJF4亚克隆以获得PMG53，然后将PMG53整合到YAM20菌株中，产生YAE160菌株，该菌株用于过表达MCM6 2E突变（MCM6 2E MECM6 T42E/R42E/R42E）。使用BSIWI和SPHI限制位点将OMG28 DNA片段从质粒PMG44取代到PJF4，从而获得质粒PMG54。将PMG54质粒整合到YAM20菌株中，得出用于过表达MCM6 5E突变体（MCM6 T408E/Q408E/Q409E/L410E/L410E/G411E/L412E）的YAE161菌株。所有MCM2–7 – CDT1突变体基本上纯化为野生型50。

　　编码双带标签和PSF3的前三个密码子的基因块被扩增并通过无限制克隆技术克隆到PFJD5中。补充表1中包含了引物和基因块的列表。BL21（DE3）-codonplus-ril细胞（Agilent）用胶囊表达质粒（PJL003）转化。将转化的菌落接种到含有卡纳米霉素（50 µg mL-1）和氯霉素35 µg mL-1的250 mL lb培养物中，该培养基在200 rpm时在37°C下在37°C下过夜。第二天早晨，将培养物用卡纳米霉素（100 µg mL-1）和氯霉素（35 µg mL-1）稀释为6×1 L的Lb。将培养物在37°C下生长，直到达到0.5的600 nm（OD600 nm）的光密度为止。添加0.5 mM异丙基β-1-甲状腺乳糖苷糖苷（IPTG）诱导表达，并将细胞摇动3小时。通过以4,000 rpm离心在JS.4.2转子（Beckman）以4,000 rpm离心20分钟收集细胞。For lysis, cell pellets were resuspended in 120 ml of lysis buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 10% glycerol, 0.02% NP-40, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, Roche protease inhibitor tablets and 1 mM dithiothreitol (DTT) + 0.7 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). The在Sonics Vibra-Cell Sonication上以40％的速度将裂解液以20,000 rpm的速度在JS.25.50转子中以20,000 rpm离心为40％。（100 mM Tris-HCl pH 8.0，10％甘油，1 mM DTT和1 mM EDTA）通过添加6 ml的1×Buffer BXT（IBA）补充了10％的甘油和1毫米DTT。10％甘油，0.02％NP-40、200毫米乙酸钾和1 mM DTT）。将样品浓缩，并加载到在同一缓冲液中平衡的16/600 SuperDex 200。在液体N2中合并，等分并冻结含糖的馏分。从6升培养物中纯化了约22毫克的杜松子酒。

　　含有HRV 3C蛋白酶裂解位点的MH的密码子优化表达序列，然后由Genewiz合成（PJL004）合成并克隆到PET302中。用PJL004转化T7表达细胞（NEB）。将转化菌落接种到250 mL Lb培养物中，氨苄青霉素（100 µg mL-1），在37°C下在200 rpm时在37°C下生长过夜。第二天早晨，将培养物用氨苄青霉素（100 µg mL-1）稀释为6×1 L的Lb。将培养物在37°C下生长，直到达到0.5的OD600 nm。添加了0.5 mM IPTG诱导表达，并将细胞摇动3小时。通过以4,000 rpm离心在JS.4.2转子（Beckman）以4,000 rpm离心20分钟收集细胞。对于裂解，将细胞颗粒重悬于80 mL的裂解缓冲液中（20 mM Tris-HCl pH 8.5，10％甘油0.5 mM EDTA，500 mM KCL，Roche蛋白酶抑制剂片和2 mM Tris（2-羧乙基）磷酸（TCEP）（TCEP） + 0.7 mm pmsf。在Sonics Vibra-Cell Sonicator上，将裂解液超声为120 s（5 s，5 s左右）。通过在JS.25.50转子（Beckman）以20,000 rpm离心30分钟，以20,000 rpm离心去除不溶性材料。将上清液通过重力加载到5-mL链球菌 - 触觉柱（IBA）上。树脂用裂解缓冲液广泛洗涤。通过补充了10％甘油和1 mM DTT的12 ml 1×BXT（IBA），将MH洗脱。将含MH的馏分汇总并加载到HiloAD 16/600 SuperDex 75中，在凝胶过滤缓冲液中平衡（20 mM Tris-HCl pH 8.5，10％甘油0.5 mm EDTA，100 mm KCl和0.5 mm TCEP）。在液体N2中合并，等分并冻结含MH的馏分。从6升培养物中纯化了约36 mg MH。

　　宽度601和603个位点或MH-弗兰克的本地ARS1起源被PCR放大，并如前所述纯化24。6×ARS1阵列（PSSH005）是通过插入6个ARS1起源的阵列，使用Nebuilder Hifi组件插入40 bp间距，两侧是MH位点。使用引物OSSH038从PSSH005扩增6×ARS1原点阵列，并通过乙醇沉淀浓缩。补充表1中包含了引物和DNA的列表。

　　如前所述24，可溶性酵母核小体从八聚体从八聚体从八聚体和DNA进行了几个步骤，从2至0.2 m NaCl重构。核小体重折叠后，将最终的透析步骤执行到加载缓冲液中（25 mm Hepes-KOH pH 7.6，80 mm KCl，100 mm乙酸钠，0.5 mm TCEP），并加载到Superose 6增加3.2/300柱上的3.2/300柱以相同的缓冲液平衡。将包含2个由2个核小体结合的ARS1原点DNA的分数合并，浓缩并在4°C下储存。通过小规模滴定和6％天然页面检查的小尺度滴定和核素优化了重建条件。

　　在50 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA和0.5 mM 2- ercapto乙醇中，补充了100 µM S-腺苷硫氨酸（NEB）的50 mM TRIS-HCL pH 8.0、1 mM EDTA和0.5 mM 2-MM 2-甲醇。该反应在30°C下过夜，以10：1摩尔比为MH：DNA。结合后，将反应以14,680 rpm离心5分钟，并将其加载到1 ml Resource-Q柱上，平衡到DNA缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0和5 mM 2- ercaptoeto乙醇）中。在24柱体积上，将MH偶联的DNA洗脱在DNA缓冲液B（50 mM Tris-HCl pH 8.0、5 mm 2-甲醇和2 m NaCl）的线性梯度中。将含有MH偶联的DNA的分数合并，浓缩并在-80°C下储存。通过6％的本机页面检查了共轭。

　　在25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM乙酸镁，50 mM乙酸钾和1 mg ML-1 BSA中，将MH与原始底物的结合进行。该反应在32°C下进行1小时，然后在4°C下过夜，为MH：DNA的20：1摩尔比。结合后，将反应以14,680 rpm离心5分钟，并加载到Superose 6增加10/300柱上的10/300柱中，平衡到阵列缓冲液中（25 mm Hepes-KOH pH 7.5，200 mm NaCl和1 mm DTT）。将含有MH偶联阵列DNA的分数合并，浓缩并在4°C下储存。通过6％的本机页面检查了共轭。

　　组装了616-BP ARS1圆圈并按照以下修饰进行制备。使用QuickCIP而不是南极磷酸酶进行去磷酸化步骤，在37°C下进行30分钟，然后在80°C下酶灭活2分钟。结扎步骤后，将DNA浓缩，并与T5外切核酸酶（NEB; 37°C持续1 h）孵育，以消除非绑扎的DNA。省略了乙醇沉淀，琼脂糖电泳和电洗；取而代之的是，进行苯酚/氯仿/异氧氨基醇提取，然后使用乙酸乙酸钠（pH 5.1）和中性载体Geneelute线性聚合物（LPA，Merck）进行乙醇沉淀。

　　ARS1 nucleosome-flanked origin DNA (20 nM) was incubated with 52 nM ORC, 52 nM Cdc6 and 110 nM Mcm2–7–Cdt1 for 30 min at 24 °C in loading buffer (25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium glutamate, 10 mM magnesium acetate, 0.02% NP-40 and 0.5 mMTCEP） + 5 mm ATP。该反应用80 nm DDK补充，并在24°C下再孵育10分钟。通过与5 µL MagStreptype3̓Xt珠（IBA）孵育，在1倍加载缓冲液中在24°C中孵育30分钟，从而分离了核蛋白络合物。用100 µL洗涤缓冲液（25毫米HEPES-KOH pH 7.6、105毫米谷氨酸钾，5毫米乙酸镁，0.02％NP-40和500 mm NaCl）和100 µL负载缓冲液洗涤珠3次（25毫米HEPES-KOH pH 7.6、105毫米谷氨酸钾，5 mm乙酸镁和500 mm NaCl）。在20μL洗脱缓冲液（25 mM Hepes-KOH pH 7.6，105毫米谷氨酸钾，10 mm乙酸镁，0.02％NP-40，0.5 mm TCEP，27 mm Biotin和5 mm ATP）中，磷酸化的双甲式药物在20μL洗脱缓冲液中洗脱。除去其余的上清液，并在30°C下与200 nm CDK一起孵育5分钟。然后将发射因子的混合物添加到30 nm dpb11、100 nm杜松子，80 nm cdc45、20 nmpolε，30 nm SLD3 – SLD3 – SLD7和50 nm SLD2的最终浓度中。孵育30分钟后，将反应直接施加到网格上，或在1倍加载缓冲液中稀释5倍以进行重新调节实验。

　　将MH限制的ARS1阵列DNA（5 nm）与52 nm ORC，52 nm cdc6和110 nm MCM2-7 – CDT1在24°C下在24°C的加载缓冲液（25 mM HEPES-KOH pH 7.6，100 mm斑点谷氨酸，10mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmim acte，0.02％）中孵育30分钟。5毫米ATP。该反应用80 nm DDK补充，并在24°C下再孵育10分钟。通过与5 µL MagStreptype3̓Xt珠（IBA）孵育，在1倍加载缓冲液中在24°C中孵育30分钟，从而分离了核蛋白络合物。用100 µL洗涤缓冲液（25毫米HEPES-KOH pH 7.6、105毫米谷氨酸钾，5毫米乙酸镁，0.02％NP-40和500 mm NaCl）和100 µL负载缓冲液洗涤珠3次（25毫米HEPES-KOH pH 7.6、105毫米谷氨酸钾，5 mm乙酸镁和500 mm NaCl）。在20μL洗脱缓冲液（25 mM Hepes-KOH pH 7.6，105毫米谷氨酸钾，10 mm乙酸镁，0.02％NP-40，0.5 mm TCEP，27 mm Biotin和5 mm ATP）中，磷酸化的双甲式药物在20μL洗脱缓冲液中洗脱。除去其余的上清液，并在30°C下与200 nm CDK一起孵育5分钟。然后将发射因子的混合物添加到90 nm dpb11、300 nm杜松子，240 nm cdc45、60 nmpolε，90 nm sld3 – sld3 – sld7和150 nm sld2的最终浓度中。孵育30分钟后，将反应在1倍载荷缓冲液中稀释五倍，并应用于网格。

　　对于在CMG形成反应后部分消化DNA的实验，以1倍负载缓冲液稀释的0.1 U浓度添加MSEI（NEB）。在应用于EM电网之前，在30°C下进行10分钟的孵育。

　　如前所述进行复制测定52。将反应在30°C的热电器中与1,250 rpm摇动一起孵育。反应缓冲液如下：25 mM HEPES-KOH pH 7.6，10 mm乙酸镁，2 mM DTT，0.02％NP-40，100 mM谷氨酸钾和5 mm ATP。MCM解旋酶负载反应（5 µL）包含30 nm orc，30 nm cdc6，60 nm mcm2–7 – cdt1（或MCM突变体）和4 nm的10.6 kb超涂层质粒（PJY22; pjy22;补充表2）或40 nm ars a in for dna（for dna for dna for dna for dna（pjy22;补充表2）图1。20分钟后，将DDK添加到最终浓度50 nm，并进一步孵育20分钟。接下来，通过添加蛋白质（20 nmpolε，30 nm dpb11，20 nm齿轮，50 nm cdc45，20 nm cdk，50 nm cdk，50 nm rpa，10 nm rpo，10 nmpolα，100 nmpolα，100 nmpolα，100 nmpolα，25 nm sld3 – sld7，25 nm sld3 – sld7，100 nmmcmss），接下来，将反应体积加倍（最终体积为10 µl）（最终体积为10 µL）。CTP，200 µM GTP，200 µM UTP，80 µM DCTP，80 µM DGTP，80 µM DTTP，80 µM DatP和50 nmα32P-DCTP）。For replication reactions with linear DNA (Fig. 1) Pol ε exo- was used instead of Pol ε wild type to reduce end labelling and the concentration of deoxynucleotides was modified (that is, 30 µM dCTP, 30 µM dGTP, 30 µM dTTP, 30 µM dATP and 100 nM α32P-dCTP).15和30分钟后，EDTA停止了反应，以使其与10.6 kb超螺旋DNA或20分钟后的反应，以用于短线性DNA底物的反应，并按照所述处理51,52进行处理。使用0.8％琼脂糖碱性凝胶在25 V时进行17小时分离复制产物，以与10.6 kb超涂的DNA反应。对于与短DNA底物的反应，在38 V时使用2％琼脂糖碱性凝胶分离样品4 h。

　　如前所述进行实验1。蛋白质的浓度如下：10 nm orc，50 nm cdc6，100 nm MCM2-7 – CDT1（或MCM突变体），用于解旋酶加载步骤（5 µL）和20 nmpolε和20 nmpolε，30 nm dpb11，30 nm dpb11，40 nm gins，50 nm gins，50 nm cdc45 nm cdk，10 nm cdk，10 nm ddk的80 nm ddk，5 nm MCM10，50 nm SLD2用于解旋酶激活步骤（10 µL）。使用了放射性标记的616 bp圆形DNA（25 FMOL）。处理如前所述的反应后，Ficoll 400（最终浓度为2.5％），并使用橙色G将样品加载到天然的3.5％BIS-聚丙烯酰胺凝胶（1×TBE）上，并在室温下使用Protean II XL Cellatus（Bio-Rad）在90 V进行21 h分离。将0.7毫米凝胶在80°C下干燥（无固定）105分钟，暴露于磷光器屏幕上，并使用台风磷光液成像仪进行扫描。

　　NS-EM样品制备在用碳膜（Agar Scientific）的400英寸铜网格上进行。使用K100X发光放电单元（电子显微镜科学）在45 mA处发光30 s，在将4 µl样品施加到网格上并孵育2分钟之前。通过两个连续的应用2％（w/v）乙酸铀酰的连续应用，在第一和第二应用之间染色，将网格染色。20 s后，将染色的网格印迹以去除多余的污渍。除非另有描述，否则在120 KEV的Tecnai Lab6 G2精神传输电子显微镜（FEI）上进行数据收集。2K×2K Gatan Ultrascan 100相机用于在-0.5至-2.0 µm defocus范围内以标称放大倍率（物理像素大小为3.45Å）以标称放大倍率（物理像素大小为3.45Å）。

　　使用Relion-3.1（参考文献26）手动挑选了一部分粒子，并用作Topaz Training53的训练数据集53。随后的图像处理使用RISION-3.1进行。使用GCTF（参考文献54）估算每个显微照片的CTF，并提取粒子并在Relion-3.1中进行无参考的2D分类。

　　对于重新调查实验，如上所述进行了图像处理。Relion中的无参考2D分类同时生成2D类平均值和星形文件，详细介绍了应用于原始粒子的类分配，粒子坐标和转换（翻译和旋转）以进行对齐。2D平均值是在原始显微照片上超级叠加的，覆盖在有助于其产生的粒子上。这产生了信号增强的“重新计算”显微照片，重新建立了复制的完整起源。重新填充的显微照片用于选择和排斥原点核蛋白进行进一步分析。

　　如前所述24分析了重新征服的起源。简而言之，使用重新汇总的显微照片来重新提取关联中感兴趣的粒子。将选定的颗粒手动分类进行统计分析。使用Fiji55手动进行重新征服的原始测量，并在GraphPad Prism v.9.2.0中绘制。

　　CMG组装反应（如“在短染色体化起源上的体外CMG组装”中所述的重构）在400-MESH LACEY GRID上冻结，并带有一层超薄碳（琼脂科学）。所有网格在45 mA的新鲜发光下，使用K100X发光发光单元（电子显微镜科学）在45 mA处汇总1分钟。通过在90％的湿度中施加4 µL未稀释的CMG组装反应来制备样品2分钟。将网格印迹4.5 s，并浸入液态乙烷中。数据收集在内部的Thermo Fisher Scientific Titan Krios传输电子显微镜上进行300 kV，配备Gatan K2 Direct Electron探测器摄像机（GATAN）和GIF量子能量过滤器（GATAN）。使用EPU软件（Thermo Fisher Scientific）自动收集图像，以每个像素的物理像素大小为1.08Å，在10 s剂量的总暴露时间中，每Å2的总电子剂量为51.4电子，分为32个电影框架（扩展数据表1）。我们在能量滤波器上使用了20 eV的狭缝宽度，散焦范围为-2.0至-4.4μm。从两个单独的会话中收集了总共65,286个显微照片。

　　使用Relion-3.1（Ref。26）和Cryosparc v.3.2（参考文献56）（扩展数据图3）进行数据处理。首先使用MotionCorr2（参考文献57）对每个显微照片的电影进行漂移和剂量加权校正。使用GCTF估算了RIST-3.1中的GCTF的CTF参数（参考文献54）。Dataset One首先是单独处理的，并在稍后的阶段与DataSet两个结合。

　　对于第一个数据集，使用手动策划的粒子集作为Cryolo v.1.7.5（参考文献58）中的模板进行选择。这些粒子由2封归于230和3D分类的360像素的盒子尺寸。选择了整个散焦范围内的1,600个代表性颗粒的子集。去除明显的颗粒聚集区域中的镐以及位于碳蕾丝上的颗粒。然后，在其余颗粒上对Topaz53模型进行迭代训练。将所有粒子与TOPAZ模型重新挑选，用于粒子预测的默认得分阈值为0。将两个数据集组合在一起，总共挑选了927,109个颗粒，由2份，并以360像素的盒子尺寸提取。我们进行了2D分类，以去除剩余的较小的颗粒和污染物。我们将其余粒子与四个子类别进行3D多参考分类，使用了7.5°的角度采样（使用先前的AB始于DCMGE复合物的数据集1上的低通滤波的初始模型和处理步骤，是5°的正则化参数t，以及从EMD-3960 DATAIDED DATAIDED DATAIDED。）。未完成的133,262（Trans-DCMGE）和46,049（顺式DCMGE）颗粒，其密度对应于两个CMG分子上的POLε，并未固定，并精制以7.7和14.4的分辨率产生地图。C2对称性强度并不能提高地图的质量。将133,262个反式DCMGE颗粒进口到冷冻PARC中，并进行多发的不均匀细化，异质3D分类和局部不均匀的局部细化，在大约8Å处获得地图（扩展数据图3）。鉴于粒子数量有限，改善顺式-DCMGE的尝试失败了。不出所料， 由于两个CMGE分子之间由柔性DNA结合的两个CMGE分子之间的构象异质性，这些重建并未显示次要结构特征。我们将C2对称扩展程序应用于反式和顺式-DCMGE颗粒（179,311），并在一个cmge中重新中心，并将所有颗粒合并。在此过程中，我们还将盒子尺寸缩小到512像素，以加快下游处理。此后，将屏蔽的3D细化在中心单CMGE的C1中进行局部搜索（由358,622个颗粒组成）被完善至4.2-Å分辨率。这些颗粒经过几轮CTF细化和两轮贝叶斯抛光。之后，通过在C1中进行局部搜索，将CTF改良和抛光的颗粒与掩模一起搜索，其中包含整个CMGE密度达到3.6-Å分辨率。为了更好地解析MCM中央通道内的DNA，减去与Cdc45相对应的密度，相对于杜松子和polε。通过CryoSparc中的3D变异性分析分析信号提取的颗粒（参考文献56）。根据DNA密度的质量选择了71,348个颗粒的子集。这些信号提取的颗粒随后被恢复为原始粒子，并使用C1中的局部搜索使用局部搜索到3.5-Å分辨率进行了完善。

　　使用完全独立的数据半集进行所有细化，并根据傅立叶壳相关（FSC）= 0.143标准进行了分辨率（扩展数据图2）。用软面膜计算FSC。校正了图检测器的调制传递函数，并通过应用负B因子的负面处理函数来锐化。最终的关系半图用于使用phenix Resolve Cryoem生成密度修改的地图（参考文献28,59）。这张3.4-Å地图显示了侧链和DNA密度以及整体可解释性的显着改善。使用Phenix或CryoSparc确定局部分辨率估计（扩展数据图2F，J）。使用UCSF PYEM v.0.5 Package60执行CryoSparc和Relion文件之间的转换。

　　CMG（来自PDB 6SKL），31，POL2亚基（来自PDB 6HV9）33和从Phyre2 Server61获得的DPB2的N端域的同源模型最初停靠在Crolove Cryeem，使用USCF Chimera As a a a a apination的cyoem a a inamap ins Map Intiant Anamy A.v.0.9.1（参考文献63）。DNA和MCM5翼螺旋域是从头建造的。DCMGE原产地DNA参与量是异质的，因为MCM双六聚体可以在形成DCMGE之前沿着双工DNA滑动。因此，我们无法用确定性和建模的polya：polyt DNA构建原点DNA序列。然后，使用Phenix.Real_Space_refinement64对所得的模型进行真实空间改进的迭代过程，并具有几何形状和二级结构约束，并在适当的情况下进行基础配对和基础堆叠约束，然后在Coot中进行手动检查和调整。原子模型的几何形状通过Molprobity Weberver65评估。

　　在UCSF Chimera66和Chimerax67中可视化图，并使用Chimerax或Pymol制备所有模型插图和形态。

　　使用GraphPad Prism v.9.2.0中的两尾Welch̓st检验进行统计分析。没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。