LP（a）是一个遗传确定的独立心血管危险因素，无法通过生活方式改变来修改，并且没有可用的治疗剂可供特异性地降低LP（a）的水平，而不会产生其他影响。在大约20％的人群中发现的高血清LP（A）（A）（a）（a）（a）（a）（a）（a）（a）（超过50 mg dl-1或125 nmol l-1），赋予了第一个心血管疾病的风险超过1.6倍，而第二个事件9的风险超过1.42倍，而第二个事件的风险超过1.42倍，而直接增加了1.42倍，而直接增加了lp（a）LP（A）级别的风险。LP（a）的循环水平主要取决于Kringle IV亚型2（KIV2）结构域的高变量，以及LPA基因11的单核苷酸多态性（SNP）。流行病学研究已经确定LP（A）是独立的心血管危险因素，并且由于LP（A）水平由基因结构确定，Mendelian随机研究表明，LP（A）在引起动脉粥样硬化和钙化主动脉瓣膜疾病中具有作用。12,13,14。

　　LP（a）是一种脂蛋白颗粒，由涉及LDL颗粒与另一种蛋白质Apo（a）之间相互作用的两步过程形成。在第一步中，Apo（a）通过独特的KIV5-8的结构元素在LDL颗粒上无共价结合，而APOB-100中的富含赖氨酸的区域，其赖氨酸结合位点与APOB的赖氨酸可协调的残留物相似。在第二步中，在Apo（a）的KIV9（参考文献5,7）和APOB-100的CYS3734（参考文献3,6）之间形成了二硫键，该残基共价连接了两种蛋白质。

　　apo（a）由LPA基因编码，该基因仅存在于人类和某些非人类灵长类动物的基因组中15。LPA基因通过进化后期的基因重复事件源自纤溶酶原（PLG）基因，其中纤溶酶原kringle kringle ronains I，II和III丢失了，KIV结构域扩展并分散至10个亚型（KIV1-10）（KIV1-10）（KIV1-10）（扩展数据图1）;因此，Apo（a）的KIV结构域与纤溶酶原kringle结构域共享70-85％的序列同一性。

　　目前，在临床实践中尚无治疗方法，可以专门降低LP（a）的水平。Pelacarsen是一种靶向LPA的反义寡核苷酸，而LPA小型干扰RNA的Olpasiran都是目前正在3阶段临床研究中的可注射疗法。这些干预措施显示出强大的LP（A）较低的效果，可耐受性良好16,17。正在进行的3期心血管结局试验（例如Horizo​​n和Ocean（A））将提供有关LP（A）较低治疗方法的治疗效用的急需证据。18,19。到目前为止，在人类中已经研究了专门针对Apo（a）的小分子。然而，发现纤溶酶原抑制剂曲霉素酸可降低小型临床研究中的LP（a）水平。我们研究的目的是通过阻止APO（a）和APOB之间的第一种相互作用来降低LP（a）的循环水平，以开发出一种有效的口服口服的小分子治疗方法来抑制LP（a）的形成。有效和选择性的小分子LP（A）减少治疗性可以提供一种方法，以减少由于患有高水平LP（a）而患有心血管疾病风险的患者的原发性和/或次要主要不良心血管事件的数量。

　　我们的策略集中在识别结合APO（A）KIV7-8的分子以抑制APO（A）和APOB之间的初始相互作用。这种方法建立在从三个来源获得的知识中建立：（1）重组APO（a）突变蛋白的体外研究表明，Apo（a）通过KIV6-8域与APOB-100中的富含赖氨酸富含赖氨酸的区域结合；（2）对非洲人群中KIV8域SNP G17R的分析，该分析与apo（a）KIV2重复多态性所预测的LP（a）血浆浓度明显低相关；（3）证据表明，在高加索个体中KIV8内含子的+1供体剪接位点取代的g与质量（a）的先天性缺陷有关，质量为21,22,23。这些发现共同创造了以下假设：阻止APO（a）的KIV7-8赖氨酸结合域（a）可能会阻止LP（a）的形成。作为原理的证明，LP（a）的体外组装受到ε-氨基核酸和曲霉素的抑制，尽管它们通过平衡分离常数（kd）（kd）和63 µm和63 µm和63 µm nme kiv7结合了Apo（a）KIV7的赖氨酸结合结构域（a）KIV7。同样，已经描述了低亲和力但选择性KIV7和KIV10小分子粘合剂，这些结合剂减少了用微摩尔效能25的体外形成LP（a）的形成。

　　使用纯化的重组APO（A）KIV7-8蛋白鉴定出相互作用的小分子，生化和生物物理化合物筛选。最初结合分子的优化导致LSN3353871的开发和发现，该LSN3353871与KIV8，KIV7-8和KIV5-8结合，KD值分别为756 nm，605 nm和423 nm，如等距钙钙仪（ITC）（ITC）（ITC）（图1A，b）。相比之下，LSN3353871不与KIV2结合（扩展数据表1）。在体外LP（a）组装测定中，LSN3353871破坏了LP（a）的形成，其半末端抑制浓度（IC50）为1.69 µm（n = 43）（n = 43）（图1C）。晶体结构分析表明，LSN3353871与KIV8氨基酸残基Glu56，Asp54，Tyr62和arg69相互作用，说明了分子的特异性和结合方式（图1D和扩展数据图2A）。口服LSN3353871对表达人LP的小鼠的LSN3353871导致LSN33353871循环水平的剂量依赖性增加，而剂量依赖性降低了LP（A）的水平高达78％，中位有效剂量（ED50）的水平为14 mg kg-kg-kg-kg-kg-kg-1 twice（bec）（bgg kg-kg-kg-kg kg-kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg five poss tweptect。在cynomolgus猴子中，施用LSN3353871（20 mg kg -1 bid持续了两个星期）导致LP（a）水平（扩展数据表2和图1E，F）的降低高达40％（a）。这两个模型之间的效果幅度差异可以通过LP（a）的表达水平和代谢的差异来解释，因为小鼠基因组并不固有地包含LPA基因。这些数据提供了一个概念证明，即与Apo（a）结合赖氨酸结合结构域的小分子可以抑制体内LP（a）的形成。

　　两个分子的连接包含至关重要的LSN3353871 KIV结构域相互作用基序产生了二聚体分子LSN3441732（图2A）。该二聚体化合物抑制了在体外的LP（A）颗粒的形成，IC50值为0.18 nm（n = 8），与母体单体分子相比，效力增加了三个数量级，LSN33353871（IC50 = 1.69 µm; n = 43 µm; n = 43）和两个级数的良好lig lsn3353871（IC50 = 1.69 µm；LSN3374443（IC50 = 36 nm; n = 3）（图2b，c）。

　　为了指定多价和单价配体的apo（a）KIV结合相互作用，我们使用了直接的放射线结合和ITC方法。对于放射线结合，我们创建了二聚体3H-LSN3441732和单价3H-LSN33744443辐射。为了鉴定具有与这些化合物结合的能力的KIV结构域，评估了单个KIV5，KIV6，KIV7，KIV8和KIV10。

　　除KIV10外，3H-LSN3374443与所有测试过的含KIV的蛋白结合，其亲和力与该蛋白具有相似的亲和力，该蛋白与全长APO（a）（a）（KD值为15-31 nm）结合（扩展数据表3）。在直接结合测定中，3H-LSN3374443与全长重组APO（A）结合，平均KD值为2.6 nm，最大最大饱和结合（BMAX）值为9.8 FMOL NG-1 APO（A），相当于2至三个ligands per apo（a）（a）（a）（a）（图2d）（图2d）。相比之下，3H-LSN3441732与全长APO（A）结合，其亲和力增加了Kd = 0.05 nm，并且BMAX = 4.9 FMOL NG-1 APO（A），指示APO（a）分子的一个配体（图2D）。使用APO（A）KIV5-8串联域的直接配体结合实验显示出相同的效力和化学计量关系。3H-LSN33374443的有效性低于3H-LSN3441732，KD值分别为13 nm和0.33 nm（扩展数据表3）。与全长apo（a）的放射性结合研究一致，带有APO（a）KIV5-8串联域的ITC数据表明LSN3374443与2：1 stoichiimementry结合，而LSN3441732与1：1 stotoichiimementry结合（图2E）；两种化合物的KD值低于15 nm。单个KIV7（KD = 2.8 nm）和KIV8（KD = 2.0 nm）的多价3H-LSN3441732的亲和力比其对KIV7-8（kd = 0.21 nm）和KIV5-8（KD = 0.33 nm）（KD = 0.33 nm）的亲和力低于该数值的2.2.2.0 nm（kd = 0.33 nm），该数字有效期2.2.21 nm（kd = 0.21 nm），该数字有效。这些数据以及LSN3441732同时绑定到两个KIV8域的晶体结构分析表明，可以同时参与多个APO（a）KIV域，从而改善了结合亲和力和LP（a）抑制效力的改善（扩展数据图2B）。值得注意的是，使用单体化合物LSN3353871观察到，使用ITC排除了LSN3441732与KIV2的结合（扩展数据表1）。

　　In Lp(a) transgenic mice, LSN3441732 plasma concentrations increased in a dose-dependent manner and steady-state plasma Lp(a) levels decreased after five days of oral BID dosing, with an ED50 of 4 mg kg−1 and a mean maximal inhibition of 79% at the 30 mg kg−1 dose (Extended Data Table 4 and Fig. 3a).在cernomolgus猴子中，2 mg kg-1和10 mg kg-1口服bid剂量的LSN3441732降低了中位LP（a）水平的最高45％和57％，剂量5天后，并继续抑制14天的LP（A）稳态（A）的稳态水平（分量为14天）（扩展图表4和Fige）4和Fige。LSN3441732与多价结合机制兼容，与单价抑制剂相比，体外和体内的效力和功效都提高了。

　　合成了多个三聚体分子LY3473329的进一步优势（图3C）。LY3473329和KIV8之间相互作用的晶体结构分析表明，三聚体能够同时与三个KIV8结构域结合，这表明在APO（a）中可以使用多KIV结构域的相互作用（图3D和扩展数据图2C）。LY3473329-HCl盐与KIV8有选择性地结合22 nm的效力，并抑制IC50值为0.09 nm的LP（a）颗粒的形成（n = 9）（扩展数据表1和图3E）。在LP（A）转基因小鼠模型中，LY3473329-HCl盐的血浆水平以剂量依赖性的方式增加，使用LY3473329-HCL处理LY3473329-HCL降低了LP（a）的水平，其绝对ED50的水平为3 mg kg-1，最大LP（A）最大LP（a）降低了92％后的5天和图3和图3和图3和图3和图3的数据。在cynomolgus猴子中，LY3473329以剂量依赖性方式降低了中位LP（A）水平，每天在100 mg kg-1中，每天一次（QD）同类中的100 mg kg-1中的水平（扩展数据表5和图3G）。与单价（扩展的数据表6）相比，多种关系允许多个APO（a）KIV结构域的参与大大提高了LP（a）形成抑制剂（a）形成的抑制剂的效力和功效（a）降低的体内模型（a）降低（扩展数据表6）。

　　纤溶酶原是一级纤维蛋白酶纤溶酶的促酶前体。循环纤溶酶原包含一个泛苹果结构域，五个Kringle结构域（KI – V）和丝氨酸蛋白酶结构域，采用了封闭的耐激活构象26,27。纤溶酶原活性的调节受到严格控制以确保全身性止血，纤溶酶的失活取决于纤溶酶α2-抗血清素的生理抑制剂，从而使纤溶酶从循环中清除了纤溶酶。由于APO（A）KIV结构域与纤溶酶原kringle结构域具有高百分比的身份，因此我们研究了这些化合物是否可以调节纤溶酶原活性，如纤溶酶酶活性测量。

　　将单体和多价化合物添加到大鼠和人血浆体外，以评估纤溶酶介导的凝块溶解的可能干扰，但纤溶酶活性不受影响（扩展数据图3），提供了证据表明LP（A）抑制剂没有直接调节纤溶酶原活化或纤溶酶活性。尽管在用单体化合物LSN3353871治疗的大鼠中未观察到对纤溶蛋白活性的抑制作用，而在药理剂量上使用多价化合物LSN3441732和LY347329-HCl盐进行药理剂量，降低了血浆纤溶酶活性，降低了血浆活性。因为将这些化合物添加到血浆中不会影响纤溶酶在体外的酶活性，所以我们研究了可能解释动物模型中纤溶酶活性降低的机制。在大鼠中，用多价LP（a）破坏者LSN3441732进行每天口服剂量后，肝PLG mRNA的水平不变（扩展数据图4）；然而，LSN3441732和LY3473329-HCl盐以剂量依赖性的方式降低了血浆蛋白的血浆水平（图4A，B）。由于这些结果增加了多价LP（a）破坏者可以降低人类中纤溶酶活性的可能性，因此我们检查了驱动这些化合物介导的纤溶酶原水平降低的基本机制。

　　比较来自大鼠，cynomolgus猴子和人类的纤溶酶原的主要氨基酸序列（图4C），并了解封闭抗激活构象中的Kringle赖氨酸结合位点的可及性，如人类质质基结构26所示，我们假设了多价性质的人类质膜结构26。具有LSN3353871的结构数据表明，由天冬氨酸（D）残基组成的关键基序之间存在分子相互作用，任何氨基酸（X）和KIV8中的谷氨酸残基（E）（DXE基序）（图1D）（图1D），因此我们将这些基序聚焦于这些基序中的质子蛋白蛋白质中。值得注意的是，在APO（a）中，每个KIV从KIV5重复到KIV8都包含DXE基序。大鼠纤溶酶原kringle（K）K-2和K-3结构域都包含DXE基序，而该基序仅在人纤溶酶原中存在于K-2中（图4C）。我们假设多价化合物可以充当大鼠纤溶酶原中K-2和K-3的二价粘合剂，而它们只能通过与K-2的独家相互作用来充当人纤溶酶原的单价粘合剂。如果这是正确的，那么多价化合物的结合亲和力应比人纤溶酶原具有更高的结合亲和力。用二价3H-LSN3441732分子和大鼠和人纤溶酶原的饱和结合实验表明，3H-LSN3441732对大鼠纤溶酶原的亲和力比对人纤溶酶原具有50倍的亲和力（图4D）。如ITC所评估的，二价分子与K-3结合到大鼠纤溶酶原的K-3结构域，其亲和力比K-2与人纤溶酶原的K-3域高100倍以上。大鼠K-2至K-3的KD值小于10 nm，而人K-2至K-3的KD值为1.6 µm（图4E）。我们假设，多价分子与K-2与K-3中的大鼠纤维蛋白原结合的后果破坏了在封闭的纤溶酶原中发现的K-2 – Lys708相互作用，并触发了一个开放的构象，从而有利于快速降解的开放构象（图4F），从而解释了用盐33333332和LINE3332和LINE332和LINE3332和LINE3332和LINE3332和LINE332和LINE332和LINE332和LINE3。证据表明，大鼠和人纤溶酶原结合之间的效力差异转化为能够降低LP（a）水平而不会影响纤溶酶活性的口服剂量的证据，可以在人类1期LY3473329（Muvalaplin）28的人类1期研究中找到。通过LPA，PLG，PLG，纤溶酶原激活剂尿激酶（PLAU），纤溶酶原激活物组织类型（PLAT）和凝血酶原（F2）（F2）的全部kringle结构域的多个序列比对分析其他潜在的非目标蛋白相互作用的分析。比较抑制剂结合位点附近的残基（扩展数据图5B）表明，只有人PLG K-2保留DXE侧链，这些侧链与LY3473329进行了关键相互作用（扩展数据图5C）。

　　总而言之，我们通过通过复合多价性利用APO（a）的重复KIV结构域结构来报告和优化LP（A）形成的有效和选择性的小分子抑制剂。对这种化合物与APO（a）之间的参与获得了机械理解，这使我们能够开发出对apo（a）在人类中具有选择性的分子（a）。这些结果提供了一种概念证明，即LP（a）的口服小分子抑制剂可能是患有动脉粥样硬化心血管疾病或钙化主动脉瓣疾病风险的高水平LP（a）患者的治疗选择。