所有实验均由MD Anderson癌症中心的机构动物护理和使用委员会批准。从T. C.südhof24获得了有条件删除的SYT2，有条件删除的小鼠，其侧面是LOXP重组位点（Floxed，Syt2f/f）的第二个外显子。这些是在混合的129/sv上生成的：C57BL/6背景，并由我们回覆了十代，上面覆盖了C57BL/6J背景。为了删除气道上皮细胞中的SYT2，将SYT2F/F小鼠与小鼠交叉，其中将针对哺乳动物密码子使用优化的CRE重组酶撞到了促进果蛋白1A11A11A11A1（SCGB1A1CRE）中（参考文献25,26）。SYT2F/F小鼠越过SYT2F/F小鼠所产生的后代的一半也是SCGB1A1CRE等位基因的杂合子，是SYT2 DERETANT（SYT2D/D）小鼠，另一半是Syt2f/F小鼠，是用于杂菌素secretions for McCetions的Syt2f/F小鼠。基因分型是通过PCR使用SYT2 WT的寡核苷酸引物和参考文献中描述的突变等位基因进行的。24。通过免疫组织化学染色（扩展数据1）使用对SYT2（ABCAM，ABCAM，ABC113545，1：1,000）和次级二级驴IgG多克隆抗体conjun和jackson conjuged offoxconsexiciS origoxs（ABCAM，1：1,000），通过免疫组织化学染色（扩展数据1）证实SYT2的缺失（扩展数据图1）证实711-005-152，1：5,000）。使用二氨基苯胺基板试剂盒（Vector Laboratories，SK-4100）定位过氧化物酶活性，并用血久毒素对载体进行了反染色。C57BL/6J小鼠是从杰克逊实验室购买的，并用作对照，以确保SYT2F/F等位基因在气道上皮中不是造态。由于SYT2F/F小鼠与基线或粘液上皮症的程度和刺激分泌效率的WT SYT2小鼠没有差异（图1），， 它们被用作SYT2D/D小鼠的主要比较器，以最大程度地减少环境和脱靶遗传差异。两性的小鼠使用了6-26周的年龄。在12 h – 12 h的浅色周期中，将动物饲养在没有病原体的特定条件下，并随意食物和水。根据我们先前对粘蛋白分泌和腔内粘液积累的效果大小，计算群体大小以检测群体间差异，功率为90％，两尾显着性为5％。所使用的动物数量是与科学完整性和调节性可接受性一致的最低限度，并考虑了单个动物的福利，以每只动物进行的程序的数量和程度。在所有条件下，将适当基因型的小鼠随机分配给组。在数据收集和分析过程中，研究人员对小鼠组分配视而不见。此外，对动物的基因型和治疗视而不见的研究人员分析了小鼠气道图像。

　　如先前所述，测量了Syt2突变小鼠气道管腔中刺激的粘蛋白分泌的效率和粘液积累的程度22。简而言之，为了增加细胞内的粘蛋白含量（即诱导粘膜化生），每隔一天，在40 µl PBS中灌输了3 µg IL-13（Biolegend），总共3次，在同氟烷麻醉下的小鼠后咽后部咽部咽部，以使其在内何时进行攻击。最后一次滴注三天后，通过将小鼠暴露于0.9％NaCl中的100 mM ATP的气溶胶刺激粘蛋白分泌，然后在20分钟后收集肺。用PAF染色小鼠支气管气道的横切切片，以表现出红色荧光的粘蛋白。计算分数粘蛋白分泌是根据仅用IL-13治疗的同一基因型的小鼠的组平均粘蛋白含量，仅在IL-13和ATP或ATP或甲基苯胺下顺序治疗后，细胞内粘蛋白含量的降低（请参见下文）。为了测量细胞内气道上皮粘蛋白含量，将肺通过气管膨胀，福尔马林中性10％缓冲福尔马林在4°C下至20 cm的水压，然后在4°C下24小时，然后嵌入石蜡中。单个横向5 µM截面通过侧面分支1和2之间的左肺的轴向支气管进行，将脱水量化，再水化并用PAFS试剂染色。

　　使用直立显微镜（Olympus BX 60）获得×40物镜（NA 0.75），并使用ImagePro-5.1（介质网络材料）在轴向支气管的圆周截面周围测量细胞内粘膜。对小鼠基因型和治疗视而不见的研究者分析了图像（补充表1）。

　　根据先前的方案22,57进行粘蛋白分泌的定量。首先，使用仅在红通道中获得的图像，测量了基底膜上方的细胞内染色的总面积和荧光强度。其次，使用在红色和绿色荧光下捕获的图像，测量上皮的总表面积和每个田间的地下膜的长度。然后根据立体学计算粘蛋白染色的体积密度，因为染色与上皮的总表面积之比除以边界长度测量，这是总上皮表面积，地下膜长度和几何长度和几何常数4/π的产物。结果，数据显示为上皮粘蛋白体积密度，表示上皮基底层的单位区域的测得的粘蛋白体积。

　　为了测量SYT2突变小鼠中的气道腔粘液含量，如上所述诱导粘膜化生，然后通过暴露于150 mM甲霍洛琳的气溶胶10分钟来诱导粘蛋白分泌和支气管收缩。收集肺并通过浸入4°C固定48小时，以避免流体粘液的位移，并使用基于甲醇的Carnoy溶液（MECHACARN）进行固定，以最大程度地减少粘液体积的变化。单个横向5 µM截面通过侧面分支1和2之间的左肺的轴向支气管，并用上述PAF染色，以评估细胞内粘蛋白，以确保刺激分泌。然后，以500μm的间隔将石蜡块的六个5 µM切片尾部尾部取，并用PAF染色。手动鉴定出气道管腔中的粘液，并使用ImagePro-5.1（媒体控制论）22识别所有十二个部分的概括。

　　为了测量用肽治疗的WT小鼠的气道腔内刺激性粘蛋白分泌的效率和粘液积累程度，遵循与用于分析SYT2-突变小鼠的程序相同的程序，除了通过固定左肺的固定和固定的固定液的固定，在同一小鼠中测量了这两种结果，除了在同一小鼠中测量了型号，并衡量了左肺的固定，并在形式上固定液体的固定液体，并衡量。甲基甲酸以测量粘液积累。两种结果都使用单个甲基苯胺气溶胶刺激粘蛋白分泌。使用微喷雾剂喷雾剂（Penn-Century）用于气管内肽递送（50μl）向气道，分泌在左轴向支气管中的分泌位于Syt2突变剂中3毫米处的左轴向支气管中，由于较大的远端肽在远处的较高的较高的extiruly Data Data和Movers Your the Pirlient and Tiger and Tiger and Tigper and Tigper and Tigperruly and Tiger and Tiger and Tigperruly and Triy。尾叶以500 µm的间隔为8-10个厚度为5 µm。

　　有关重复序列的详细信息，数据点N（即小鼠）的数量以及每个小鼠分析的图像数量在补充表1中提供。在两次不同的情况下，两次涉及所有实验组的实验进行了两次。分别处理来自每个独立实验的小鼠的肺组织。

　　为了测量与体内CPP结合的SP9和对照肽的摄取，如下所述，通过在C末端囊这链残基处将肽用Cy3标记为Cy3。标记的肽（200μM微透明剂浓度）或PBS被引入气道中作为气溶胶，使用Penn-Century微透明剂在直接可视化的情况下插入远端气管中，并使用喉镜直接可视化。30分钟后，将小鼠安乐死，并通过上述福尔马林中性10％缓冲福尔马林的充气固定肺，如上所述，用于测量粘蛋白分泌。横向切片由左轴向支气管，并用DAPI染色以证明核。标记肽的分数摄取是在单个细胞中蓝色DAPI标记的核数量上的红色CY3荧光染色。为了说明分泌和纤毛细胞的相对肽吸收（扩展数据图9d），分泌细胞的免疫荧光染色是使用针对CCSP（Millipore Sigma，ABS1673，1,000）的一级山羊多克隆抗体，二级驴抗goat andi-Goat fumson andecy anex andex conjaj conj conjy andex conjj conjje（Millipore Sigma，ABS1673，1,000）进行的。Immunoresearch，705-545-147，1：1,000）和用DAPI染色。补充表1中提供了有关实验重复序列，数据点N（即单元）的数量（即单元）和分析的图像数量的详细信息。

　　我们使用相同的构造和协议来纯化无半胱氨酸的STX1A，SNAP-25A，VAMP2和SYT1，如参考文献中所述。41。我们使用相同的构造和协议来净化NSF，以及Ref中所述的αSNAP。58。通过在280 nm处的紫外线吸收来测量蛋白质样品浓度，并在液氮中闪烁等分试样，并储存在-80°C下。

　　全长人类STX3在大肠杆菌菌株BL-21（DE3）中表达，具有N末端，TEV-蛋白酶可裂解的Hexa-histidine标签。表达和纯化方案与STX1A的表达式大致相同。该蛋白在8升自动诱导培养基中以30°C的形式表达过夜。将来自8 L培养物的细胞颗粒悬浮在1×PBS，1 mM EDTA，1 mM PMSF和8种无EDTA的蛋白酶抑制剂片剂（Roche）中，这些蛋白酶抑制剂片剂（Roche）补充了溶菌酶和DNase I（Sigma-Aldrich）。使用超声（Thermo Fisher Scientific）和M-1110EH微荧光剂（微流体）裂解细胞。通过在JA-14转子（Beckman Coulter）中以13,000 rpm离心30分钟，将包含体切除30分钟，然后将上清液以43,000 rpm离心1.5 h，在Ti-45转子（Beckman Coulter）中以1.5 h离心，以使膜颗粒。将膜重悬于20毫米HEPES pH 7.5、300毫米NaCl，10％甘油中，并以43,000 rpm离心1小时。将颗粒再次悬浮在同一缓冲液中，将十二烷基马尔替剂（Anatrace）添加至2％，并在4°C下搅拌样品1.5 h。将溶解的膜以40,000 rpm离心35分钟，然后将上清液加载到5 mL镍-NTA琼脂糖（Qiagen）的5 mL柱上。用20 mM HEPES pH 7.5、20毫米咪唑，300 mM NaCl，110 mM辛基糖苷（Anatrace），10％甘油洗涤该色谱柱，并用补充450 mm Imidazole和1 M NaCl的洗涤缓冲液洗脱蛋白质。将蛋白质分数合并，用110 µg TEV蛋白酶消化，并在20 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl，110 mM辛基葡萄糖苷（OG）（Anatrace）（Anatrace）和10％甘油中透析过夜。将分数加载到已用透析缓冲液平衡的MonoQ 4.6/100 PE柱（GE Healthcare）上。该蛋白在30列体积上用50 mm至1 m NaCl洗脱。通过在280 nm处的吸收来测量蛋白质浓度，并在液氮中闪烁等分试样，并储存在-80°C下。

　　表达和纯化方案与SNAP-25A的表达式大致相同。半胱氨酸的SNAP-23，其中所有半胱氨酸残基被更改为丝氨酸，在BL21（DE3）细胞中使用自动诱导培养基从PGEX载体作为N端GST标签，并带有凝血酶蛋白酶裂解位点，以删除标签。将4.0 L诱导培养物的细胞重悬于250 mL的缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，300 mM NaCl，4 mM DTT，4 mM DTT，10％甘油）中，含有1 mM PMSF和5个EDTA无EDTA无蛋白酶抑制剂片。通过超声处理细胞裂解。通过在Ti45转子中离心35分钟，以40,000 rpm的速度阐明裂解液。上清液结合到10 mL的谷胱甘肽Sepharose珠（GE Healthcare），在4°C下搅拌1小时。通过离心收集珠子，倒入柱中，并用100 mL缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，300 mm NaCl，4 mM DTT，10％甘油）洗涤。将凝血酶（10 µL的5 mg mL -1）与5 mL缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，300 mM NaCl，4 mM DTT，10％甘油）一起添加到洗涤珠中，并将混合物在4°C下摇动过夜，以取消GST标签。使用缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，300 mM NaCl，4 mM DTT，10％甘油）将切割的SNAP-23样品从色谱柱中洗净，并浓缩至5 mL。将样品注入在20 mM HEPES pH 7.5、100 mM NaCl和10％甘油中平衡的SuperDex 200（16/60）列（GE Healthcare）。将含蛋白质的馏分组合并浓缩至100 µm SNAP-23。通过在280 nm处的吸收来测量蛋白质浓度，并在液氮中闪烁，并将其储存在-80°C下。

　　VAMP8在大肠杆菌菌株BL-21（DE3）中以N末端，TEV蛋白酶裂解，GST标签表示。该蛋白在8.0 L自动诱导培养基中在25°C下过夜。将细胞颗粒悬挂在20 mM HEPES pH 7.5、300 mM NaCl，2 mM DTT，1 mM EDTA和8个无EDTA的无EDTA无蛋白酶抑制剂片剂中，这些抑制剂片剂是补充溶菌酶和DNaseI的。使用Sonicator（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific）和M-1110EH Microfluiidizer裂解细胞。通过在JA-14转子中以13,000 rpm离心30分钟，将细胞碎片除去，并在TI-45转子中以43,000 rpm离心上清液1小时，以颗粒膜。将沉淀重悬于20 mM HEPES pH 7.5、300 mM NaCl，2 mM DTT，1 mM EDTA和1.5％DDM中，并在4°C下搅拌2.5 h。将溶解的膜以43,000 rpm离心35分钟，将上清液与5 ml谷胱甘肽塞彭糖4B一起混合，并在4°C下孵育过夜，并与最终的混合混合。将珠子用20毫米HEPES pH 7.5、300 mm NaCl，2 mM DTT，1 mM EDTA和110 mm OG洗涤。通过将珠子重悬于2 ml的洗涤缓冲液中，并补充了110 µg TEV蛋白酶，并在4°C下孵育1小时，将蛋白质切开了圆柱。消化后，将色谱柱排干，并将通过20 mm HEPES pH 7.5，300 mm NaCl，2 mm DTT和110 mm OG平衡的SuperDex 200 10/300增加柱（GE Healthcare）注入流动（包含切割VAMP8）的流动。合并含有蛋白质的馏分，并通过在280 nm处吸收来测量蛋白质浓度。等分试样在液氮中闪烁，并在-80°C下储存。

　　SYT2在BL21（DE3）细胞中使用PGEX矢量的自动诱导介质作为N末端GST标签，并带有凝血酶蛋白酶裂解位点以删除标签。将来自4 L诱导培养物的细胞重悬于200 mL缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5、300 mM NaCl，1 mM EDTA和2 mM DTT）中，其中包含4个无EDTA无蛋白酶抑制剂片剂。通过三个通过时通过三个通过时通过乳液C5均匀的均质（Avestin）裂解细胞。通过在8,000 rpm的JA-14转子中离心10分钟，将未透析的细胞和碎屑除去，在8,000 rpm的8,000 rpm中再次在同一转子中再次离心10分钟，以去除任何最终碎屑。然后将来自第二个离心的上清液在40,000 rpm的Ti45转子中离心1小时以收集膜。将膜使用100 mL缓冲液（20毫米HEPES pH 7.5、300毫米NaCl，1毫米EDTA和2 mM DTT）和N-二甲基麦尔替剂重悬于最终浓度2％（w/v）中，以溶解膜，并将其溶解在4°C中，以溶解膜，将N-Dodecylmaltoside添加到最终浓度。通过使用Ti45转子在40,000 rpm处离心35分钟，通过离心阐明提取物。将提取物在4°C搅拌2小时通过搅拌2 h。用缓冲液（20毫米HEPES pH 7.5，300 mm NaCl，1 mM EDTA，2 mM DTT）洗涤，其中含有110 mmβ-辛基 - 葡萄糖苷，并用缓冲液洗脱，并用缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，300 mm nacl，1 mm NaCl，1 mm Edta，1 mm Edta，2 mm dtt）含有110mm和110mmβ-β-β-β-β-β-β-β-lum MM含量为110mmMM，减少谷胱甘肽。通过用10 µL的5 mg ml-1凝血酶切除GST标签2小时，然后在20 mM HEPES pH 7.5，100 mM NaCl，110 mMβ-辛基二辛基葡萄糖苷和2 mM DTT（Monos Buffer）中纯化SYT2样品。用MONOS缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5、100 mM NaCl，110 mMβ-辛基 - 葡萄糖苷，2 mM DTT）洗涤色谱柱后，使用从100 mM到1 M NaCl的线性梯度洗脱蛋白质。合并了含蛋白质的馏分 通过在280 nm处的吸收来测量蛋白质浓度，并在液氮中闪烁，并将其储存在-80°C下。

　　SYT1 C2B（氨基酸范围271–421），SYT2 C2B（氨基酸范围272–422）域和SYT1 C2B（QM）（氨基酸范围271–421，R281a，r281a，r281a，e295a，e295a，e295a，y398a，y398a，r398a，r399a）coli teed fori teed fori teed fori tept f.st-coli teed in e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e.（DE3）30°C的细胞过夜。通过离心收集细胞后，将样品重悬于含有50 mM HEPES-NA pH 7.5、300 mM NaCl，2 mM DTT和EDTA无蛋白酶抑制剂鸡尾酒的裂解缓冲液中，然后进行超声和偏心。将上清液与谷胱甘肽丝精珠一起孵育。将树脂用50 ml洗涤缓冲液I含有50 mM HEPES-NA pH 7.5、300 mM NaCl和1 mM DDT洗涤，然后用50 mL洗涤缓冲液II，其中含有50 mM HEPES-NA pH 7.5、300 mm NaCl，1 mm DTT，1 mm DTT和50 mm Cacl2。将GST标签在4°C下用预缩蛋白酶（GE Healthcare）在裂解缓冲液中裂解过夜，其中含有50 mM HEPES-NA pH 7.5、300 mM NaCl，1 mM DTT和2 mM EDTA。通过Monos柱纯化裂解的蛋白质，并在SuperDex 75（GE Healthcare）上纯化凝胶过滤。通过在280 nm处的吸收来测量蛋白质浓度，并在液氮中闪烁，并将其储存在-80°C下。

　　The Munc13-2* fragment of Munc13-2 (amino acid range 451–1407, that is, including the C1, C2B and the C-terminally truncated MUN domains, but excluding residues 1326–1343) was cloned into a pFastBac HTB vector with a GST tag and a PreScission cleavage site.该构建体中残基1326–1343的删除可阻止聚集39,59，而C末端截断可提高溶解度。将来自8 L的SF9细胞培养的细胞重悬于200 mL重悬浮缓冲液（RB）（50 mM Tris，pH 8.0，500 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5 mM TCEP，10％甘油，10％甘油）中，其中含有6个EDTA无蛋白酶抑制剂。细胞通过15,000 P.S.I的三个通过三个通过的通过。通过在Ti45转子中以40,000 rpm离心35分钟来阐明裂解物。将上清液与15 mL谷胱甘肽丝糖珠在4°C下搅拌2小时混合。使用AKTA Prime系统（GE Healthcare）洗涤珠子，该系统具有20 ml RB，90 mL RB+1％Triton X-100，然后用RB+50 mM降低谷胱甘肽洗脱。合并峰值分数，然后加入100 µL 10 mg ML -1预缩蛋白酶并过夜孵育。通过SuperDex 200色谱柱上的凝胶过滤纯化裂解的蛋白质。通过在280 nm处的吸收来测量蛋白质浓度，并在液氮中闪烁，并将其储存在-80°C下。

　　Munc18-2 (amino acid range 1–594) was cloned into a pFastBac HTB vector with an N-terminal hexa-histidine tag and a TEV-cleavage site.将来自4.0 L的SF9细胞培养物的细胞重悬于100 mL重悬浮缓冲液中（RB）（20 mM磷酸钠，pH 8.0，300 mM NaCl，2 mM DTT，2 mM DTT，10％甘油，用1 mM PMSF），其中包含6个EDTA无蛋白酶蛋白酶抑制剂片。细胞通过3通过3次通过Avestin C5均质器裂解。通过在Ti45转子中以40,000 rpm离心35分钟来阐明裂解物。将上清液与3 ml Ni-NTA珠在4°C搅拌1小时混合。使用Akta Prime系统将珠洗涤，每个Akta Prime系统每个RB，然后用RB+300 mM咪唑洗脱。合并峰值分数，然后加入100μl11mg ML -1 TEV蛋白酶。将混合物透析过夜，1升500 mL的20 mM HEPES pH 7.5，300 mM NaCl，2 mM DTT，10％甘油。将TeV裂解的蛋白注入了SuperDex 200色谱柱上。将峰值分数组合在一起，并通过在280 nm处的紫外线吸收来测量蛋白质浓度。在液体N2中闪烁100μl的等分试样，并将其存储在-80°C下。

　　固定的肽SP9和非抑制肽P0（图2C），以及N末端的肽嵌合体，带有偶联的CPPS或Biotin，以及/或C cy3 cy3 cy3 cy3 cy3 cy3 cy3 cy3 cy3 cy3 cy3 cy3 cy3 cy3在C上TAT – SP9 – CY3和TAT – P9 – CY3（图4A）；使用固相肽合成和FMOC化学进行肽合成。使用三氟乙酸和标准清除剂裂解肽。使用反相高压液相色谱（RP-HPLC）纯化肽。对于固定肽，合成了烯烃侧链的α，α-二取代的非天然氨基酸（S5-S立体化学，桥接5个氨基酸）。

　　使用grubbs Catalyst36制成碳氢化合物。对于所有固定肽，将N末端乙酰化并埋葬C末端。例如，使用自由蓝色仪器（CEM）上的Rink Amide树脂以0.2 mmol量表合成SP9。所有氨基酸都使用标准保护组。所有氨基酸均使用5氨基酸/HBTU/DIEA相对于树脂负荷耦合；S5后使用相同的摩尔过量耦合S5后的氨基酸。在二甲基甲酰胺（DMF）中用20％哌啶进行FMOC脱身。在最终的FMOC脱身后，使用0.8 M乙二醇和0.43 m N-甲基-2-吡咯烷酮在DMF中进行乙酰基化。使用第一代Grubbs催化剂在二氯乙烷（DCE）中进行闭环分解。允许该反应进行过夜，免受光线保护。然后将树脂用DCE冲洗，然后在DMF中（4×30分钟）在DMF中1％二硫代二硫代氨酸钠三水合物冲洗。然后将树脂用DMF和二氯甲烷冲洗。使用三氟乙酸切割并脱离肽：H2O：乙烷-1,2-二硫醇：硫烷烷酸/乙基甲基硫化物（84：4：4：4：4：4：4：4：4）持续3 h，在以太醚中沉淀，在乙醚中沉淀，并以中心为中心。将颗粒重悬于以太并离心，然后将溶剂倒入。将颗粒溶解在1：1乙腈：H2O并冻干。使用C18柱（10 µm，120Å，25×250 mm）和42-58％缓冲液B（乙腈中的0.1％三氟乙酸）使用C18柱（10 µm，120Å，250 mm）通过RP-HPLC纯化粗肽。

　　生物素标记的钉钉肽生物素– SP9 – Cy3通过通过碳垫片6-氨基己糖的碳垫片交联生物素通过在N末端进行生物素化。

　　对于指定的肽，将C末端胱氨酸残基通过pH 7.4的马来酰亚胺反应化学连接至CY3荧光染料，并将染料与肽的1-2摩尔比再次纯化Cy3标记的肽再次纯化。例如，将纯化的SP9溶解在PBS中：乙腈：DMSO（2：1：1）。将Cy3-甲酰亚胺（1当量）溶解在DMSO中，并添加到肽溶液中。在黑暗中允许反应进行1小时。使用C18色谱柱（10 µm，120Å，25×250 mm）和46-66％的缓冲液B通过RP-HPLC纯化共轭肽，持续140分钟。

　　All of the peptides were purified to >90–95% and quality control was performed by liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC–MS) by the manufacturer (HPLC chromatograms and LC–MS data for SP9, TAT–SP9–Cy3, PEN–SP9–Cy3, PEN–P9–Cy3, TAT–P9–Cy3, SP9–Cy3 and P0 are provided in Supplementary Figs.分别为2-8）。随后，将肽冻干并运输。LC-MS质量控制数据表明，肽根据其化学成分具有预测的分子质量。此外，溶解在DMSO中的5 mg SP9的1H 1D和2D HSQC，HMBC，ROESY NMR实验（补充图9）表明，钉书钉（S5） - 分辨率在肽序列中的预期位置处于预期位置，并与邻居残基相连。尽管某些共振存在一些光谱重叠，但数据与形成两个S5-S5对是一致的。综上所述，数据表明SP9具有预期序列和化学构型。

　　对于每组实验，将肽粉的等分试样直接溶解在约1 mm浓度的指定缓冲液中，然后将其稀释至指定的肽浓度。例如，为了制备SP9的储备溶液，请称量2 mg SP9肽粉。考虑到SP9的2222 g mol -1的分子质量（补充图2），这对应于9×10-7 mol。对于所需的1 mM SP9的浓度，我们添加了9×10-7 mol 1-1×10-3 mol L -1 = 0.9 mL缓冲液。使用纳米体仪器（Thermo Fisher Scientific）在205 nm处的吸收测量确认了储备溶液的浓度。

　　使用具有1 mm路径长度的细胞在190-250 nm处使用AVIV停止流量光谱仪测量CD光谱。在20°C下测量了PBS缓冲液中含有100μM合成肽（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4和2 mM Kh2PO4，pH 7.4）的样品。为了校正基线误差，从所有实验光谱中减去了空白运行的信号。通过将平均残基椭圆率[φ] 222OB除以报告的[φ] 222OBS的平均残基椭圆度[φ] 222OBS，计算了每种肽的α-螺旋含量。

　　PM和SG囊泡使用玻璃体（Thermo Fisher Scientific）在蕾丝碳网格上分别玻璃化，并使用FEI Tecnai F20透射式冷冻电型显微镜与田间发射枪（FEI）进行成像。图像记录在电子计数模式中的Gatan K2峰会电子计数直接检测摄像头（GATAN）上。×5,000和×9,600的名义增强率（对应于7.4Å和3.8Å的像素大小），分别用于气道PM和SG囊泡（扩展数据图6a）。使用EMAN2（参考文献62）测量了囊泡的直径（扩展数据图6B）。

　　在散装荧光各向异性实验中，P0和SP9在C末端用荧光染料CY3标记。使用Tecan Infinite M1000/Pro荧光计测量荧光各向异性，使用530±5 nm的激发波长，在27.2°C下的发射波长为580±5 nm。将荧光型标记的样品稀释至10 nm的TBS（20 mM Tris，pH 7.5，150 mm NaCl，0.5 mm TCEP），以获得最佳读取。

　　所有分子动力学模拟的起点是以1.85Å分辨率（PDB：5W5C）15的SNARE – SYT-1 – COMPLEXIN-1复合物的晶体结构15。在模拟之前，从晶体结构中删除了SYT1 C2A结构域，晶体学水分子，MG2+和甘油分子。具体而言，以下残留物包括在主要接口的模拟中：SYT1 C2B（氨基酸范围270-419），Synaptobrevin-2（氨基酸范围29-66），STX1A（氨基酸范围191-244），SNAP-25A（SNAP-25A）（氨基酸ranges 10-74和141-194和141-194）。复合素-1不包括在模拟中。对于主要界面（SNARE – SYT1 C2B）模拟，使用产生主要界面的SYT1 C2B分子。

　　对于SYT1 C2B – P9，SYT1 C2B（氨基酸范围270-419）和SNAP-25的残基37–53的模拟（对应于P9序列：Eeskdagirtlvmldeq）。对于SYT1 C2B – SP9的模拟，使用SYT1 C2B -P9复合物作为起点，SP9的主食是通过使用CHARMM拓扑和S5的参数文件以及S5残基之间的共价键来创建的。63。通过使用Pymol V.2.5.1（Schrödinger）将天然残基突变为LYS，然后使用VMD突变命令64将LYS变为S5，从而生成S5残基的初始坐标。用乙酰化的N末端和胺化的C末端模拟SP9和P9肽。对于所有模拟，使用NAMD程序65。

　　作为对照，在溶剂化的环境中进行了五个主界面的五个1μs分子动力学模拟（扩展数据图2D，E）。对于这些模拟，将起始模型放置在113×125×116Å的周期性边界条件框中。盒子中的空白空间充满了使用VMD溶剂插件的50,420水分子。该系统共有157,833个原子。通过添加155个钾和138个氯离子，该系统被电荷中和化，并通过使用VMD自动取代插件对应于〜145 mm的盐浓度。

　　对于使用P9和SP9的模拟，将起始模型放置在80×80×80Å的周期性边界条件框中。盒子中的空白空间充满了约15200个水分子，使用VMD溶剂插件。该系统共有48,486个原子。通过添加42个钾和44个氯离子，该系统是中和中心化的，并通过使用VMD自动启动插件的盐浓度对应于〜145 mm的盐浓度。

　　使用CHARMM22（P9 – SYT1 C2B和SP9 – SYT1 C2B模拟）或CHARMM36（主要接口模拟）全氢压场和参数66，无键的截止值为11Å。通过调整盒子的尺寸，使用了一种恒压方法。粒子网埃瓦尔德方法用于加速远程静电非键入能量项的计算。使用Langevin动力学（具有摩擦项和随机力项）来维持模拟的温度。使用NAMD实现的嘎嘎作用方法，所有氢气原子键均保持刚性。

　　对于带钉肽的模拟，在放松步骤中，添加二面角约束以限制顺式构象中的S5 – S5 CE – CE双键双键，S5烯烃的反式构象中的S5烯烃侧链，以及所有α-甲型构型中的所有α-螺旋（使用SSRERSTRANTS插入VMD）。在随后的所有步骤（加热步骤和生产运行）中，所有这些二面角约束都被关闭。对于所有其他无钉肽的模拟，在弛豫步骤中，为所有α-螺旋添加了α-螺旋（二级结构）约束（使用用于VMD的ssrestraints插件）。在随后的所有步骤（加热步骤和生产运行）中，所有这些二面角约束都被关闭。通过以下步骤对系统进行平衡：（1）放松步骤，通过1 FS时间步长将温度从0到50 k提高到50 k；（2）第一个加热步骤，通过1 FS时间步长将温度从50 k提高到50 ps；（3）第二次加热步骤，以1 FS的时间步长将温度从100 k提高到150 k。对于所有模拟，在300 K的温度下运行1个NS块，时间步长为1 fs。通过使用不同的初始随机数种子，对每个系统（主要界面，SP9 – Syt1 C2b，P9 – Syt1 C2B）进行了五个独立的1μs模拟。正如预期的那样，在这些模拟中，主要界面是稳定的。

　　P9 – Syt1 C2B的一个模拟导致了解离事件（图2G（绿色，右））。有趣的是，解离的肽P9具有高度动态性，揭示了各种扭曲的部分螺旋构象。据推测，非抑制P9肽的动力学增加导致与SYT1 C2B相互作用的稳定，从而产生了P9的相当不同的结合姿势（图2G）。

　　所有仿真均使用4个节点在斯坦福Sherlock群集上进行，每个节点由双重十核CPU 2.4 GHz Intel处理器组成，即每次模拟总共使用80个CPU。使用MPI-Parallel NAMD2 2.14B1可执行文件。为了可视化结果，仅显示蛋白质成分，并且所有结构彼此拟合，并使用Pymol V.2.5.1显示。

　　对于整体脂质混合测定，SV囊泡的脂质组成为磷脂酰胆碱（PC）（46％），磷脂酰乙醇胺（PE）（20％）（20％），磷脂酰甲酯（PS）（PS）（12％），胆固醇（20％）和（20％）和（20％）和（20％）和1,1'-二二烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚二氨基苯胺高氯酸盐（DID）（Invitrogen）（2％）；对于神经元和气道PM囊泡，脂质组成是脑总脂质提取物，补充了3.5 mol％PIP2，0.1 mol％生物素化的PE和2 mol％1,1'-二二烷基-3,3,3,3'，3'-四甲基氨基核氧苯胺多氯酸盐（DIII（DIII））（Invitrogen）。所有脂质均来自Avanti极性脂质。

　　对于单维含量混合测定，SV，SG，VAMP2或VAMP8囊泡的脂质组成为PC（48％），PE（20％），PS（12％）和胆固醇（20％）；对于神经元和气道PM囊泡，脂质组成是脑总脂质提取物，补充了3.5 mol％PIP2和0.1 mol％生物素化PE。

　　参考文献中详细描述了神经元PM和SV囊泡的重构方法。41,67,68。气道PM，SG，VAMP2和VAMP8囊泡使用了相同的方法。Dried lipid films were dissolved in 110 mM OG buffer containing purified proteins at protein-to-lipid ratios of 1:200 for VAMP2 and Stx1A for SV and neuronal PM vesicles, respectively (or 1:200 for VAMP8 and Stx3 for SG and airway PM vesicles, respectively), and 1:800 for Syt1 for SV vesicles (or 1:1,200 forsg囊泡的SYT2）。

　　将超过三到五倍的SNAP-25A或SNAP-23（相对于STX1A或STX3）添加到神经元或气道PM囊泡的蛋白质 - 脂质混合物中。将无洗涤剂缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4、90 mM NaCl和0.1％2-甲醇）添加到蛋白质 - 脂质混合物中，直到去污剂浓度处（但不低于）临界胶束浓度为24.4 mm的临界胶束浓度尚未形成。为了制备单维含量混合测定法的SV，SG，VAMP2或VAMP8囊泡，将50 mM磺胺​​素B（Thermo Fisher Scientific）添加到蛋白质 - 脂质混合物中。随后在尺寸排斥色谱期间形成的囊泡使用Sepharose CL-4B色谱柱在近乎恒定的压力下通过重力填充，用蠕动泵（GE Healthcare）在5.5 mL的列中，均具有约5 ml床的体积，该床的体积约为5 ml，用缓冲液平衡（20 mm Hepes pH 7.4和90 mm nac and 2），并补充20 mm nac and nacl）。2-甲醇。将洗脱液透析透析为2 L无洗涤剂的缓冲液V，并补充了20 µM EGTA，0.1％2-甲醇，5 g Bio-Beads SM2（Bio-Rad）和0.8 g L-1 Chelex 100 rad（Bio-Rad）。4小时后，将缓冲液与2 L新鲜的缓冲液V交换，并补充了20 µM EGTA，0.1％2-羟基乙醇和生物珠，并且透析持续过夜12小时。我们注意到，色谱平衡和洗脱缓冲液不含磺胺胺，因此在SV，SG，SG，VAMP2或VAMP8囊泡内的有效磺胺胺浓度低于50 mm（最多十倍）。对于集成脂质混合测定法，重构方法与单维含量混合测定法相同，除了所有步骤省略了50 mM磺胺​​胺B。

　　如前所述67，通过囊泡制剂的SDS -PAGE证实了气道系统中重构蛋白的存在和纯度，并通过甲氯丙酰果素消化评估了膜蛋白（面向向外）的方向性，然后通过SDS -PAP -PAPE -PAGE凝胶电泳进行了评估。如前所述69，通过冷冻电子显微镜（扩展数据图6a，b）分析气道PM和SG囊泡的大小分布。

　　使用与单维含量混合实验相同的方案制备了peg涂层的流室。首先将新鲜合成的SP9 – CY3粉末溶解在成像缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4、90 mm NaCl和0.5 mM TCEP）中，浓度为50μm，然后在约16,000 g上离心10分钟，以消除潜在的不溶性材料。通过在550 nm处通过CY3吸收样品的浓度，然后再稀释至100 nm，10 nm，1 nm和0.5 nm的浓度。将稀释的样品（5μl）注入石英载玻片上的流动室，然后用成像缓冲液立即洗涤（〜500μl）。SP9 – CY3与成像表面有一定程度的非特异性结合，从而通过观察单分子光漂白事件来实现荧光斑点分子的计数70。快速聚焦后，样品阶段被移至远离先前照明的同一样品室内的新鲜位置，并在绿色（532 nm）激光灯的激发功率的激发能力约为8 mW之前开始录制。在同一腔室内的新位置进行了多个记录。

　　通过观察顺序的逐步光漂白事件来计数荧光点中的SP9 -CY3分子的数量。通过SMCamera自动检测到荧光斑点，并为每个生成的斑点检测到时间迹线。使用为MATLAB编写的脚本，通过隐藏的Markov Modelling71,72自动分析了时间迹线。我们应用了基于约束的聚类来启动隐藏的马尔可夫模型（HMM），并在迭代中计算了过渡和发射的概率矩阵。然后，使用标准的Viterbi算法重建了最可能的状态序列。手动检查时间跟踪和自动HMM拟合。对于许多迹线，荧光强度有明显的逐步降低，其中逐步降低大约是HMM所识别的（扩展数据图3C）。选择痕迹，显示出明显的逐步荧光强度降低，并且在观察期结束时进行了完全拍摄的痕迹。然后生成了摄影步骤数量的直方图（也称为每个荧光点的SP9 – CY3分子的数量）（扩展数据图3D）。

　　使用532 nm（绿色）激光器（晶体剂）和637 nm（红色）激光（OBIS）激发，对所有单维融合实验均在棱镜型总内反射荧光显微镜上进行。由640 nm的单边二色束插曲仪（FF640-FDI01-25X36，Semrock）创建了两个观测通道：用于含量染料的荧光发射强度和另一个通道的CY5染料的另一个通道，是注射CA2+溶液的一部分。两个通道记录在一个相邻的矩形区域（45×90μm2）的电荷耦合器件摄像头（IXON+ DV 897E，Andor Technology）上。使用K. Suk Lee和T. Ha开发的SMCAMERA程序73记录并分析了成像数据。使用SMCamera自动检测到荧光峰，并以Smcamera格式和纯文本保存时间迹线（将Smcamera文件转换为TIFF的脚本，M。HynJo提供了文本文件）。使用为MATLAB编写的脚本检测到融合事件的候选事件，然后通过手动检查确认。

　　通过创建一个“三明治”来组装流室，该“三明治”由石英载玻片和玻璃盖玻片组成，它们都涂有聚乙二醇（PEG）分子，包括0.1％（w/v）生物素化的PEG，除非另有说明，否则使用双面胶带来创建五个流室。用PEG分子涂覆表面可减轻囊泡的非特异性结合。如先前所述，使用了相同的方案和质量控制（表面覆盖范围和非特异性结合），除了使用PEG-SVA（Laysan Bio）代替MPEG-SCM（Laysan Bio），因为它具有更长的半衰期。将流室与中性素孵育30分钟（0.1 mg ml -1）。

　　对于图3和扩展数据图中描述的单维融合实验。4、5和7，生物素化的神经元或气道PM囊泡（100倍稀释）通过在室温（25°C）下孵育30分钟将成像表面束缚到成像表面，然后用120 µL缓冲液V进行三轮洗涤，以除去未结合的神经元或气道PM囊泡；每个缓冲液洗涤有效地取代了3 µL流量室的体积超过100倍。

　　对于完整的重建（图3），要与重建的STX3 – MUNC18-2复合物形成气道SM囊泡，我们添加了“拆卸因子”（1μmMunc18-2，0.5μmNSF，NSF，5μMMMIMαSNAP，3 mm ATP和3 mm MMMG2+）的NEARIER（图3b）pmsiles（图3B）。蛋白质41。此过程导致束缚的SM囊泡。接下来，将带有束缚的SM囊泡的流室与缓冲液V一起洗涤，并与0.5μmMunc-13-2*和2μmSnap-23一起洗涤。

　　For all of the reconstitution experiments, after the start of illumination and recording of the fluorescence from a particular field of view of the flow chamber, SV, SG, VAMP2 or VAMP8 vesicles (diluted 100 to 1,000 times; including peptides at the specified concentration, 0.5 μM Munc-13-2* and 2 μM SNAP-23, if applicable) were loaded into the flow chamber to directly monitor vesicle association of SG,SV，VAMP2或VAMP8囊泡到神经元或气道PM囊泡1分钟。当肽包含在特定实验中时，将其与SV，SG，VAMP2或VAMP8囊泡混合，然后再加载到流动室中。因此，在将其加载到流动室之前，肽将有机会与SV或SG囊泡中的SYT1或SYT2结合。在继续记录时，将流量室用120 µL的缓冲液V洗涤3次（包括指定浓度的肽，0.5μmMunc-13-2*和2μmSnap-23（如果适用），以去除未结合的小囊泡。

　　对于完整的重建（图3），请注意，Munc13-2*将催化STX3从STX3 – MUNC18-2复合物中的转移到具有SNAP-23和VAMP8的三元SNARE COMPLEX中。因此，我们在此转移后再次将束缚囊泡称为PM囊泡（图3B）。

　　随后，我们继续录制了另一分钟，以监视自发的融合事件。为了在同一视野内启动Ca2+触发的融合事件，由缓冲液V，500 µM Ca2+或50 µm Ca2+，500 pm Cy5染料分子组成的解决方案（用作Ca2+到达的指示器），如果适用于evanescent场中的Ca2+到达），并将肽注入流量室内。使用类似于以前所述的戒断方法，通过电动注射器泵（哈佛设备）以66 µL s -1的速度进行注射。74。

　　To increase the throughput of the assay and make better use of the vesicle samples, after intensive washing (3 × 120 µl) with buffer V (which includes 20 μM EGTA to remove Ca2+ from the sample chamber), we repeated the entire acquisition sequence (SV, SG, VAMP2 or VAMP8 vesicle loading, counting the number of freshly associated vesicle-vesicle pairs, monitoring of Ca2+-independent在同一流动室内的不同成像区域中，融合，Ca2+的注入和监测Ca2+触发的融合）。使用同一样品室进行了五个此类采集回合。将第一和第二次采集回合的SV，SG，VAMP2或VAMP8囊泡稀释1,000×，第三和第四次采集回合为200倍，第五次采集回合100倍，以抵消表面略有增加的SG，SV，SV，VAMP2或VAMP2或VAMP2或VAMP8奈氏疫苗。然后重复几次（补充表2）（称为重复实验），整个实验（每个都有五回合）被重复几次。在指定数量的重复序列中，至少有三种不同的蛋白质制剂和囊泡重构，因此在条形图中观察到的变化反映了样品变化以及不同流动室之间的变化。对于每个条件，至少进行了两次独立的重构，并使用不同的成像区域进行了多次技术重复，因此数字n是指每个条件至少组合两个独立的重复机构的数量；所有重复都成功了，重复次数被认为足以在不同条件之间达到显着性。

　　从Promocell第2通道中获得了来自几个供体的原代HAE细胞，或者是从肿瘤切除术或完全同意的患者同意后从新鲜组织中分离出来的（伦理批准：伦理委员会医学院汉诺威，项目编号2701-2015）。根据参考方案分离细胞。57，将等分试样维持在液氮中，直到使用为止。将来自单个供体的HAE细胞解冻并扩展在T75烧瓶（SARSTEDT）插入式上皮细胞基础培养基中，这些细胞基础培养基补充了呼吸道上皮细胞生长培养基补充剂（Promocell）和5μgml -1质子素的预防性预防性，预防性为100μgml -1 prasmocin，100μgml -1 primogen和10μgml -1 fungin（均为100μgml -1 fungen）（来自Intiv）（均为10μgml -1 Fungin）（每两天更换每两天的生长培养基。达到90％汇合后，使用脱乙二醇（Promocell）将HAE细胞分离，并以0.4μm的孔径（3470，Corning Costar）播种成6.5 mm Transwell滤波器。将过滤器预先用胶原蛋白溶液（Stemcell Technologies）过夜，并用紫外线辐射30分钟，然后再进行细胞播种以进行胶原蛋白交联和灭菌。将在200 µL生长培养基中的细胞（3.5×104）添加到每个滤波器的顶端，并在基底外侧添加另外600 µL的生长培养基。48小时后更换顶端培养基。72–96小时后，当细胞达到汇合时，去除了顶端培养基，并将基底外侧培养基切换为分化培养基±10 ng ml-1 IL-13（IL012； Merck Millipore）。分化培养基由50:50的DMEM-H和LHC基底（Thermo Fisher Scientific）组成，并补充了Airway上皮细胞生长培养基补充培养基，如前所述75，并每2天更换。空气提升（去除根尖培养基）定义了ALI培养的第0天，并在ALI条件下生长细胞，直到在第25至28天进行实验。 从第14天开始，用Dulbecco的磷酸盐缓冲溶液（DPB）将HAE细胞培养物用Dulbecco的磷酸盐缓冲溶液（DPB）洗涤30分钟。

　　静态下的粘蛋白 - 分泌实验，即未经灌注的条件，如先前所述51,52,76，对肽治疗进行了修改。简而言之，对于24小时的肽处理，在刺激前24小时将20 µL的DMEM±100 µM肽添加到顶部表面。在测定当天，将细胞用100 µL DMEM洗涤五次，每次洗涤1 h。每次洗涤后收集顶部上清液（洗涤1-5），然后将100 µL的DMEM±100 µM肽添加到顶部表面，并在收集上清液（基线洗涤）之前孵育15分钟。然后将HAE细胞与100 µL DMEM±100 µM ATP（Sigma-Aldrich）一起孵育15分钟，然后收集上清液（实验洗涤）（图4E）。采集样品后，将细胞裂解在100 µL裂解缓冲液（裂解液）中，其中含有50 mM Tris-HCl pH 7.2、1 mM EDTA，1 mM EGTA，1％Triton-X（Sigma-Aldrich），蛋白酶抑制剂完整的Mini EDTA和磷酸酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（Rochor）。该方案适用于30分钟的肽处理，如下所示。洗涤5后，将100 µL的DMEM±10 µm或100 µm的肽（图4E）添加到顶部表面，HAE细胞孵育30分钟（基线洗涤）。然后将HAE细胞与100 µL DMEM±100 µM ATP孵育30分钟以收集实验洗涤。

　　将所有样品在PBS（洗涤液和细胞裂解物）中稀释1:10，并使用生物点微丝裂（Bio-Rad）将每个样品的50 µL吸入到0.45 µM孔硝基纤维素膜上。随后，将膜与截距阻塞缓冲液（LI-COR）一起孵育1小时，然后用抗MUC5AC（MA1–21907，Invitrogen）在截距阻止缓冲液中探测为1：250。然后将膜在PBS-Tweet-20（PBST）中洗涤4次，持续10分钟（PBST），然后与IRDYE二级抗体（926-33212或926-68072; LI-COR）孵育，在截距阻滞中以1：10,000稀释1 h。所有步骤均在室温下执行。使用Odyssey FC成像系统（LI-COR）获取荧光信号，并使用ImageJ（V.2.0.0; NIH）进行量化。将等量的样品加载到凝胶上进行对照和肽处理（补充图1中提供了所有原始凝胶）。MUC5AC总信号的差异是由于IL-13诱导的单个过滤器之间的化生的差异。因此，将刺激的分泌归一化为单个过滤器中的基线分泌，以说明过滤器之间的异质性。

　　为了说明供体的异质性，所有相关实验均在至少四个单个供体产生的HAE细胞Ali培养物中进行。在同一供体的ALI培养物中进行了完整的控制和实验条件。从我们的存放处随机选择捐助者。然后将来自同一捐赠者的单个ALI培养物随机分配给对照治疗组。因此，在所有情况下，包括性别，年龄和临床病史在内的协变量都是相同的。没有盲目进行。捐助者的数字在相应的图例中指示。捐助者的性别，年龄和吸烟状况在补充表3中列出。

　　在建立Ali的第28天，将在Transwell滤波器上生长的HAE细胞与20 µL DMEM±100 µM指定的肽（图4A）一起孵育。然后，24小时后，在DPB中的2％多聚甲醛中固定细胞20分钟。然后将细胞用0.2％的皂苷和10％FBS（Thermo Fisher Scientific）在DPB中透化10分钟。将细胞用DPB洗涤两次，并用抗MUC5AC（45M1，MA1-21907，Thermo Fisher Scientific）抗体染色1：100在DPB中稀释，0.2％皂苷和10％FBS在4°C下过夜。随后，将细胞用DPBS洗涤两次，并在室温下在DPB，0.2％皂苷和10％FBS孵育1小时，其中含有Alexafluor-488标记的抗小鼠二级抗体（1：500; Thermo Fisher Scientific）和DAPI（1：5,000）（1：5,000）。使用×40镜头（Leica HC PL Apo CS2 40x1.30油），在倒置的共聚焦显微镜（Leica TCS SP5）上拍摄图像。使用适当的激发和发射设置以顺序模式拍摄蓝色（DAPI），绿色（Alexafluor 488）和红色（CY3）通道的图像。

　　沿基底外侧至顶端细胞轴（Z轴）的图像的串行切片以单个Z段之间的0.28 µm距离获取，以分析细胞内CY3荧光的分布（扩展数据图8）。使用LECIA LAS X软件（Leica）计算所有通道的沿单个细胞中Z轴的荧光强度曲线。简而言之，在每个Z截面下，在单个细胞中分析了DAPI，Alexafluor 488（MUC5AC）和CY3的荧光强度，沿着基底外侧至顶端细胞轴计算。将迹线导出到GraphPad Prism 7以进行图形绘图。为了定量分析细胞内CY3荧光强度，使用Leica Las X软件计算了所有Z段的最大投影，并分析了单个MUC5AC+细胞的平均荧光强度。在两个捐助者的HAE细胞ALI培养物中进行了分析肽摄取的实验，并在两个捐助者的ALI培养物中进行了完整的实验条件。

　　为了结合生物素-sp9 – cy3与细菌毒素的结合，将C2和CRM197结合到链霉亲和素结合。在加入细胞之前，在30°C下以10：1的比例在30°C的10：1比率混合生物素– SP9 – CY3和链霉亲和素偶联的毒素。

　　原点，MATLAB和PRISM用于生成所有曲线和图形。通过不同的蛋白质制剂和囊泡重构进行了融合实验，至少进行了三次，并将特性计算为平均值±S.E.M.两尾学生的t检验用于测试图1和图2的统计显着性。1、3和5和扩展数据图。关于指定参考实验的4、5和7。图4和扩展数据中的统计显着性使用ANOVA进行了评估，然后是HOC Dunnett的测试或两尾学生的t检验，在适当的情况下。

　　框图的定义如下：晶须显示最小值和最大值（不包括异常值），盒子限制显示25％和75％的百分位数，平方点表示平均值，中心线表示中位数。

　　使用Leica Las X v3.1.5.16308，Li-Cor Odyssey FC成像系统v.5.2进行HAE细胞数据收集。T. Ha开发的SMCAMERA程序收集了单维融合实验和单分子计数实验的数据。

　　使用MAC V.16.36，GraphPad Prism v.7和NIH ImageJ V.2.0.0.0.0.0-RC69对HAE细胞实验进行了数据分析。对于小鼠实验，使用了ImagePro-5.1（媒体控制论）。对于单维融合实验，使用了单分子计数实验，荧光各向异性实验和圆形二分法实验，使用OriginPro 8和Matlab-2021b。EMAN2-2.91用于分析扩展数据中的冷冻EM图像图6a。NAMD2 V.2.14B1用于分子动力学模拟。Pymol V.2.5.1用于建模突变和可视化。

　　所有小鼠工作均根据UT MD Anderson Cancer Center IACUC指南进行，并在IACUC监督下进行；协议00001214-RN02。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。