大肠杆菌BL21（DE3）金细胞（Stratagene）用于生长分析，电子断层扫描和蛋白质表达。对于层析成像和生化实验，凹槽是从含有gro剂基因的PBAD33质粒（EL+细胞）26的控制下表达的。为了过表达凹槽和凹槽，使用了含有阿拉伯语启动子控制下的凹槽和凹槽基因的PBAD33质粒48。METK是从先前描述的PET22B质粒表达的26。

　　先前描述了针对凹槽，凹槽，METK和GAPDH的多克隆抗血清，而针对α-乳脂蛋白的兔抗血清是East Acres生物学免疫服务的产物。

　　大肠杆菌细胞在包含的溶酶体肉汤（LB）培养基中生长，具体取决于所使用的质粒，抗生素氨苄青霉素（200μgml-1，PET22B-METK）和氯霉素（32μgml-1，PBAD33变种）。对于凹槽，凹槽和METK（METK细胞）的过度表达，将大肠杆菌BL21（DE3）PBAD33-GROEL：ES PET22B-METK细胞生长到37°C时的早期指数相，并使用PBAD33启动子进行90分钟的浓度诱导groel-Groes表达。（w/v）。在8,000g（4°C持续10分钟）以8,000g离心收获细胞，并将含有抗生素的新鲜LB培养基和1 mM Isropopylβ--thiogalactopypypypyranoside（Iptg）启动4分钟，在40分钟内，将其重新悬浮至0.1-0.2的光密度（600 nm，OD600），为0.1-0.2。通过补充了阿拉伯糖的LB培养基，在37°C下将LB培养基补充为0.1％（W/V），在终浓度为0.1％（w/v）中，在大肠杆菌BL21（DE3）PBAD33-GROEL中诱导了GROEL表达（EL+）。要将大肠杆菌BL21（DE3）细胞暴露于HS中，首先将细胞在37°C下培养至早期指数期，然后在46°C的摇浴中孵育2小时。

　　如上所述培养细胞。在OD600处的光密度测量的时间点上取出等分试样。为了确保指数生长条件，将生长培养物用含有必要的抗生素和阿拉伯糖的预热LB培养基稀释至0.1的OD600，当OD600刚刚超过0.4时。通过将细胞转移到含有1 mM IPTG的METK过表达的无阿拉伯糖培养基中，测量了METK和EL+/METK细胞的生长曲线。第一个样品在更改培养基后5分钟进行。处理数据以在R中拟合。

　　如前所述26,49，表达了凹槽，凹槽和METK蛋白。

　　通过使用程序ProtParam50计算出的吸光度系数，通过使用吸光度系数测量280 nm的吸光度来确定纯化蛋白的浓度。如制造商所述，用Pierce Coomassie Plus（Bradford）测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）确定细胞裂解物的蛋白质浓度。

　　如上所述制备培养物，在进一步加工之前，通过离心和液氮中的细胞颗粒闪光进行收获。如先前所述51，在4°C下制备了球体成体。简而言之，将细胞重悬于100 mM Tris-HCl pH 8.0中，并用2 mL的缓冲液洗涤两次。然后将沉淀重悬于HMK缓冲液（50 mM HEPES-KOH pH 7.2，20 mm乙酸乙酸中毫克，乙酸50毫米K醋酸盐）中，含有20％（w/v）蔗糖和0.25 mg ML-1溶菌酶。然后将细胞在冰上孵育7分钟，然后转移至37°C 10分钟。将所得的悬浮液补充了完全无EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche），并通过添加0.1％（v/v）Triton X-100并随后进行超声处理，从而裂解了球体。

　　通过将二硫代硫醇（DTT）添加到最终浓度为10 mm并加热至56°C 45分钟来减少细胞裂解物。硫醇基团的酰化是通过将氯乙酰胺添加到最终浓度为55 mm，并在黑暗中孵育45分钟，然后在37°C下以1:20的1:20的1:20 w/w比以1:20的含量为1:20的Lys-C（WAKO）进行第一个消化步骤。接下来是在37°C时以1:20（w/w）比的1:20（w/w）比的第二个消化阶段。将三氟乙酸添加到最终体积1％，从而阻止了反应。根据制造商的说明，使用Omix C18（100μL）尖端（Agilent Technologies，编号A57003100）对肽进行脱盐。

　　将脱盐的肽溶解在12 µl的5％甲酸的12 µL中，在超声浴中超声处理，离心并转移至自动进样剂瓶中（水域）。在简单的NLC-1200纳米PLC系统（Thermo）上分析样品，该系统耦合到活性Orbitrap HF质谱仪（Thermo）。将肽分离在拉动剂柱（ID75μm，长度30厘米，尖端开口8μm，新目标）上，装有1.9μmC18颗粒（reprosil-Pur C18-AQ，Maisch，Maisch Dr Maisch），使用任何一个逐步的196个梯度（比较37°C，HS和Metk）或逐步的67分钟，渐变的渐变（比较37°C）。水中的甲酸）和缓冲液B（80％乙腈中的0.2％甲酸）。Nanohplc AutoSampler以900 bar的压力将样品加载到柱上。在分析过程中，高性能液相色谱流速设置为0.25μlmin-1。没有使用陷阱列。以下参数用于比较37°C，HS和METK的生长条件：MS，分辨率60,000（全宽度为Half-Maximim（FWHM）设置）；MS质量范围300–1,650 m/z;MS-AGC设定3×106;MS-Maxit 50毫秒；MS扫描中15个最强烈离子（电荷状态2或更高）的MS/MS碎片；MS/MS分辨率15,000（FWHM设置）；MS/MS-AGC设定105;MS/MS-MAXIT 50毫秒；MS/MS隔离宽度1.8 m/z;碰撞能源设置29（NCE）。用以下参数分析所有其他样本：MS分辨率120,000（FWHM设置）；MS质量范围300–1,650 m/z;MS-AGC设定3×106;MS-MAXIT 100毫秒；MS扫描中十种最强的离子（电荷态2或更高）的MS/MS碎片化；MS/MS分辨率15,000（FWHM设置）；MS/MS-AGC设定105;MS/MS-MAXIT 50毫秒；MS/MS隔离宽度1.2 m/z;碰撞能源设置29（NCE）。

　　使用具有默认设置的Maxquant进行蛋白质识别。Uniprot的大肠杆菌K12应变序列（V.2023-03-01）用作蛋白质鉴定数据库（补充信息）。Maxquant使用指定的Uniprot数据库的诱饵版本来调整蛋白质和肽的错误发现率以下1％。

　　为了在过表达METK的细胞中用结合的METK量化凹槽的分数，我们用凹槽抗体进行了免疫沉淀的凹槽，然后是凹槽和METK免疫印迹和液相色谱 - 潮流质谱法。如上所述，制备细胞并裂解细胞，但加入apyrase（25 u ml -1终浓度）以快速耗尽裂解物中的ATP库并阻止Groel反应周期26。通过在16,000g（4°C持续10分钟）离心阐明裂解液。如制造商所描述的那样，将20μL的非特异性抗体（针对α-乳脂蛋白）或凹槽特异性抗体与100μl重组蛋白A Sepharose 4B珠（Thermo Fisher Scientific）偶联。将珠子加载到样品（180μg蛋白质）中，并在650μl的HMK缓冲液中孵育1小时。用600μL的HMK缓冲液洗涤两次珠，然后用含有0.1％Triton X-100的HMK再洗两次。对于免疫印迹，用制造商规定的5％（v/v）的50μl2×十二烷基硫酸锂（Pierce）进行洗脱。对于液相色谱 - 潮流质谱分析，使用制造商的珠子消化方案使用IST MS样品制备试剂盒（Preomics）进行洗脱和消化。如上所述进行质谱法。

　　在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS -PAGE）分析之前，将细胞重悬于HMK缓冲液中，并补充了2 mM DTT，1 mM EDTA和5％甘油，然后进行超声处理，然后进行中心分解（随后进行中心分解（4°C时为20分钟，16,000G）。使用在150 V处运行缓冲缓冲液（Invitrogen）的Nupage MES SDS的Nupage 10％BIS-TRIS SDS凝胶（Invitrogen）在150 V的Nupage上分离蛋白质样品。将蛋白质转移到绘画缓冲液中的蛋白质（25 mm Tris，192 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm-glycin，20％）中，将蛋白转移到蛋白质中。首先将膜与TBST缓冲液中的原代抗体在4°C下孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗进行化学发光检测一起孵育。源数据文件中提供了未编写的免疫印迹，以扩展数据图3。

　　如上所述生长细胞培养物。为了进行冷冻分析，通过离心在8,000g处离心，指数生长的细胞（大约OD600 0.4）迅速（约2分钟）浓缩至10个od600的10个od600，并随后应用于R 2/1 100个孔碳膜Cu 200 Mesh Grids（Quantifoils）先前已清洗了30 s的Plasma。将样品在力10处将样品印迹9 s，然后在液氮和液氮冷却的混合物中使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）在70％的湿度和22°C冷却。将冷冻网格转移到双光束，冷冻焦点束（FIB）/扫描电子显微镜（Thermo Fisher Scientific; SCIOS，Quanta，aquilos或Aquilos 2）。将细胞用一层无机铂覆盖，如果在使用的系统中可用，然后使用原位气体注入系统（工作距离，10 mm；加热，27°C；时间为8 s）进行有机金属铂的沉积。使用30 kV，0.5 na的镀离离子以20-25°的阶段角度去除散装材料。在11-13°倾斜的情况下进行薄片的细铣削，连续较低的电流在0.3 na至30 pa之间，旨在最终厚度为100-200 nm（参考文献52）。使用串行FIB53制备了选择性凹槽过表达数据集的薄片，并在细制铣削后添加了额外的无机铂层，以避免在图像采集过程中充电54。将所得的薄片转移到配备了能量过滤器（量子K2，Gatan）的TEM（Titan Krios，300 kV，Thermo Fisher Scientific），直接检测摄像头（K2 Summit，Gatan）和层次图以×42,000（×42,000的0.52Å），Defapy的0.2.52Å）的0. / temprogics（K2 Summit，Gatan）和层图中的0.使用SeriaLem 3.9.0（参考文献55）将能量滤波器狭缝设置为20 eV。断层图记录在剂量分级的超分辨率模式下， 每个倾斜序列的总剂量约为120 e-/Å2。从大约10°起的起始角度，使用剂量对称倾斜方案，总范围为±60°，以2–3°的增量为增量，以补偿层状修复（大部分约11°）56。使用MotionCor2（V.1.4.0，https：//emcore.ucsf.edu/ucsf-software）57对齐帧。重建是在IMOD中使用补丁跟踪（V.4.11.1，RRID：SCR_003297，https：//bio3d.colorado.edu.edu/imod/)58使用Tomogram Manager（tomoman）Wrapper脚本59。使用Tomoman实施赠款和Grigorieff暴露过滤器60过滤倾斜系列图像。使用CTFFIND4（参考文献61）估算了散焦。

　　EL+数据集的断层图是在配备Selectris X Energy Filter和Falcon 4 Direct Electron检测器（Thermo Fisher Scientific）的Krios G4上获取的。使用TEM断层扫描5软件（Thermo Fisher Scientific）使用剂量对称倾斜方案收集倾斜系列。从±10°开始的2°步长使用±60°的倾斜跨度，以补偿层状pipletilt。在-2.5 µm至+5 µm的范围内，每个倾斜系列的目标焦点都以0.5 µm的步骤更改为0.5 µm。以Falcon 4的EER模式获取数据，其校准的物理像素大小为3.02Å，总剂量为3e-/Å2/倾斜度为10帧。整个数据收集使用了10 eV缝隙。使用Tomoman59预处理数据。使用Relion的MotionCor2（参考文献62）校正了EER图像。使用CTFFIND4（参考文献61）估算了散焦。使用IMOD使用无机铂的局部沉积物进行重建，该沉积物是通过在铣削作为基金会后溅射而应用的。使用NovactF63重建所有断层图。

　　使用Tomosegmemtv 1.0对大肠杆菌膜进行了分割以进行可视化。

　　为了生成用于原位断层扫描分析的凹槽 - 基因参考，该分析包含折叠状态下定义的底物蛋白，在已知的拓扑结构中，我们使用相同的数据收集策略和参数与上述WT细胞对体外重构的Groel -Groes -Metk复合物成像成像。

　　对于亚图平均，将所有在同一显微镜（37°C，HS，METK）上获取的数据集合在一起并处理在一起。EL+数据集分别处理。总体处理工作流程在扩展数据中描述了图1B。

　　对于模板匹配，对于70S核糖体，用于EL – ES1和5MDZ的EL – ES1和4PKO使用PDB条目1AON，以使用Chimera65中的Molmap64命令以40Å的分辨率生成模板。使用StopGap中实现的噪声相关模板匹配方法确定EL – ES1和EL – ES2复合物和核糖体的一部分的初始位置，通过四倍的binning，像素大小为14.08Å（参考文献66）。随后将数据子集对齐并在StopGap中分类，以生成带有傅立叶壳相关性（FSC）值接近1时40Å模板匹配分辨率接近1的层析成像数据的参考。尝试了与各种groel14物种匹配的模板，但从未产生的groel14平均分辨率优于模板分辨率。所有三个不同结构的数据衍生的参考都用于完整数据集上的额外的模板匹配。通过目视检查产生的命中并与断层图进行比较，分别选择了每个断层图的互相关截止。为了降低假阳性检测水平，首先使用Amira（Thermo Fisher Scientific）创建了细胞胞质的掩模，随后用来过滤细胞质外的命中。在初始阶段，故意将假定的颗粒与低分辨率模板过度挑选，以避免假阴性分配。

　　此过程为EL – ES1参考提供了176,408个初始子图，而EL – ES2参考的初始子图为125,860。然后将它们进一步对齐并分别分类在stopgap中，每个类别都包含El – ES1和El – ES2颗粒的类。EL – ES1参考的出现高分辨率特征（补充图1A）的类中包含的颗粒总数为19,239，而EL – ES2参考的组合为17,614（扩展数据图1和补充图1b）。由于两种参考都拾取了其他颗粒的一个子集，因此将粒子组合在一起，并取出重复。通过无参考的三维分类在Stopgap中分配了所得组合的数据集，从而产生了一组17,598 EL – ES1和11,213 EL – ES2复合物，然后独立地完善。这导致在FSC截止下的分辨率为0.143，在对对称性在11.6Å处应用于EL – ES1复合物（C7对称性），而EL – ES2复合物（D7对称）为11.9Å。如前所述67，使用模拟退火退火随机爬山多次对齐进行分类。所有分类均以250-500个子图的不同随机初始启动集重复进行，以生成初始参考。仅保留所有独立的分类圈的同一类中最终的粒子67。尝试了既定的经线，依赖，M管道的进一步改进，但没有进一步改进。EL – ES1宽和狭窄的复合物通过分类与EL – ES1反式环的顶端结构域上的聚焦，磁盘形面膜进行分类。这导致了6,681个狭窄的复合物，这些复合物被完善至13.5Å的分辨率，而10,130个宽的El – Es1络合物精制到了12.0Å的分辨率。

　　EL+数据集以相同的方式处理，但是从其他数据集的结构开始，低通滤波至40Å，作为模板匹配的初始参考。然后，通过平均该数据集的粒子子集生成的结构重复一次模板匹配。为了改善模型构建的分辨率，将数据集导出到WARP68，并使用Relion v.3.0.8（参考文献69）导出了角度和位置。这产生了groEL14结构，全球分辨率为13Å。将凹槽14-MER颗粒组成，用于与M中的核糖体的几何畸变。将所得的凹槽14-mer颗粒导出以进一步比对和分类。对25个迭代的四个和六类的正则参数t进行分类，而无需角度搜索，从而导致了12,421个粒子的均匀子集。这些颗粒再次在M中固定在M中，以进行几何畸变和每颗颗粒散焦的对比传递函数（CTF）估计，从而导致最终结构，标称分辨率为9.8Å，在0.143 FSC截止下为9.8Å。

　　由于它们的高分子量和密度，核糖体模板匹配可以达到更高的精度和回忆。在StopGap中的初始分类中，由于未检测到虚假阳性颗粒，因此在逐渐较低的Binnings（BIN4，BIN2，BIN1）中首先将所有来自模板匹配的核糖体打击首先对齐。然后，使用Tomoman将所得的颗粒导出为经线。使用翘曲的像素大小为每个像素，对依赖的v.3.0.8重建了子图。在M70中进行了一种迭代方法，并进行了M70中的倾斜序列细化，直到获得金标准FSC的进一步改善为止。这导致了核糖体的最终结构，分辨率为37°C，HS和METK数据集，分辨率为8.6Å，对于EL+数据集的分辨率为6.3Å，分别进行了处理。

　　处理类似于原位数据的Groel-Groes配合物的体外冷冻数据数据，导致EL – ES2模板的初始命中率为39,518个，EL – ES1模板的初始命中率为46,093，两组都具有显着的重叠。然后将它们进一步对齐并在Stopgap中分别分类，分别在重复去除后分别产生5,832和13,688个颗粒。

　　为了分辨出与Groel-Groes腔室中底物蛋白相对应的密度，我们首先在EL – ES2复合物的C2轴周围进行了对称扩展，并将新的Groel-Groes Groes腔与El – Es1复合物的顺式保持一致。然后，使用Topaz的三维预验证函数将所得的腔室的子图降解71。由于最初使用基于Stopgap多相位的对齐方式对腔室内部进行分类的尝试仅通过缺失的楔形物显示，因此将亚图组合成5,000个随机引导程序，每个引导程序每个都包含250个随机子图。然后，这些平均值用于执行两个类别的K-均值聚类。将所得群集的引导程序取平均值，并用作停车位中的多次启动结构。为此，对模拟退火的温度系数为10进行随机爬升，然后进行40个多射线比对的迭代，并在腔室内内部进行两类和一个掩码。这个过程重复了五次。仅将始终分配给同一类的粒子用于最后一轮的亚图平均，导致一个类显示腔室内弱弥漫性密度弱，第二个显示底部附近的强度很强。尝试进一步细分这两个类别仅基于缺失的楔形而产生的分离。由于无法解析底物的C7对称性不匹配和封闭室，因此针对所有不同的生物条件产生了最终平均值，并应用了C7对称性，以增加信噪比。该类显示底部附近的强密度，其中包含12,255个亚图，该图仅显示弱分散密度，共有37°C，HS和METK数据集，其中24,435个子图。

　　类似地处理体外数据。然后，将所得的类再次分为与其底物状态相对应的EL – ES1和EL – ES2复合物，并导出到Warp68。对于所有不同类别和复合物，还进行了另一轮对齐。所有角度都设定了先验。Sigma的Sigma为0.5，搜索角度为0.9°。将所得的颗粒分别精炼成M，以校正几何畸变。再次将颗粒从M70出口，并从EL – ES1的反式环和EL – ES2的相对腔室相关的信号减法导出。基于其先前的分类结果，将精制的信号提取的单室配合物组合成两组，导致7,087个groel-groes腔室，其中包含有序的SP和14,371，其中包含无序的SP或空为空。在所有角度，将所得的腔室再次局部进行了局部完善，并在所有角度上均以Sigma的速度进行了分辨率，对于含有有序的SP和8.8Å的Groel -Groes腔室的分辨率为9.4Å。

　　For generation of substrate-bound GroEL–GroES complexes, 4 μM MetK was denatured in the presence of 1 μM GroEL (14-mer) in buffer A (20 mM MOPS-NaOH pH 7.4, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT) containing 30 mM NaF and 5 mM BeSO4 by first incubation of the mixture at 60 °C for 15 min and then cooling to在热电器（Eppendorf）中25°C。添加2μm的浓度（7-mer）和1 mM ATP（pH 7.0）导致稳定的伴侣蛋白复合物具有包封的METK40。该制剂的生化分析是通过SuperDex 200 3.2/300 GL色谱柱上的尺寸排除色谱法进行的。通过SDS-PAGE电泳（Nupage，BIS-Tris 4–12％凝胶）分析分数，并使用基于强度的绝对量化值估算了Groel-Groes配合物的METK载荷72。为了通过质谱法分析，分别分析了分数F1和F2（扩展数据图5A），但为确定基于强度的绝对定量比的强度而进行了分析。

　　在室温下，使用100 kDa amicon离心浓缩剂（Millipore）将凹槽 - 格罗斯 - METK样品通过超滤浓缩十倍。作为对照，在没有METK的情况下对凹槽和凹槽进行了相同的处理。在冷冻之前，每50μl样品中添加了1μL的N-辛基-β--葡萄吡喃糖苷储备溶液（缓冲液中的87.5 mg ml-1）。为了进行单粒子分析和体外冷冻-ET实验，将4μL样品应用于R 2/1 100孔碳膜Cu 200粒栅格200网格网格（Quantifoil）先前已清洗30 s的血浆。该网格在力4处将3.5 s印迹，并在液态乙烷的混合物中使用液氮冷却丙烷的混合物，并使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）以100％湿度和4°C冷却。

　　使用FEI Titan Krios Translans Electron显微镜和Serialem Software获得EL – ES-METK数据集的冷冻EM数据55。使用K3直接电子检测器（GATAN）以标称放大倍率记录视频帧，总电子剂量约为55个电子，每Å2分布在30帧以上，校准的物理像素大小为1.09Å。在-0.5至-3.0μm的散焦范围内记录了显微照片。

　　使用Focus软件包73进行了冷冻EM显微照片的即时图像处理和CTF细化。仅保留了符合选择标准的显微照片（1.05以下的冰厚度，漂移0.4Å<x <70Å，精制的液化0.5μm<x <5.5μm，估计的CTF分辨率在6Å下）。使用MotionCor2（参考文献57）对齐显微帧，并使用GCTF74确定对齐帧的CTF。

　　相似地获取了没有METK的Groel -Groes配合物的控制数据集，但标称放大倍率为×29,000，导致校准的像素大小为0.84Å。

　　从最终的8,945个凹槽 - 格罗斯 - METK数据集的显微照片中，使用训练有素的Crololo Network75挑选了1,561,482个颗粒，并用Relion v.3.1.3提取（参考文献69）。进行了二维分类的初始回合，其余颗粒被传递到CryoSparc76中，以进行进一步的二维分类，从头算模型构建，对齐和初始的三维分类，以将EL – ES1与EL – ES2复合物分开。然后将剩余的EL – ES2（659,866个颗粒）和El – Es1（294,250个颗粒）复合物分别导出至与施加的对称性，CTF细化和贝叶斯抛光相关。对于EL – ES2复合物，进行了C2轴周围的对称膨胀，并使用Relion的信号减法去除对方的一半。

　　然后将所得的不对称EL – ES1复合物与Cryodrgn77进一步分类，从而导致242,276个颗粒的清洁子集。EL – ES1复合物的反环在冷冻PARC中使用聚焦的面膜在跨环的顶端结构域中分类，从而在狭窄的构型中产生169,454个颗粒，而在广泛的构型中产生了34,755。在将C7对称性应用于标称分辨率为2.9和3.1Å的情况下，将所得的结构在CryoSparc中进行了完善。为了分析顺式室，汇总了所有EL – ES1颗粒，并通过信号减法去除跨环。

　　然后将所得的凹槽结合的单环颗粒（1,562,002个颗粒）对齐与相关的共同参考，并导出至CryoSparc，以进一步排列而没有施加的对称性。将所得的掩码和参考重新插入属性，并用于一个附加的对齐步骤，其目的是将腔室内包含的不对称METK基板对齐（扩展数据图5D）。随后，进行了第二轮信号减法，并将仅包含METK密度的所得颗粒进一步进行三维分类，而无需与依赖有关的角度搜索。所得类的子集显示了不同方向的可见二级结构元素（扩展数据图5D）。然后通过手动旋转将这些类别组合成MATLAB 2015b中的单个参考框架，并在七倍的对称轴周围，相应的倍数为360°/7。这是通过将相应的增量添加到粒子表（.star文件）中的粒子旋转角度来完成的。

　　然后将这些折叠的METK（FMETK）颗粒进一步局部在冷冻Parc中对齐。进行了另外的三维分类，然后进行最后一轮局部比分（322,800个颗粒），导致METK的密度为3.7Å。

　　为了研究METK与Groel-Groes腔室内壁的接触，我们恢复了信号减法，以生成折叠METK和混合室的单环凹槽 - Groel-Metk颗粒，含有无序的METK或空腔室；两者均已完善和对齐在冷冻条件中。含有混合群体的子集在最终比对步骤之间的cryodrgn中也进行了分类，导致groel -Groes -metk络合物的全球分辨率为3.04Å，其中包含折叠METK和2.94Å的配合物，其中包含混合的无序METK或空腔室的混合群体。

　　与没有METK的凹槽 - 格罗人复合物类似地处理，但没有贝叶斯抛光和CTF的细化。信号减法在CryoSparc中进行；使用293,974个颗粒，这导致了一张映射，在应用C7对称性后，全局分辨率为2.5Å。

　　使用Chimerax78,79可视化并渲染密度。

　　模型构建是通过将晶体结构PDB 1SX3（参考文献80），5OPW12和7LOO42的刚体拟合的刚体拟合，将凹槽子域，凹槽和METK拟合，然后使用COOT81手动编辑。随后使用phenix82在真实空间中进行了改进。为了改进来自STA的低分辨率数据的模型，使用了来自参考结构（例如PDB 8p4m）（本研究）的自动产生的约束。在C-beta上截断了缺乏侧链的残留物。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。