独立于连接的融合HD克隆试剂盒（第639648号，Clontech）用于构建新霉素和抗湿霉素的PEF1α-EIRES-NEO和PEF1α-EIRES-HYGRO慢病毒载体，以编码野生型人类FGFR2和FGFR3C，flgfr3C和FGFR3C，FGFR1C慢病毒表达构建体6。先前描述了基于PET-30a的基于PET-30a的细菌表达构建体（残留的Tyr25至Ile251）。FGFR3C（残基ASP142至arg365; FGFR3Cecto）和FGFR4（残基ASP142 to arg365; fgfr4ecto）编码的pHLSEC表达向量（即FGFR3C（残基ASP142至ARG365; FGFR3Cecto）的FGFR3C（残基ASP142; FGFR3Cecto）的pHLSEC表达矢量（d2 – d3区域）。将单位和多个位点突变和截断引入了使用Q5站点定向的诱变试剂盒（New England Biolabs Inc.）的表达构建体中编码野生型蛋白的表达构建体。通过限制酶消化和DNA测序来验证表达构建体。

　　为了产生FGFR1C，3C和4的最小糖基化胞座，N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶I（GNTI-）缺陷HEK293S细胞通过各自的Phlsec表达构建体通过阳离子聚合物聚合物聚合物聚合物（Pei）pei（pei ynoys com），no nocy perionce构建。协议40。然后，转染后24小时，锥虫N1（TN1，目录，19553，Organotechnie）被添加到培养基中以促进蛋白质表达。在第三天，从1 L条件培养基中的分泌的FGFR外生域被捕获在肝素亲和力HITRAP色谱柱上（第17040703号，GE Healthcare），并用20列的盐梯度（0-2 m）洗脱。将含有FGFRECTO蛋白的分数合并，浓缩到5 mL，并应用于SuperDex-75凝胶过滤柱（第289893333号，GE Healthcare）。在25 mM HEPES pH = 7.5缓冲液中，将FGFRECTO蛋白在同位方面洗脱，含有1 M NaCl。野生型和突变的FGF23蛋白在大肠杆菌中以包含体表示，在体外重新折叠，并在建立的方案下使用顺序阳离子交换和SEC纯化为均匀性。6。从HEK293S GNTI-细胞系的条件培养基中纯化分泌的αKlothoecto，稳定地表达了人αKlotho的整个细胞外域（残基Met1至Ser981;αKlothoecto），使用A肝素亲和力hitrap柱进行了Soucre Q Anion Q Anion和Experddex 200列，如以前的SUOMCRE Q ANION HITRAP柱，如前所述。

　　FGF23 – FGFR1C –αklotho– Hs，FGF23 – FGFR3C –αKlotho– Hs或FGF23 – FGF23 – FGFR4 –αKlotho– hs Quaternary络合物通过将FGF23与FGFR ectodopomains，αklothotoecacecachOccarin和HeectarochOccarin和Heecpariin conarion conarion conarion conarion heecparin和heecarion rycarin chariCon conarion recarion heecparin（Heecparin）混合来制备。Ltd）使用1：1：1：1摩尔比。将混合物浓缩到约5 mg ml -1，应用于超级200柱（编号28989335，GE Healthcare），并在25 mM HEPES pH = 7.5缓冲液中含有100 mM NaCl。通过SDS -PAGE分析峰值分数，并直接将含有最高浓度和纯度的顶部级分直接用于网格制备，而无需进一步浓度以避免蛋白质聚集。FGF23 – FGFR1C –αKlotho -HS，FGF23 – FGFR3C –αKlotho -HS和FGF23 – FGFR4 -αKlotho -HS配合物的最终浓度分别为1.5、2.4和1.5 mg ML -1。

　　为了制备冷冻EM网格，将2–3μl纯化的蛋白质复合物在约1.5–2.5 mg ml-1处施加到发光的排放金网格（Ultraufoil）上。然后，使用标记IV玻璃体（FEI）在100％湿度下将网格在0或1力下的1-2 s印迹，然后浸入液体乙烷之前。FGF23 – FGFR1C –αKlotho -Hs和FGF23 – FGFR4 -αKlotho -HS复合物的显微照片在具有×36,000放大倍率的K2直接电子检测器上（相对于1.096ÅEviles）。对于FGF23 – FGFR1C –αKlotho -HS和FGF23 – FGFR4 -αKlotho -HS，使用的累积剂量为50.37 E-/Å2和53.84 E-/Å2。FGF23 – FGFR3C -αKlotho -HS复合物的显微照片是在配备有K2直接电子检测器和能量滤波器的Titan Krios显微镜上收集的。所使用的放大倍数为×130,000，像素大小为1.048Å，累积剂量为72.44 E –/Å2。Leginon41用于靶向5-100 nm冰厚度的孔，从而为三个Quaternary复合物中的每一个收集10,186、6,409和16,602个显微照片。

　　WARP42用于运动校正和所有三个低温EM数据集的对比度传输函数估计。总体分辨率差于5.5Å的显微照片被排除在外。所使用的显微照片的最终数分别为9,501、5,164和15,049，每个复合物的最终数量分别为100万个颗粒。然后将粒子堆栈进口到CryoSparc43，以进行二维分类，具有三个或四个模型的Ab-Initio重建和三维分类。最后，1,497,967（FGF23 – FGFR1C –αklotho– Hs），291,540（FGF23 – FGFR3C –αKlotho– Hs）和856,877和856,877（FGF23 – FGF23 – FGFFFR4 –αklotho– Hs）的颗粒量共同用于HESERENES CODIND CODENTINCENT ConNECENTING CANENISCENISCENION CAN HORSERIONS CAN HORSERISION CAN HORSERIONS CACCENCY CANS HORSERIONS CANS CANS CANS CANS CAN HORSERION CACNESCENCT分别为2.74、3.20和3.03Å分辨率。使用Chimera44手动将FGF23 – FGFR1C-αKlothoX射线结构（PDB：5W21）的组件/域手动扩展到冷冻EM密度图中，并精制了刚体。然后在COOT45中调整初始模型，并在Phenix46中进行真正的空间完善。在扩展数据表1中显示了细化和模型统计数据。代表性的低温EM图像，二维类平均和每个第四纪复合物的三维图显示在扩展数据中。

　　FGF23 – FGFR1C –αKlotho-HS第四纪复合物的冷冻EM结构在16×16×16 nm3的水箱中溶解。CHARMM-GUI服务器用于生成配置，拓扑47,48,49,50和使用Charmm 36M力field51的参数文件。除蛋白质分子外，模拟系统还包括约138,073个水分子，393个钠和393个氯离子（模仿蛋白质缓冲液中存在的150 mM NaCl），总共有439,298原子。使用GROMACS 2021（参考文献52）在303 K时使用2 fs的时间步长使用Gromacs 2021（参考文献52）生成300 NS全原子MD模拟轨迹。在模拟过程中使用了立方周期性边界条件，并将范德华相互作用从1 nm关闭至1.2 nm。使用粒子网埃瓦尔德（PME）方法计算远程静电相互作用。使用最陡的下降算法进行能量最小化，然后使用0.4 ns恒定颗粒数，体积和温度（NVT）和20 ns恒定的颗粒数，压力和温度（NPT）平衡模拟，逐渐从1000 kj mol -1 nm -2 nm -2 nm -kj mol -1 nm -nm -nm -nm -kj摩尔降低力来限制力，并为400 kj mol -1 nv阶段（用于40 kJ mol -1 nm -2（对于NPT阶段）。在平衡步骤的结论结束时，除去所有力限制，并在NPT集合中进行了MD模拟。

　　HEK293T细胞（通过显微镜下的形态检查验证，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）中的支原体阴性用于慢病毒载体包装和高递延病毒颗粒的产生。L6成肌细胞系（编号GNR 4，全国认证细胞培养物的集合）用作稳定表达全长（跨膜）人FGFR1C，FGFR2C，FGFR3C，FGFR3C，FGFR4及其突变体的宿主。L6细胞内源表达HSPG，但没有FGFR和αKlothocolecector，因此自然对FGF23无反应。然而，通过可溶性fgfrs和αklotho或外源补充的异位共表达，这些细胞可以对FGF23刺激做出反应。因此，L6细胞是在生理环境中对FGF23信号进行重构研究的极好宿主。HEK293T和L6细胞均在Dulbecco修改后的Eagle培养基（DMEM，NO.C11995500BT，GIBCO）中，并补充了10％胎牛血清（FBS，No。FSD500，Exccem Biio），100 U ml -Ml -1 c100 u ml -1 canicirin和100μgml -ml -ml -s prospryciio（solbyciio）（solbycin）（solbycin）（solbycin）（solbycin）（solbycin）。使用公开的方案33进行了HEK293T细胞中重组慢病毒颗粒的病毒包装和生成。为了稳定地表达单个野生型或突变的FGFR细胞系，将2×105 L6细胞铺在六孔细胞培养皿中，并在存在多脑烯时被FGFR的慢病毒颗粒感染（5μgml-1;no。SC-134220，Santa Cruz Biotechnology）。使用G418（0.5 mg ML-1，NO。HY-17561，Medchemexpress）或湿霉素（8μgml-1，No。Hy-B0490，MedchemExpress）选择稳定的转染剂。对于共同表达细胞系的FGFR1C+αKlothotm，稳定表达FGFR1CWT（对G418的抗性）的L6细胞被编码野生型或突变的跨膜型或突变的跨膜型αKlotho（αKlothotm）（αKlothotm）和no-sy-hymongrys no soples的慢病毒颗粒（抗突变的跨膜型或突变的）noscincincincin（αklothotm）选择。HY-B0490，Medchemexpress）。

　　为了进行细胞刺激研究，将父母和稳定转染的L6细胞以每孔为1×105细胞的密度在12孔细胞培养板中播种，并保持24小时。第二天，将细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗3次，然后血清饥饿12小时，并与FGF23WT和αKlothoecto共刺激5、10、20、20和40分钟。对于单个时间点刺激，5分钟后收获样品。

　　刺激后，将细胞裂解，总裂解物样品通过蛋白质印迹分析，如前所述33。The following antibodies were used: phosphorylated FGFR (1:1000, no. 3471S, Cell Signaling Technology), phosphorylated FRS2α (1:1000, no. 3864S, Cell Signaling Technology), phosphorylated PLCγ1 (1:1000, no. 2821S, Cell Signaling Technology), phosphorylated ERK1/2 (1:1000, no. 4370S,细胞信号传导技术），α-微管蛋白（1：20000，第66031-1-1-ig，proteIntech），总fgfr1（1：1000，第9740号，第9740秒，单元信号技术），总fgfr2（1：1000，no。23328S，Cell Signaling Technology），Total-FGFR3（总计FGFR3）（1：1：1：1：1：1000，ab133444444444444444444444444444444444444444444444444444444444. AB 1：1 000，AB144444444444444444444444444444444444444444444444444444。（1：1000，编号8562，细胞信号技术），HRP共轭山羊抗小鼠IgG（H+L）（1：5000，NO。SA00001-1，ProteIntech），HRP共轭山羊抗兔IgG（H+L）（H+L）（H+L）（H+L）（1：5000，No。Sa0000001001-2，ProteeIntech，ProteeTech）。使用Chemidoc XRS+系统（Bio-Rad）或Amersham ImageQuant 800（GE），使用增强的化学发光试剂（NO。P10300，NCM Biotech Laboratories）开发印迹。

　　内糖苷酶H（内生H）敏感性用于分析外生域突变对FGFR糖基化/成熟的潜在影响，从而运输到细胞表面。在免疫印迹中，野生型FGFR迁移为主要弥漫性鞋面和较小的锋利下部带的双重曲线。上带代表了完全糖基化的成熟FGFR，该FGFR装饰有通过ER质量控制的复杂糖，并已成功地运输到细胞表面。另一方面，更快的迁移下带是一种未完全处理的高甘露糖形式，被困在ER中。影响受体成熟的突变体现在更快的迁移型ER居民带的比例增加中。富含甘露糖的形式对hendo h敏感，该h骨在直接靠近天冬酰胺残基的两个N-乙酰葡萄糖（GlcNAC）亚基之间切割键。然而，完全糖基化的细胞表面驻留条带对hendH具有抗性。因此，FGFR的细胞表面丰度可以表示为与总受体表达相对于总受体表达的比率，这是通过使用PNGase f处理受体的总受体表达的。因此，将FGFR从其所有N连接糖中完全剥离。因此，将WT或突变的FGFR细胞系在NP-40裂解缓冲液（Biotime，No。P0013F，补充1 mM PMSF）中裂解15分钟，在4°C下。首先，将20μg总蛋白（通过BCA测定定量）在100°C下糖蛋白定性缓冲液变性10分钟，然后用500单位的Endo H（New England Biolabs，No。P0702S）或肽-N-糖苷酶F（PNGase f（pngase f）（pngase f）（pngase f）（新英国人）（NO NOW GIOLLAND BIOLSERS）（NO NOW ENGERERS）（NO NOW ENGERERS），PRESSERS（NO）。指示。如上所述，用FGFR同工型特异性抗体对ENDO H-和PNGASE F处理的样品进行免疫印迹。

　　SEC纯化的FGF23 – FGFR1C-αKlotho-HS第四纪复合物的分子质量是通过建立协议后的多角度光散射确定的。在实验之前，通过系统至少60 ml脱气的跑步缓冲液（25 mM HEPES pH 7.5）通过系统，以平衡色谱柱并为光散射和折射率检测器建立稳定的基准。然后，将50μl纯化的FGF23 – FGFR1C-αKlotho-HS Quaternary络合物（1.5 mg ml-1）注入超级dex 200 10/300 GL柱，并在280 nm吸收率下连续监测洗脱液，并在280 nm的吸收率，激光光散射和屈光度index insex ins a Flof速率下于0.5 ml n.5 ml min n.5 ml min n.5 ml min-n n.5 ml min-n min n.5 ml min-n n.5 ml min n.5 ml min。作为对照，在相同的条件下分析了50μl纯化的FGF23 – FGFR-αklotho三元复合物（1.5 mg ML-1）样品。实验是在环境温度下进行的。激光光散射强度和洗脱液折射率值用于得出由Astra软件（Wyatt Technology Corp.）实现的分子质量。

　　将细胞播种到显微镜盖玻璃（NO。WHB-12-CS-LC，WHB）中，将12孔细胞培养皿放在每孔1×105个细胞中，并允许粘附24小时。第二天，将细胞用PBS洗涤3次，血清饥饿12小时。用FGF23WT和αKlothoecto共刺激20分钟后，将细胞用PBS洗涤3次，并在PLA之前用4％多聚甲醛固定30分钟。按照制造商的说明（编号92101，Sigma-Aldrich），使用Duolink PLA套件进行PLA反应，并通过荧光显微镜进行可视化。简而言之，用阻塞溶液在37°C处理60分钟，用洗涤缓冲液A冲洗3次，然后在4°C下孵育过夜，用两种不同物种在两个不同的物种中升起的两种不同的主要抗体，每种fgfr 1（fgfr1）（fgfr1（1:20，1:20，no。pa5-25979，no。pa5-25979，no.aby frof abbit，ab8 ab8 ab8 ab8 ab8 ab8），1。fgfr。鼠标，fgfr2（1：100，第23328秒，第23328秒，细胞信号技术），FGFR2，FGFR2（1:50，no。Sc-6930，Santa Cruz Biotechnology），鼠标，FGFR3，FGFR3（1：100，no。MA5-32620，thermofisher，thermofisher，thermofisher），FGFR3，fgfr3，biot frof 3（fgfr3，biot frof bibit，biot of Meove of Meove no.scantan crous cruz crous no。FGFR4（1：100，No。8562s，兔子信号技术），FGFR4（1：100，no。Sc-136988，Santa Cruz Biotechnology）。经过三个带有洗涤缓冲液A的冲洗后，将载玻片与寡链的二级抗体（Duolink抗小鼠负和抗兔子Plus）一起在37°C下孵育1小时。再次用洗涤缓冲液A再次冲洗载玻片，并在37°C下浸入连接酶溶液中30分钟，以形成圆形DNA，然后在37°C下与聚合酶溶液一起孵育100分钟，以在黑暗的房间内放大圆圈。用洗涤缓冲液B将载玻片冲洗两次，每人10分钟，然后用缓冲液B稀释1分钟冲洗1分钟。用于成像分析， 载玻片用盖玻片覆盖，使用含有DAPI的Duolink PLA安装介质最少。使用共聚焦激光扫描显微镜（C2SI，Nikon）检查载玻片。

　　所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.0进行。为了对免疫印迹数据进行统计分析，使用了三个独立实验的光密度测量值（使用ImageJ确定）。为了对PLA数据进行统计分析，从两个生物学独立实验的六个随机选择的显微镜字段中使用了许多荧光点和细胞（手动计数）。图1和PLA数据的处理。使用双向方差分析完成2C，D，3B-D和4B，C，其次是Tukey。单向方差分析，然后使用Tukey处理扩展数据中的蛋白质印迹数据。将蛋白质纯化重复至少八倍，产生具有可比纯度/数量的样品。蛋白质印迹实验在生物学三份中进行，结果相似。PLA分析至少重复两次，并产生类似的结果。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。