使用Nebuilder HIFI DNA组件克隆试剂盒（New England Biolabs，E5520S）和KLD酶混合物（新英格兰Biolabs，M0554S）生成含有圆形盒的质粒。纯化的，高倒数的重组腺病毒编码CRE（ADCRE）购自Viraquest（VQ-AD-CMV-CRE；每毫升1×1012个颗粒；目录No。091317）和爱荷华大学（Ad5Cagcre; ad5cagcre; vvc-u of iowa; of iowaa-o of iowaa-81193 ,, a dcagcre；pbabe-puro和pbabe-puro-hrasg12v质粒是从addgene获得的。为了产生逆转录病毒，将HEK-293T细胞接种在高葡萄糖Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中，该培养基（DMEM）补充了10％热灭活的胎儿牛血清（FBS），而没有抗生素在100 mM Petri菜肴中。第二天，将约60–70％汇合的细胞用携带HRASG12V cDNA或对照载体的20 µg逆转录病毒载体转染，5 µg包装质粒和1 µg的包膜质粒。24小时后，用抗生素代替培养基。将细胞在24和48 h时连续两次含有逆转录病毒颗粒的培养基中孵育48小时。使用0.45 µM过滤器单元过滤24和48小时的培养基，并用于转导MEF细胞。进行逆转录病毒感染，并用补充聚甲烯的病毒上清液（0.2 µl ml-1; Millipore Sigma，TR-1003G）孵育细胞。

　　HCT116细胞的培养基（ATCC，CCL-247）是McCoy修改的5A培养基（Thermo Fisher Scientific，CatalogNo。16600108），补充了10％热灭活FBS（Sigma-Aldrich，F2442），青霉素 - 抗霉素 - 抗霉素 - 100 U L-1; ecatalibods catals catals catals catals，egemini biio-prods，sigma-aldrich，f2442）。为了选择用圆形盒式盒式设计的靶向细胞，使用了以下抗生素：紫霉素（2μgml-1; Sigma-Aldrich，p9620），Hygromycin B（200μgml-1; Thermo Fisher Scientific，Catalog Scientific，CatalogNo。10687010）。在高葡萄糖DMEM（4.5 g l-1; Thermo Fisher Scientific，CatalogNo。11995065）中培养用于病毒载体生产的HEK-293T细胞，其热灭活FBS，-Glutamine，-glutamine（2 mm）和青霉素 - 链霉菌素（100 U L-1）。

　　从E13.5小鼠胚胎中分离出具有不同基因型的MEF，并在补充了10％热灭活FBS的高葡萄糖DMEM中传播 - 谷氨酰胺（2 mM）和青霉素 - 链霉素（100 U L-1）。

　　按照Ahmed等人描述的方案进行分离和培养ANSC。44。隔离后，将ANSC保持为神经球，然后允许在神经群干细胞培养基中附着在粘贴蛋白涂层（Sigma-Aldrich，L2020）的菜肴中，并具有神经chiocult增殖补充剂（小鼠＆RAT）（干细胞）（干细胞），CatalogNo。05702），20 ng ml-ng ml −1 egf（cattalog no.05702），catte noy 3 noyl cat Catchel（cattalog no.05702）。10 ng mL -1 BFGF（干细胞技术，目录编号78003）和2μgml -1肝素（干细胞技术，07980）。

　　从5天大的小鼠的小脑中分离出小脑干细胞。使用木瓜蛋白酶解离系统（Worthington，LK003150）消化小脑以获得单细胞悬浮液。将细胞洗涤并悬浮在流量缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，补充了2％热灭活的FBS（Sigma-Aldrich，F2442），2 mM EDTA和25 mM HEPES（Thermo Scientific，Catalog No.15630080）），并通过40 µM Cellerer。将细胞染色以染色，并分类。允许小脑干细胞（促脑蛋白-1阳性，谱系阴性）与神经植物干细胞培养基相连（Sigma-Aldrich，L2020），并具有神经肺增殖补充剂（小鼠＆Rat）（小鼠和大鼠）（干细胞技术，分解为05702），茎20 n egff（cat catiove no.05702），20 n egff（cain.05702 egffff）78006），10 ng mL -1 BFGF（干细胞技术，目录编号78003）和2μgml -1肝素（干细胞技术，目录编号为07980）。

　　从成年小鼠的肝脏中分离出原发性肝细胞。安乐死之后，将肝脏迅速灌注PBS，切成小块，并在3.42 mg ml-1散布酶II（Roche，目录号04942078001）和1 mg ml-1胶原酶IV（Sigma-Aldrich，C5138）中消化。通过在200G处离心分离肝细胞分数，并将其镀在胶原蛋白涂层的板上。Culture media for hepatocytes consisted of William’s E media (Gibco, A1217601) with supplements: 10% heat-inactivated FBS (Sigma-Aldrich, F2442), 10 mM nicotinamide, 2 mM glu​​tamine, 0.1 mM dexamethasone, 1× ITS+ (Gibco, catalogue no. 41-400-045), 0.2 mM抗坏血酸，20 mm HEPE（Thermo Scientific，目录No。15630080），1 mm丙酮酸钠，14毫米葡萄糖（Gibco，A2494001），青霉素 - 链霉素（100 U L -1）。随后通过AD-TBG-CRE感染（Addgene，107787-AAV8）将肝细胞永生化。

　　所有细胞对支原体污染均为阴性。将细胞保持在37°C下的加湿的5％二氧化碳气氛中。

　　对于体内肿瘤的形成测定，将裸鼠注入了40万-1,000,000pbabe-puro-hrasg12v，从而转导了指定的基因型的MEF。每2-3天对小鼠进行一次监测，并在肿瘤体积达到2 cc时进行安乐死。

　　ATAC-SEQ库是由纪念Sloan Kettering Cancer Center（MSKCC）基因组核心产生和测序的。使用Bowtie2将来自ATAC-SEQ和WGS的FASTQ文件与鼠标基因组（MM10）对齐。然后，将CNVKIT（V.0.9.10）应用于WGS BAM文件，以识别副本编号变化和ECDNA扩增子区域。为了比较eCDNA扩增子和相应的染色体区域之间的ATAC-SEQ信号，使用DeepTools中的BAMCOVERAGE（v.3.5.3）用于计算具有10 kb bin尺寸的读数，Mac（v.3.0.0.0b1）用于峰值调用。通过段长度（10 kb），测序深度和拷贝数将读数计数和峰数归一化。

　　直接从ATCC获得HCT116细胞（ATCC，CCL-247）。CAS9蛋白，CRRNNA（CRRNA）和反式激活CRRNA（tracrrna）是从集成的DNA技术中购买的，并根据制造商的指示通过孵育预培养。

　　两个圆形盒依次引入。使用含有80个核苷酸5'同源序列的引物对供体盒进行扩增。然后，将100-500 ng的凝胶纯化的PCR产物转染到前一天，使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher，L3000008）将前一天镀入的500,000 HCT116细胞。两个小时后，按照制造商的说明，使用Lipofectamine CRISPR-MAX（Thermo Fisher，CMAX00008）引入了预组装的CAS9-CRRNA-TRACRRNA。转染后48小时，用嘌呤霉素（5'Cassette，2 µg ML -1）或湿霉素（3'Cassette，200 µg ML -1）进行选择。分离存活的克隆并通过PCR筛选，然后进行Sanger测序以检测正确的靶向。

　　所有动物实验均由MSKCC机构动物护理和使用委员会批准。为了生成MyCec（Jax菌株：039221）和MDM2EC（JAX菌株：039222）在C57BL/6J背景中产生小鼠菌株，使用CRRNAS实验中的MSKCC小鼠遗传学在小鼠嵌入式启用小鼠中，基于已发表的协议进行了基于已发行的协议的Zygote电穿孔。简而言之，将多个放置在电极室内的合子一次进行电穿孔。每种电穿孔混合物都包含5'（agatgcgcagaaaagtgg）和3'（atcatgagtgagtgagttcactc）断裂点靶向CRRNA（25ngμl -1），S.P.Cas9 V3蛋白（100ngμl-1; idt）和在0.1％聚乙烯基醇的溶液中，具有159 bp的两个单链寡脱氧核苷酸（200ngμl-1）。在37°C的KSOM培养基和5％CO2的KSOM培养基中培养电穿孔的合子，直到两个细胞阶段。之后，在阴道塞当天，它们被转移到伪孕妇的卵形上。对由合子产生的N0动物进行了基因分型和Sanger测序，以确认插入两个LOXP位点。将双靶向的N0小鼠与C57BL/6J野生型小鼠配对以产生mycec/+ F1后代。补充表4列出了基因分型的引物。还如上所述生成了MDM2EC小鼠，除了指向RNA用于靶向CHR。10：116711442（tcttacagcatactacggtc tgg）和chr。10：118002454（分别用于5'和3'LOXP插入位点的TTCTGCGATTCGTTATGCGT AGG）。

　　肝肿瘤是通过注射含有25 µg PT3-EF1A-MYC-IRES-LUC和5 µg转座酶编码载体（SB13）的无菌盐水的水动力尾静脉注射（SB13）。简而言之，使用3毫升注射器用26号×5/8英寸针注射了相当于小鼠体重的10％的体积。将雄性和雌性小鼠的混合物用于这些实验。监测小鼠的肿瘤发育，并在人道终点安乐死。CMV-SB13和PT3-loxp-ef1a-myc-ires-luc-loxp是A. Lujambio（西奈山伊坎医学院）的礼物。PT3-EF1A-MYC-IRES-LUC是通过从PT3-LoxP-EF1A-MYC-IRC-IRES-LUC-LOXP中删除LOXP位点而产生的。p53fl（B6.129P2-TRP53TM1BRN/J）（应变：008462）46，artin-cre（B6n.fvb-tmem163tg（actb-cre）2MRT/cjdswJ（atra）/cjdswJ（atrain/cjdswj）（atrain/cjdswj（strai）菌株：021504）47，atoh1-cre（b6.cg-tg（atoH1-cre）1bfri/j; strain; strain：011104）48，alb-cre（b6.cg-speer6-ps1tg（alb-cre）（alb-cre）21mgn/j; strai从杰克逊实验室购买了003556）和巢穴– cre（b6.cg-tg（NES-CRE）1kln/j）50,51小鼠菌株（库存：007850）。

　　将细胞裂解在Laemmli缓冲液中，并补充蛋白酶（完整； Roche，Coedtaf-RO）和磷酸酶（无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒； Roche，Phoss-RO）抑制剂。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并使用标准程序通过蛋白质印迹分析。蛋白质转移后，通过与Licor Intercept（TBS）阻止缓冲液孵育，硝化膜（Bio-Rad，CatalogNo。1704271）被阻断。The following primary antibodies were used: anti-vinculin (1:5,000; Millipore, MAB3574), anti-c-MYC (1:1,000; Cell Signaling, D84C12), anti-MDM2 (1:1000; Cell Signaling, 51541), anti-α-tubulin (1:5000; Cell Signaling, 3873), anti-p53 (1:1000; Leica生物系统，p53-蛋白-CM5）和抗P21（1：1000；细胞信号，64016）。使用了以下二级抗体：IRDYE 800抗兔（Licor，926-32213）和Irdye 680抗小鼠（Licor，926-68072）。使用奥德赛成像系统（LICOR）获取图像。

　　在单细胞悬浮液中收集细胞后，对ECMDM2和INVMDM2 HCT116细胞进行了流式细胞仪分析。将细胞重悬于流动缓冲液中（补充了2％热灭活的FBS（Sigma-Aldrich，F2442），2 mM EDTA和25 mM HEPES（Thermo Scientific，CatalogNo。15630080）），并通过40 µm的细胞过滤器来清除团块。DAPI（Thermo Scientific，D1306）染色用于区分活细胞和死细胞。在LSR Fortessa（BD Biosciences）仪器上进行了流式细胞仪分析。首先根据大小（正向散射，FSC）和密度和/或粒度（侧散射，SSC）进行门控，不包括碎屑和双重。DAPI染色用于将活分数盖上。然后，将多边形或象限门应用于GFP和MSCARLET表达的基础上分离感兴趣的人群。使用FACSARIA（BD Biosciences）和Facsymphony（BD Biosciences）仪器对ECMDM2和INVMDM2 HCT116双阳性细胞进行排序。

　　为了分离小脑干细胞，将细胞与CD133（crominin-1）单克隆抗体（13A4）-FITC（1：100; Thermo Scientific 311-1331-80），CD81 CD81单克隆抗体（1:50）-pe（1:50; thermo scientic，ma-pee，MA51717 1）孵育1小时。Miltenyi Biotec。，130-117-507）和抗PSA-NCAM-PE（Miltenyi Biotec。130-117-394，1：50）。染色后，根据Bocroinin-1阳性和谱系阴性（CD81-; O4-; o4-; psa/nCAM-）表达使用BD FACSARIA III仪器（BD Biosciences）洗涤细胞并分类细胞。补充图1中提供了门控策略，其中包含未编写的凝胶图像。

　　皮下肿瘤和肝脏在10％福尔马林中固定24小时，然后在石蜡嵌入和切片之前至少转移至70％乙醇。在组织清除II（电子显微镜科学，目录NO。64110-04）中将未染色的5μM组织切片分解为脱蜡，并用分级醇补充水中以蒸馏水。使用3％H2O2（MP生物医学，目录No。194057）灭活内源性过氧化物酶活性15分钟。通过使用压力锅中加热抗原透明溶液（基于柠檬酸盐实验室H-3300），将组织载玻片通过加热抗原的检索预处理。将非特异性蛋白质相互作用在10％正常血清中阻塞30分钟。将载玻片在4°C下在以下稀释液中在4°C下孵育过夜：HNF4α（1：500; CST，3113T）;CK19（1：500; ABCAM，AB52625）。Vectastain ABC-HRP兔IgG（Vector Laboratories，PK-6101）用作二抗，并根据制造商的说明孵育。IMMPACT DAB（载体实验室SK-4105）用作底物。血久毒素（载体实验室，H-3401）用作反染色。用Vectamount Express安装介质（Vector Laboratories，H-5700）安装盖板。使用蔡司公理显微镜获得了明亮的图像。C.A.检查了血久毒素和曙红载玻片。和C.S.，经过董事会认证的病理学家，在人类肉瘤和脂肪肉瘤（C.A.）和人肝癌（C.S.）方面具有广泛的专业知识。

　　根据制造商的说明，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，Catalog No.74106）将总RNA分离。用DNase I（Ambion，AM2222）处理后，使用上标IV Firststrand System（Invitrogen，CatalogNo。18091050）将1μg纯化的RNA转录1μg纯化的RNA。对于具有逆转录（RT – QPCR）的QPCR，用Powerup Sybr Green（Applied Biosystems，A25777）和QuantStudio 6 Flex实时PCR系统（Applied Biosystems）分析了RT反应的等分试样。将目标转录水平归一化为指定的参考基因的水平。在至少三个独立的实验中测量了每个基因的表达。

　　在96孔板的每个孔中，总共将1,500个细胞播种，每孔有100 µL的完整培养基。在开始处理之前，允许细胞在孵化器中粘附12小时。制备了20至10,240 nm的Milademetan（Medchemexpress，HY-101266），以及最高治疗剂量的媒介物对照。将剂量添加到相应的井中100 µL，以确保细胞接受米拉德曼剂量的范围为10至5,120 nm。经过72 h的孵育周期后，按照制造商的说明，使用细胞核测定法（Promega，G7570）确定细胞活力。简而言之，将测定试剂添加到井中，并轻轻搅拌板以确保彻底混合。然后根据制造商的指南，使用协同2读取器（Biotek）测量发光信号。

　　使用TAQMAN拷贝数分析评估MYC，MDM2和MDM2基因扩增（探针MM00734221_CN，使用QuantStudio 6 Flex实时PCR系统，使用量子hs02873318_cn和探测器MM00312030_CN进行了探针MM00312030_CN。简而言之，使用TaqPath Proamp Master Mix（Applied Biosystems，A30865）套件并遵循供应商的说明，将基因组DNA放大。Taqman拷贝数参考测定（TFRC，4458367和TERT，4403316）分别用作小鼠和人类基因组的参考。使用DDCT方法计算相对拷贝数变化。

　　通过生物拉德设计和订购了针对CRE介导的圆形和切除CRE介导的圆形化和切除的特异性测定（补充表4）。测试了循环条件，以确保最佳的退火和延长温度，以及正聚和空液滴的最佳分离。优化是通过已知的阳性对照进行的。PICOGREEN定量后，将0.4-9.0 ng的基因组DNA与基因座特异性引物，FAM和HEX标记的探针，BAMHI和数字PCR Supermix结合使用，以进行探针（无DUTP）。所有反应均在QX200数字液滴PCR系统（Bio-Rad，Catalog No。：1864001）上进行，并使用PTGER2作为参考评估每个样品。使用QX200液滴发生器将反应分为每个孔约21,000滴。使用在优化步骤（95°C 10分钟； 94°C 30 s和56°C 1分钟的40循环； 98°C 10 min; 4°C保持）的循环条件下，在96孔热循环仪上运行乳化的PCR。使用Quantasoft软件（Bio-Rad; v.1.7）读取板并分析板，以评估感兴趣的基因，参考基因的液滴数量，或者都不是。

　　通过MSKCC积分基因组核心对配对的RNA库进行了测序。使用Star Aligner52将读数映射到MM10，并使用DESEQ2 R软件包53计算差异基因表达。对于基因集富集分析，基因根据其调节的P值[-LOG10（调整后的P）×符号（Log2（fold Change））]进行排名，并从Hallmark MSIGDB途径数据库中获得基因集。使用FGSEA R软件包计算富集。

　　SWG是由MSKCC的集成基因组操作核心进行的。简而言之，在通过敏捷生物分析仪进行PICOGREEN定量和质量控制之后，使用LE220-POLUS聚焦 - 粉末孔（Covaris，CatalogNo。500560）剪切了100 ng的基因组DNA，并使用KAPA Hyper Prep Kitkit Kit（kapa biosless，kapa bioSyss，kkkyss，kkk850）制备了测序库，并制备测序库。使用Novaseq 6000 S4 Reagent Kit v.1.5（200个循环）（Illumina），在PE100运行中以Novaseq 6000的价格运行样品。通过MSKCC综合基因组核心对配对的基因组DNA文库进行了测序。使用Bowtie2 Aligner54将读数映射到MM10或HG19。为了计算基因组覆盖范围和拷贝数更改，我们使用了带有15 kb箱的QDNASEQ R Package55。使用GVIZ软件包56生成图。

　　我们使用AmpliconSuite-Pipeline（V.0.1555.1，https：//github.com/ampliconsuite/ampliconsuite/ampliconsuite-pipeline）来调用ampliconarchitect57（v.1.3.r5）在使用cnvkit58（v.0.99.99）中生成的副本种子区域的收集，该区域生成的副本种子区域收集。

　　将细胞与Karyomax（目录号15212012; Thermo Fisher Scientific）处理0.05μgml -1（小鼠细胞）或0.1μgml -1时，持续1小时和30分钟（人类细胞）。然后收集单细胞悬浮液，在PBS中洗涤，并在37°C下用75 mM KCL处理10分钟。然后将样品固定在冰冷的3：1甲醇/冰川乙酸（Carnoy's固定剂）中20分钟，然后用Carnoy的固定剂洗涤3次。将固定的细胞滴入加湿室中的载玻片上，并用DAPI对抗（Vector Laboratories，H-1800）。用AX10 Imager.Z1 Zeiss显微镜通过×63物镜镜头获取图像。Zeiss Zen 2.3 Pro软件用于图像采集。斐济（V.2.0.0.0-RC-65/1.15W）用于图像分析以及亮度和对比度调整。斐济的“ Invert Lut”和“ Shadows”后处理命令被顺序应用以更好地可视化ECDNA。

　　使用两色探针在固定细胞上进行DNA鱼。MDM2（绿色DUTP）和CencerRomeric Control（Orange Dutp）鱼类探针购自Empire Genomics（SKU MDM2-CHR12）。含有鼠MYC基因座（RP23-130M7，RP23-342F3 RP23-454G15）的BAC克隆被标记为红色DUTP，RP23-333G9（15QA1）标记为绿色DUTP作为对照。MYC（RP23-307D14-橙色）和丝粒对照（RP23-333G9-GREEN）的鱼类探针也购自Empire Genomics。所有RP23克隆均购自罗斯韦尔公园癌症研究所基因组学共享资源。

　　根据在分子细胞遗传学核心设备上建立的程序进行探针标记，杂交，杂交后洗涤和荧光检测。使用配备了ISIS成像软件（metasystems Group Inc.）或Leica SP5共聚焦显微镜（Leica）的Zeiss Axioplan 2i Epifluesince显微镜（Carl Zeiss显微镜）扫描载玻片。通过×63物镜镜头扫描整个杂交区域，以评估杂交和信号模式的质量。在可能的情况下，排除了凋亡细胞和身体。

　　BAC克隆RP23-428D5（BACPAC）用于检测鼠MDM2基因座，而BAC克隆RP23-309H16用于检测鼠10QA1（CEN10）。接种后，按照制造商的说明，将细菌细胞固定，并使用核对XTRA BAC试剂盒（Takara，CatalogNo。740436）提取BAC DNA。MDM2的探针用染色质层Alexa Fluor 568-5-DUTP（Thermo，C11399）标记，并用制造商的说明，将CEN10探针用染色剂Alexa Fluor 488-5-DUTP（Thermo，C11397）标记为CEN10探针。在杂交之前，将标记的探针用小鼠COT-1 DNA在杂交缓冲液（2×SSC，50％甲酰胺，10％硫酸盐硫酸盐）中进行90分钟，在37°C下持续90分钟。在72°C下进行载玻片杂交2分钟，然后进行37°C过夜。在72°C下以0.4×SSC/0.3％的igepal进行后桥大洗涤2分钟，然后在室温下2×SSC持续5分钟。然后将载玻片短暂冲洗在水中，风干，用DAPI（Thermo，d1306）对抗，并用延长的钻石抗固定式安装（Thermo，p36965）安装。使用配备有Zeiss AxioCam MRM相机和×100油目标的Zeiss Imager在MSKCC分子细胞学核心中获取图像。在分析之前，将DNA鱼的样品嵌入最佳切割温度化合物中，并保存在-80°C下。

　　MDM2 RNA鱼是与MSKCC分子细胞学核心合作进行的。简而言之，将石蜡包裹的组织切片切成5μm，并保持在4°C。将样品加载到Leica Bond Rx自动稳定器中，在60°C下烘烤30分钟，用键露水溶液（Leica，AR9222）脱氧，并用基于EDTA的表位ER2溶液（Leica，AR9640）预处理15分钟，在95°C下进行15分钟。将小鼠MDM2探针（高级细胞诊断（ACD），目录编号447648）在42°C下杂交2小时。小鼠PPIB（ACD，目录No.313918）和DAPB（ACD，目录编号312038）探针分别用作阳性和阴性对照。根据制造商的说明，使用RNASCOPE 2.5 LS试剂套件（ACD，目录号322100）检测到杂交探针，并根据以下修改进行了修改：省略DAB应用，并用荧光CF594/Tyramide（Biotium，Biotium，B40953）替换为20分钟的室温。使用配备有Zeiss AxiooCam MRM相机，×20空气目标和×100油目标的Zeiss成像器获取图像。

　　分别使用成对或不成对学生的两尾t检验和单向方差分析（用于多次比较，Tukey测试），分别比较了两个或更多组，并确定统计显着性（GraphPad Prism 9和R软件）。韦尔奇的纠正措施用于差异不平等的人群。除非另有说明，否则显示了每种条件的平均值和标准偏差。在p <0.05时，差异被认为是显着的。

　　可应要求从相应的作者那里获得材料。本文描述的包含“圆形盒式盒式”的质粒可通过Addgene（质粒＃219563，＃219564，＃219565）获得。MYCEC（应变：039221）和MDM2EC（应变：039222）可以通过JAX存储库（https://www.jax.org/）获得。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。