本研究中使用的所有材料均可应要求提供。

　　可在https://github.com/emc2cube/bioinformatics/sh_rnaseq.sh上获得RNA-Seq对齐和剪接分析的详细管道v2.0.1。从基因表达式综合（GEO）数据库（GSE126543）下载了FASTQ文件。使用Trimmomatic（0.39）（Illuminaclip：Truseq3-pe.fa：2：30：10领先：3落后：3 slidingwindow：4：15 minlen：36），使用FastQ文件中的适配器进行删除。使用FASTQC（v0.11.9）评估所得文件的质量。RNA-seq读数在编码标准选项后使用Star v2.7.3a映射到人（HG38），使用RSEM v1.3.1生成读数，并使用DESEQ2软件包v1.28.140在R V4.0.2中进行差异表达分析。

　　使用Majiq（2.2）和Voila13分析了替代剪接事件。简而言之，Majiq使用以下参数使用：“ Majiq Build -C-Min-Min-Intronic-Cov 1 – Sumimplify”使用以下参数：使用UCSC Transcriptome Notation（第82页）与DE NOVO检测到的Noveed Connctions一起构造转录本的剪接图。在这里，从Novo指的是不在UCSC转录组注释中的连接，但在RNA-Seq数据（ - 米元中-COV 1）中有足够的证据。在基因剪接图中鉴定出不同的局部剪接变异（LSV），而Majiq量化器“ Majiq PSI”估计每个LSV中每个连接的分数，在每个RNA-SEQ样品中表示为（PSI或ψ）中的百分比。通过使用命令“ majiq deltapsi”来计算两个条件之间每个连接处PSI（TDP-43阳性神经元与TDP-43阴性神经元核与TDP-43阴性神经元核与TDP-43阴性神经元核）之间的变化。使用VOILA可视化基因剪接图和PSI和ΔPSI的后验分布。

　　在https://github.com/davidaknowles/leafccutter上，叶刀可作为249fc26的commit 249fc26提供。使用如前所述的RNA-seq读取对齐的读取，读取外显子 - 外观连接和映射，并使用filter_cs.py和默认设置从对齐（BAM）文件中提取每个外显子至少6 nt的映射。使用LeafCutter_Cluster.py中的默认设置进行内含子聚类。使用LeafCutter_DS.R计算了两种条件之间内含子（TDP-43阳性神经核与TDP-43阴性神经元核）之间内含子的差异切除。

　　使用MISO封装中包含的Sashimi_plot函数（Misopy 0.5.4）绘制了沿外显子的RNA-seq密度。在生鱼片图中，内含子被缩放为15倍，外显子缩放为5倍。跨外显子的RNA-Seq读取密度通过样品中映射的读取数量缩放，并以RPKM单位测量。对miso软件包的sashimi_plot目录中的plot_gene.py.py和plot_settings.py进行了轻微的修改，以突出显示RNA-Seq密度图。修改后的Sashimi_plot目录可在（https://github.com/rosaxma/tdp-43-unc13a-2021）上获得。

　　SH-SY5Y（ATCC）细胞在DMEM/F12培养基中生长，并在37°C，5％CO2下补充谷氨酸（Thermo Scientific），10％胎牛血清和10％青霉素 - 链霉菌素。对于SHRNA处理，将细胞在第0天进行铺板，在第2天用shRNA转导，然后在第3天进行介质刷新，并在第6天收集读数（RT – QPCR和免疫印迹）。HEK 293T TDP-43敲除细胞和父母HEK 293T细胞如所述产生。将细胞培养在补充10％胎牛血清的DMEM培养基（GIBCO 10564011）中，1％青霉素 - 链霉素，2 mM-谷氨酰胺（Gemini Biosciences）和1×MEM非肠内氨基酸溶液（Gibco）在37°C，5％Co2处。

　　IPS细胞系来自公共生物库（GM25256-Corriell Institute; NDS00262，NDS00209-NINDS），并在Matrigel（Corning）上的MTESR1介质（Stemcell Technologies）中维持。根据制造商的说明，使用RELESR（Stemcell Technologies）每天喂食IPS细胞每4-7天进行一次分裂。如先前所述41，将IPS细胞分化为运动神经元。简而言之，将IPS细胞解散，并将其放置在超低粘附瓶中（Corning），以在含有DMEMF12/Neurobasal（Thermo Fisher），N2补充剂（Thermo Fisher）和B-27补充-XENO的培养基中形成3D球体。添加小分子以诱导球体的神经元祖细胞模式，（LDN193189，SB-431542，CHIR99021），然后进行运动神经元诱导（带有视乙酸，Smo agonist和Dapt）。After 14 days, neuronal spheroids were dissociated with Papain and DNAse (Worthington Biochemical) and plated on poly--lysine/laminin coated plates in Neurobasal Medium (Thermo Fisher) containing neurotrophic factors (BDNF, GDNF and CNTF; R&D Systems).对于病毒转导，将神经元培养物与含有慢病毒颗粒的Shscramble或SHTDP-43的培养基孵育18小时。通过RFP表达评估了超过90％的感染效率。转导后7天分析了神经元培养物的RNA和蛋白质。

　　shRNA序列起源于广泛的GPP门户（TDP-43：agatcttaagactggtcattc，争夺：gatatcgcttctactagtaag）。在克隆中，合成了互补的寡核苷酸，以产生4-nt悬垂，将其退火并连接到Prsitch（TET诱导U6）或PRSI16（本构型U6）（Cellecta）。连接转化为STBL3化学竞争细胞（Thermo Scientific），并在30°C下生长。使用Maxiprep柱（Promega）进行大规模质粒的产生，纯化质粒用作慢病毒包装的输入，其第二代包装质粒PSPAX2和PMD2.G（Cellecta）用脂肪触摸2000（Invitrogen）在Lenti-X 293T Cell（takara）中转导。转染后48和72小时收集病毒上清液，并使用Lenti-X浓缩剂（Takara）浓缩。通过在相关细胞系中的系列稀释来确定病毒滴度，并通过流式细胞仪读数BFP+细胞百分比，稀释量至少可用于选择进行实验的80％BFP+细胞。

　　在裂解之前，将SH-SY5Y细胞和IPSCS-MN转染和对待如上所述。将细胞在补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Fisher 78429）和磷酸酶抑制剂（Thermo Fisher 78426）的冰冷RIPA缓冲液（Sigma-Aldrich R0278）中裂解。在桌上离心机上以4°C的速度离心15分钟的颗粒裂解物在4°C时，进行了二甲酸（Invitrogen 23225）测定法以确定蛋白质浓度。在LDS样品缓冲液（Invitrogen np0008）中，将每个样品的60μg（SH-SY5Y）和30μg（IPSCS-MNS）蛋白在70°C下于70°C变性10分钟，其中含有2.5％2-丙二醇（Sigma-Aldrich）。These samples were loaded onto 4–12% Bis–Tris gels (Thermo Fisher NP0335BOX) for gel electrophoresis, then transferred onto 0.45-μm nitrocellulose membranes (Bio-Rad 162-0115) at 100 V for 2 h using the wet transfer method (Bio-Rad Mini Trans-Blot Electrophoretic Cell 170-3930).在Odyssey阻止缓冲液（LICOR 927-40010）中封闭膜1小时，然后在室温下在室温下孵育过夜，以阻止缓冲液，其中含有针对UNC13A的抗体（1：500，ProteIntech 55053-1-AP），TDP-43，TDP-43（1：1：1：1：1,000，Abnova H000，Celliant Celliming cellightim Simild2335-M011）技术5174）。随后将膜孵化在含有辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗小鼠IgG（H+L）（1：2,000，Fisher 62-6520）或HRP结合的抗兔IgG（H+L）（H+L）（1：2,000，Life Technologies 31462）中。ECL Prime试剂盒（Invitrogen）用于开发印迹，这些印迹是使用Chemidox XRS+系统（Bio-Rad）成像的。使用斐济对频带的强度进行定量，然后将其标准化为相应的对照。

　　根据制造商的说明，使用Rneasy Micro Kit（Qiagen）提取总RNA，并通过裂解物通过Qiashredder柱（QIAGEN），以最大程度地提高产量。RNA通过Nanodrop（Thermo Scientific）定量，使用75 ng与Superscript IV IV Vilo Master Mix（Thermo Scientific）一起用于cDNA合成。Quantitative PCR was run with 6 ng cDNA input in a 20 µl reaction using PowerTrack SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific) with readout on a QuantStudio 6 Flex using standard cycling parameters (95 °C for 2 min, 40 cycles of 95 °C for 15s and 60 °C for 60 s), followed by standard dissociation (95 °C for 15 s at 1.6 °C s−1, 60 °C在1.6°C s -1，95°C下为60 s，在0.075°C S -1处15 s。用管家基因RPLP0作为对照和相关的shscramble作为参考来计算ΔΔCT。测量的CT值大于40的可视化设置为40。有关引物，请参见补充表6。

　　使用Nebnext Ulta II Q5 Master Mix（新英格兰Biolabs）在100 µL反应中用15 ng cDNA输入进行PCR，并具有以下循环参数：初始变性：98°C 30 s；40循环：98°C 10 s，64°C 30 s，72°C 20 s；最终扩展：72°C持续2分钟。在1.5％的TAE凝胶上可视化所得的产品。有关引物，请参见补充表6。

　　从我们以前的Publication11产生的CRISPRI-I3Neuron IPS细胞（I3N）中获得cDNA，其中TDP-43被下调至约50％。使用SYBR Greener QPCR Supermix（Invitrogen）进行RT -QPCR。样品一式三份运行，RT-QPCR反应在QuantStudio 7 flex实时PCR系统（Applied Biosystems）上运行。使用∆ΔCT方法确定相对定量，并标准化为内源对照RPLP0和GAPDH。我们将野生型UNC13A的相对转录水平归一化为用对照sgrNA处理的神经元的相对转录水平（平均设置为1）。有关引物，请参见补充表6。

　　我们使用了先前建立的诱导神经元（IN）系统，用于将人IPS细胞迅速区分为功能性皮质神经元42。简而言之，使用MTESR1培养基（Stemcell Technologies 85850）对Matrigel（Fisher Scientific CB-40230）上的无馈物条件（Fisher Scientific CB-40230）培养IPS细胞（无疾病突变）。用Tet-On感应系统转导细胞，该系统允许表达转录因子NGN2。在分化的第3天分离细胞，并在含有神经营养因子的神经质培养基（Thermo Fisher）中的含Matrigel涂层的组织培养板上进行了回答，BDNF和GDNF（R＆D系统）具有病毒传递，用于SHSCRAMBLE或SHTDP-43。转导后7天提取RNA和蛋白质。

　　The lentiviral plasmid targeting TARDBP (Millipore-Sigma TRCN0000016038) and Scramble (CAACAAGATGAAGAGCACCAA) were packaged using third generation packaging plasmids (pMDLg/pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G) and transduced with Lipofectamine 3000 (Invitrogen) into HEK 293T cells cultured under standard conditions（DMEM，10％FBS，青霉素 - 链霉素）。在转染后48和72小时收集病毒上清液，并使用Lenti-X浓缩剂（Takara）浓缩1：100。

　　使用Rneasy微型试剂盒（QIAGEN）提取总RNA，并使用高容量的cDNA逆转录试剂盒（Invitrogen）将其反转录到cDNA中。使用标准循环参数在QuantStudio 6 Flex上使用PowerTrack SYBR Green Master Mix（Thermo Scientific）在10 µL反应中使用2 ng cDNA输入进行定量PCR。用RPLP0或GAPDH计算ΔΔCT作为管家基因对照和相关的Shscramble转导条件作为参考；测量的CT值大于40的可视化设置为40。有关检测错误的转录本和正常剪接转录本以及用于内部控制的引物的引物，请参见补充表6。

　　IPSC-MN中的剪接变体是通过从UNC13A外显子19到Exon 21的PCR扩增建立的（UNC13A_19_21 FWD 5'-3'= Caacctctggacaagcgaactg，UNC13A_19_19_21 RVS 5'-3'= GGGGGGGGGGGGGGGGGTGCTGCTCTCTCTCTCTCTAGAAC）。使用向导SV凝胶和PCR清理柱（Promega）纯化产生的产品，并提交为NGS（Amplicon EZ，Genewiz）。使用Trimmomatic（0.39）（Illuminaclip：Truseq3-pe.fa：2：30：10领先：3落后：3 slidingwindow：4：15 minlen：36），使用FastQ文件中的适配器进行删除。然后使用FASTQC（V0.11.9）评估所得文件的质量。然后，使用Star v2.7.3a映射到测序读数后，按照编码标准选项进行映射。然后对唯一映射的读取进行过滤，以使用命令“ Samtools View -B -Q 255”。然后，使用IGV（2.8.0）中的生鱼片图函数生成生鱼片图，最小的接线覆盖范围设置为20。

　　来自FTLD-TDP患者的尸体后脑组织和认知正常对照的个体是从佛罗里达州Mayo诊所脑库中获得的。训练有素的神经病学家和神经病理学家分别在神经和病理检查中独立确定了诊断。所有参与者或授权的家庭成员均给予书面知情同意书，所有协议均由Mayo Clinic Institution审查委员会和道德委员会批准。从先前的研究中获得了从内侧额叶皮层获得的500 ng RNA（RIN≥7.0）获得的互补DNA（cDNA），并从同一样品中匹配PTDP-43数据。按照标准方案，使用SYBR Greener QPCR Supermix（Invitrogen）对所有样本进行了一式三份的SYBR Greener QPCR Supermix（Invitrogen）进行RT -QPCR。RT – QPCR反应在QuantStudio 7 flex实时PCR系统（Applied Biosystems）中运行。使用∆ΔCT方法确定相对定量，并标准化为内源对照RPLP0和GAPDH。我们将相对转录水平归一化为健康对照的水平（平均设置为1）。有关引物，请参见补充表6。

　　NYGC ALS联盟队列生成的RNA-seq数据从NCBI基因表达综合（GEO）数据库（GSE137810，GSE124439，GSE16622和GSE153960）下载。我们使用了1658个可用的和质量控制的样品，分类为所述11。如前所述，在预处理和对齐读取与人（HG38）之后，我们使用RSEM估算了全长UNC13A的表达（v1.3.2）。使用命令“ markduplicates remove_duplicates = true create_index = true”，使用PICARD工具（2.23.0）的MarkDuplicates删除PCR重复项。然后，我们使用命令“ Samtools View -B -Q 255”过滤了唯一映射的读取。读取外显子19- exon 20连接，外显子20 – CE交界处，CE – EXON 21交界处或外显子20 – Exon 21连接使用床托（2.27.1）使用命令“ BedTools Intersect -split”来定量。由于在验尸组织中UNC13A表达的水平相对较低，并且组织的异质性，因此并非所有组织都有足够的可检测到的UNC13A来检测剪接变体。Since UNC13A contains more than 40 exons and RNA-seq coverages of mRNA transcripts are often not uniformly distributed44, we looked at reads spanning the exon 19–exon 20 junction, which is included in both the canonical isoform variant and the splice variant, and there is a strong correlation (Pearson’s r = 0.99) between the numbers of reads mapped to the exon 19–exon 20 junction and the exon20 - Exon 21连接。我们观察到，至少具有跨越外显子20 – CE结或CE -Exon 21连接的样品至少具有UNC13A TPM = 1.55或20次读取外显子19 - 外显子20连接的读数。因此，我们选择了具有TPM≥1.55的1,151个样品，或者至少20个读取映射到Exon 19 – Exon 20连接的样品作为适用于UNC13A剪接变体分析的样品。

　　用于本研究的事后脑组织样品是从加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）神经退行性疾病脑库获得的（补充表4）。补充表4提供人口，临床和神经病理学信息。根据赫尔辛基的宣言，从受试者或其代孕决策者那里获得了大脑捐赠的同意，并遵循加州大学洛杉矶斯F人类研究委员会批准的程序。将大脑新鲜切成1厘米厚的冠状板，并将替代切片固定在10％中性缓冲福尔马林中72小时。从固定的冠状板上解剖内侧额头的块，在分级蔗糖溶液中冷冻保护，冷冻，并切成50 µm厚的切片，如前所述45。如前所述进行临床和神经病理学诊断45。根据临床和神经病理学评估选择受试者。选择的患者的主要临床诊断是对有或没有肌萎缩性侧面硬化症或运动神经元疾病或运动神经元疾病或FTLD-TDP的神经病理学诊断。淀粉样蛋白期> 2，Braak神经原纤维缠结阶段> 4，Cerad神经斑块密度>稀疏，Lewy身体疾病>脑干占主导地位45。

　　为了检测单个RNA分子，使用了一个碱基红色测定试剂盒（美国ACDBIO）。每个受试者的一个50 µm厚的固定冷冻组织截面用于染色。在适当的情况下，在无RNase条件下进行实验。使用了针对感兴趣的转录本的探针，UNC13A，特定于mRNA（外显子20 -Exon 21连接）或包含剪接靶的隐性外显子（外显子20-晶状外显子连接）。还包括阳性（Homo Sapiens PPIB）和阴性（大肠杆菌DAPB）对照探针。原位杂交是基于底层红色测定试剂盒的供应商规范进行的。简而言之，将冷冻的组织切片在PBS中洗涤，并将其放在LED生长光（HTG供应，LED-6B240）腔室下48小时，以淬灭组织自动荧光。将切片迅速冲洗在PBS中，并阻塞内源性过氧化物酶活性。将部分转移到幻灯片上并干燥过夜。将载玻片对目标检索和蛋白酶进行靶标进行，并进行ISH。用TSA Plus-Cy3（Akoya Biosciences）检测到探针，并用TDP-43的抗体进行免疫荧光染色（兔多克隆，ProteIntech，rrid：ab_615042：ab_615042，稀释1：4,0001：500;

　　使用具有63倍油浸入物镜（1.4 Na）的Leica SP8共聚焦显微镜捕获Z-stack图像。对于RNA探针，基于PPIB和DAPB信号在初次采集期间建立了图像捕获设置，并在UNC13A探针和受试者中保持恒定。根据病例之间的染色强度差异，对TDP-43和NEUN图像捕获设置进行了修改。对于每种情况，在皮质层上捕获了6个非重叠的Z-stack图像2-3。使用ImageJ中的“分析粒子”插件对UNC13A隐秘外显子进行RNA点状。简而言之，所有图像均使用相似的参数调整以进行亮度，并将其转换为最大强度z射击，对自动阈值（Intermodes）进行调整，并计数点数（尺寸：6-内，圆形，圆形：0-1）。

　　2020年7月从答案ALS下载了由GATK HaplotypeCaller产生的297名ALS患者的重新校准的VCF文件（https://www.answerals.org）。VCFTools（0.1.16）用于过滤内含子20–21中的位点。使用BCFTOOLS（1.8）合并了过滤后的VCF文件。由于有一些位点包含2个以上的等位基因，因此我们使用命令“ vcftools-geno-chisq – min-cleares 2 – max-max-learteres 8”测试了使用卡方统计数据的基因型独立性。我们发现了另外两个SNP，RS56041637（p <0.0001，rs12608932，p <0.0001，rs12973192）和rs62121687（p <0.0001（p <0.0001，带有rs12608932，p <0.0001，p <0.0001，with rs12973192192）。但是，由于GWAS中包括RS62121687，并且具有0.0186585的P值35，因此我们将其排除在进一步分析之外。

　　根据制造商的说明，使用向导基因组DNA纯化试剂盒（Promega）从人额叶皮质中提取基因组DNA（GDNA）。TAQMAN SNP基因分型测定测定在每个测定的20 ng gDNA上进行，使用由底漆对以及针对每个SNP特定的vic或fam标记的探针组成的商业预混合物（CAT。NO.4351379根据制造商的说明，科学）并在QuantStudio 7 flex实时PCR系统（Applied Biosystems）上运行。PCR程序为60°C，持续30 s，95°C 10分钟，40个循环为95°C 15 s和60°C（rs12973192），或62.5°C 1分钟（RS12608932），以及60°C 30 s。

　　微型构建体是在硅中设计的，由Genscript合成，并通过GFP剪接控制进行了亚键。HEK 293T TDP-43基因敲除细胞和父hek 293T细胞被接种到标准的P12组织培养板中（以每孔为1.6×105个细胞），允许使用LipoFactamine 3000转染（Intect fealorgen）（每孔400 ng）粘附过夜，并用指示的剪接报告基因构建体（400 ng）转染（400 ng）。每个记者都包含一个剪接模块（如图4D所示），该模块是从双向启动子表示的。转染后二十四小时，根据制造商的方案，使用Purelink RNA Mini Kit（Life Technologies）从这些细胞中提取RNA，并采用柱子上的Pureelink DNase（Invitrogen）处理。根据制造商的说明，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Invitrogen）将RNA反转录到cDNA中。使用标准缓冲液（NEB）的onETAQ 2X主混合使用以下循环参数进行PCR：变性：94°C 30 s；30循环：94°C 20 s，54°C 30 s，68°C 30 s;最终扩展：在Mastercycler Pro（Eppendorf）热环体PCR机上进行68°C 5分钟。通过在1.5％TAE凝胶上电泳分离PCR产物，并成像Chemidox XRS+系统（Bio-Rad）。有关引物，请参见补充表6。

　　扩展数据中显示的其他微型构建体是使用位于定位的诱变（新英格兰Biolabs，E0554S）或由Genscript合成的，并通过GFP剪接控制对矢量进行了sub-Clone，从而生成。HEK 293T TDP-43基因敲除细胞和父hek 293T细胞被播种到标准的P12组织培养板中（以每孔5×105个细胞为5×105个细胞），可以使用LipoFofectamine 3000转染（Invitergengengengengenge（400 ng）粘附并用所示的剪接报告基因构建体（400 ng）转染。转染后二十四小时，根据制造商的方案，使用Purelink RNA迷你试剂盒（Life Technologies）从这些细胞中提取RNA，并采用柱状purelink DNase处理。根据制造商的说明，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Invitrogen）将RNA反转录到cDNA中。使用一对检测CE和立即下游MCHERRY外显子的引物测量UNC13A隐秘外显子信号。使用一对检测EGFP的第一和第二外显子的连接的引物测量EGFP的剪接。在EGFP的第二个外显子内映射的一对引物用于测量剪接报告基因构建体的转染效率，并用作归一化器。使用神秘的外显子信号水平或HEK 293T TDP-43敲除细胞中表达参考单倍型携带者作为参考的HEK 293T TDP-43基因敲除细胞计算ΔΔCT。有关引物，请参见补充表6。

　　HEK 293T TDP-43基因敲除细胞和母体（野生型）HEK 293T细胞被接种到标准的p12组织培养板中（每孔5×105个细胞）中，可以在一夜之间粘附并用剪接报告构建体固定并携带构造的剪接报告（400 ng extext extex）；很好）使用Lipofectamine 3000转染试剂（Invitrogen）。转染后二十四小时，根据制造商的方案，使用Purelink RNA迷你试剂盒（Life Technologies）从这些细胞中提取RNA，并采用柱状purelink DNase处理。根据制造商的说明，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Invitrogen）将RNA反转录到cDNA中。使用标准循环参数使用PowerTrack SYBR绿色主混合（Thermo Scientific），使用PowerTrack SYBR Green Master Mix（Thermo Scientific）在10 µL反应中使用8 ng cDNA输入进行定量PCR，并使用标准循环参数在QuantStudio 6 Flex上进行读数。

　　UNC13A隐秘外显子信号是使用一对引物，该引物立即在其下游检测CE的连接和MCHERRY外显子。在EGFP的第二个外显子内映射的一对引物用于测量剪接报告基因构建体的转染效率，并用作归一化器。使用无TDP-43过表达构建体的野生型HEK 293T细胞中的隐性外显子信号水平计算ΔΔCT。有关引物，请参见补充表6。

　　使用一对检测TDP-43的第二外显子的引物测量过表达构建体的表达水平。引物确实检测到内源性TDP-43，但是由于HEK 293T TDP-43基因敲除细胞没有TDP-43表达，如先前所示36，因此使用引物不会干扰敲除细胞中TDP-43构建体的表达水平的测量。使用TDP-43表达水平在HEK 293T TDP-43基因敲除细胞中计算ΔΔCT，其全长TDP-43过表达构建体作为参考。RPLP0和GAPDH用作内部对照。有关引物，请参见补充表6。

　　The pTB UNC13A minigene construct containing the human UNC13A cryptic exon sequence and the nucleotide flanking sequences upstream (50 bp at the of end of intron 19, the entirety of exon 20, and the entirety of intron 20 sequence upstream of the cryptic exon) and downstream (approximately 300-bp intron 20) of the cryptic exon were amplified from human genomic DNA using the下引物后：FWD 5' -3'，grogtcatgcattagtagtgggaagttc和Rvs 5' -3'，cttaCataTaTaAtaAtaAtaAtaActCaaccacacttccatc;并将其亚克隆到PTB载体的NDEI位点。我们以前已经使用类似的方法来研究其他TDP-43 Targetss46的TDP-43剪接调节。

　　在Opti-Mem I减少血清培养基，谷歌补充剂（Gibco）加10％胎牛血清（Sigma）和1％青霉素/链霉菌素（Gibco）中生长HeLa细胞。为了进行双重转染和敲除实验，首先将细胞用1.0 µg的PTB UNC13A微型构建体和1.0 µg以下质粒之一：GFP，GFP-TDP-43或GFP-TDP-43或GFP-TDP-43 5FL构建体，以表达GFP标记的TDP-43 Prote M M M M M MLipofectamine 2000遵循制造商的说明（Invitrogen）。Four hours following transfection, media was replaced with complete media containing siLentfect (Bio-Rad) and siRNA complexes (AllStars Neg. Control siRNA or siRNA against TARDBP 3′ untranslated region, a region not included in the TDP-43 overexpression constructs) (Qiagen) following the manufacturer’s protocol.在收集细胞之前，在6小时时以100 µg ml -1的最终浓度加入环己酰亚胺（Sigma）。然后按照制造商的说明，使用Trizol试剂（Zymo研究）从细胞中提取RNA。使用RNA抑制剂（Applied Biosystems）的高容量cDNA逆转录试剂盒将大约1 µg的RNA转化为cDNA。使用QuantStudio7 flex实时PCR系统（Applied Biosystems），在用SYBR Greener QPCR Supermix（Invitrogen）（Invitrogen）（Invitrogen）（Applied Biosystems）上对RT – QPCR分析进行了。一式三份分析所有样品。RT – QPCR程序如下：50°C 2分钟，95°C持续10分钟，40个循环为95°C，持续15 s和60°C，持续1分钟。对于解离曲线，在程序结束时加入了95°C，60°C的分离阶段15 s，60°C 1分钟和95°C。使用∆ΔCT方法确定相对定量，并标准化为内源对照RPLP0和GAPDH。我们将野生型UNC13A和GFP的相对转录水平标准化为对照siRNA条件的相对转录水平（平均设置为1）。有关引物，请参见补充表6。

　　编码TDP43作为C末端MBP标记的蛋白质（TDP43-MBP – HIS6）的质粒购自Addgene（＃104480）。

　　将野生型TDP-43表达质粒转化为大肠杆菌One Shot BL21 Star（DE3）细胞（Thermofisher）。将转化的大肠杆菌在37°C下生长在1 L的LB培养基中，并补充了0.2％葡萄糖和50μgml -1 Kanamycin，直到600 nm的吸光度达到0.5-0.6。然后将培养物在4°C孵育30-45分钟。用1 mM IPTG诱导TDP-43表达在4°C下诱导16小时。通过离心收集细胞。

　　如所述，纯化了野生型TDP-43 – MBP。简而言之，将细胞颗粒重悬于裂解缓冲液1 M NaCl，20 mM Tris（pH 8.0），10 mM咪唑，10％甘油和2.5 mM 2- cercaptoethanol中，并配有完整的EDTA无蛋白酶抑制剂抑制剂鸡尾酒片（ROCHE），然后通过Sonication裂解。将细胞裂解物在4°C下以31,400克离心1小时，过滤，然后使用XK 50/20柱（Cytiva）用Ni-NTA琼脂糖珠（QIAGEN）纯化，然后在裂解缓冲液中平衡。TDP-43 was recovered via a 0–80% gradient elution using 1 M NaCl, 20 mM TrisHCl (pH 8.0), 10 mM imidazole, 10% glycerol and 2.5 mM 2-mercaptoethanol as the base buffer and 1 M NaCl, 20 mM TrisHCl (pH 8.0), 500 mM imidazole, 10% glycerol, and 2.5 mM2-甲醇作为洗脱缓冲液。使用Amicon Ultra Ultra Ultra离心过滤器，MWCO 50 kDa（Millipore）浓缩洗脱蛋白，对使用26/600 SuperDex 200 PG柱（Cytiva）进行过滤并用尺寸排除色谱进行过滤并进一步纯化，并用300 mm Nacl，20 mm Trishcl（Ph8.0.0.0.0）和1 mmmmmmmmm Nacl，和1 mmmmmmmm nacl均衡。在280 nm处通过吸光度评估的三个峰中的第二个峰中的第二个峰，像以前一样浓缩，等分，在液体N2中冷冻，并在-80 c储存在-80 C中，直到进一步使用。使用在280 nm（纳米体）处的吸光度测定蛋白质浓度，并通过在4–20％SDS -PAGE凝胶上运行样品确定纯度，并用COOMASSIE染色可视化。

　　EMSA用于比较CE的参考和风险等位基因（RS12973192），内含子（RS12608932）和重复序列（RS56041637）的参考和风险等位基因的参考和风险等位基因（RS12973192）（rs56041637）（请参见补充表5）。TDP-43浓度的增加范围从0–4 mm的浓度与恒定的1 nm浓度RNA在缓冲液中（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mm KCl，2 mM MGCL，2 mM MGCL2，100 mMβ-汞含量乙醇，0.1 mg ml-1 bsa），0.1 mg ml-1 bsa），室温为30分钟。RNA是双标记的（CY3和CY5），并在3'端包含18个核苷酸部分双链体。将反应与负载染料混合，并在6％的非降解聚丙烯酰胺凝胶上运行，并在台风扫描仪上使用荧光模式（CY5）成像。使用ImageJ中的分析凝胶插件确定结合级分，并标准化为每车道的总强度。使用GraphPad中的“特定结合与山坡的特定结合”来计算明显的结合亲和力。

　　使用生存期（3.1.12）R套件中的COXPH函数比较了生存曲线，该软件包适合多变量的COX比例危害模型，该模型包含性别，报道了发病时的基因突变和年龄，并进行了分数（日志量）测试。效应大小据报道为危险比。使用COX.ZPH函数测试了比例危害假设。使用suvminer（v.0.4.8）R包中的GGSURVPLOT绘制生存曲线。使用Lmertest R软件包（3.1.3）分析线性混合效应模型。使用R（版本4.0.0）或Prism 8（GraphPad）进行统计分析，这些分析也用于生成图。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。