在5％的二氧化碳大气中，将细胞保持在37°C。HTERT RPE-1细胞（ATCCCat。No。Crl-4000，RRID：CVCL 4388）和HEK 293个细胞（ATCCCat。No。Crl-1573，RRID：CVCL 0045）在Dulbecco修改后的介质（DMEM）F12（dmem）F12（11320-033）中种植了dulbecco的Hhary fital（Hhary fital）（Heally fidal）（HHALHY）（HEHOMAR）BABCO，HEHOMAL（HEHOMAN）BAIR（100 U ML-1青霉素，100 U ML-1链霉素（Gibco的15140-122）。BJ细胞（ATCCCat。No。Crl-4001，RRID：CVCL 6573）和HCT116细胞（ATCCCat。No。Ccl-247，RRID：CVCL 0291）在Dulbecco修改后的培养基中 + glutamax（61965-026）（61965-026）含有10％的fetal Bovine（61965-026）在Dulbecco修改后生长。青霉素，100 U ML-1链霉素（来自Gibco的15140-122）。

　　常规检查所有细胞是否有支原体感染，对支原体感染呈阴性。使用STR认证对本研究中使用的人类细胞系的身份和纯度进行了测试和确认。

　　根据制造商的规程，使用Jet Prime试剂盒（Polyplus Transfection，114-07），用10 µg细胞周期质质质粒（TAGRFP）（从Chromotek）转染RPE-1细胞。24小时后，将500 µg ml -1 G418（来自Sigma Aldrich的4727878001）添加到细胞培养基中，然后选择了表达PCNA染色体的克隆混合群体。

　　为了产生慢病毒颗粒，将HEK 293细胞用4 µg PBOB-EF1-FASTFUCCI-PURO（Addgene 86849） + 4 µg PMD2.G（Addgene 12259） + 4 µg Pspax2（使用Fugene 12260）使用Fugene Trymem（AddGene 12260）（使用Fugene trymem iNFORYENGA REETER），51985034）。将细胞在37°C的5％二氧化碳大气中孵育16小时，然后去除生长培养基并用6 ml新鲜的Optimem取代。第二天，通过通过0.45μm滤光片过滤含有培养基（Sartorius Stedim Biotech 16537）来分离病毒颗粒。然后，将RPE-1或RPE-1 CCNB1AID细胞37与病毒颗粒一起在37°C下在37°C的8μgml-1聚甲烯（Santa Cruz SC-134220）的存在下与病毒颗粒一起孵育24小时。然后使用Sony SH800 FACS（BD FACSDIVA软件8.0.1）收集RPE-1 GFP和RFP阳性细胞。选择了表达FUCCI的RPE-1或RPE-1 CCNB1AID克隆，并从一个单个克隆中建立细胞系。

　　PBOB-EF1-FASTFUCCI-PURO38是K. Brindle和D. Jodrell（Addgene 86849）的礼物。

　　如下所述获得了该细胞系。简而言之，为了产生慢病毒颗粒，将HEK 293细胞用4 µg PSMPUW-IRIS-neo-neo-H2BMRFP（Fachinetti实验室） + 4 µg PMD2.G（Addgene 12259） + 4 µg PSPAX2（Addgene 12260）。然后，使用Sony SH800 FACS（BD FACSDIVA软件版本8.0.1），将RPE-1细胞与病毒颗粒一起孵育，并收集RPE-1 RFP阳性细胞。选择表达RFP-H2B的RPE-1克隆，并从一个单个克隆中建立细胞系。

　　然后，通过将HEK 293细胞用4µg Apple-53bp1trunc（Addgene 69531） + 4 µg PMD2.G（Addgene 12259） + 4 µg Pspax2（Addgene 12260）转染HEK 293细胞（Addgene 69531） + 4 µg PMD2.g（Addgene 12260）来产生新的慢病毒颗粒。将RPE-1 RFP-H2B细胞与病毒颗粒一起孵育，并使用流式细胞仪（Sony SH800 FACS）选择了表达RFP-H2B和GFP-53BP1的RPE-1克隆。细胞系是从一个单个克隆建立的。

　　Apple-53bp1trunc是R. Weissleder39（Addgene）的礼物。

　　如下所述获得了该细胞系。简而言之，为了产生慢病毒颗粒，将HEK 293细胞用4 µg短发夹RNA（SHRNA）p53-Puromycin（Fachinetti实验室） + 4 µg PMD2.G（Addgene 12259） + 4 µg PSPAX2（Addgene 12260）转染。然后，将RPE-1细胞与病毒颗粒孵育。24小时后，将5 µg mL -1紫霉素（来自Gibco的A1113803）添加到细胞培养基中，然后选择了表达p53 shRNA的克隆的混合种群。

　　为了诱导有丝分裂滑移，将细胞与DMSO（来自Sigma Aldrich的D8418）或50 µM monastrol（来自SelleckChem的S8439） + 1 µM MPI-0479605（S7488来自SelleckChem）孵育至少2小时。另外，如所述，诱导RPE CCNB1AID细胞中的CCNB1耗竭。简而言之，用2 µg ml -1强力霉素（来自Sigma Aldrich的D3447） + 3 µM Asunaprevir（来自SelleckChem的S4935）处理细胞。然后，将500 µm的生长素（来自Sigma Aldrich的I5148）添加到细胞培养基中至少4小时。在数字中，除了以下数字外，除了以下图：图2。2i，3a – h，j – o，扩展数据图。2a，b，7a，d，8d – h，9k，其中CCNB1耗竭诱导有丝分裂滑移。

　　为了诱导细胞因子衰竭，将细胞与10 µM染料木黄酮（来自Sigma Aldrich的G6649）孵育至少2小时。或者，将细胞与0.75 µm二氢细胞蛋白D（DCD； D1641中的Sigma-Aldrich）或5 µM Latrunculin（Sigma-Aldrich的L5288）孵育1小时。在数字中，除了以下图外，染料木黄酮治疗诱导了细胞因子衰竭：扩展数据图6J，K，其中DCD处理诱导了细胞因子衰竭，并扩展数据图2C，D。D，d，其中latrunculin治疗诱导细胞因子衰竭。

　　为了诱导内存，将细胞与10 µM SP600125（SelleckChem的S1460）孵育至少2小时。另外，如所述，诱导RPE CCNA2AID细胞中的CCNA2耗竭。简而言之，用2 µg ML -1强力霉素（Sigma Aldrich D3447）处理细胞2小时。然后，将500 µm的生长素（Sigma Aldrich I5148） + 3 µM asunaprevir（SelleckChem S4935）添加到细胞培养基中至少4小时。在这些数字中，除图2600125次外，SP600125治疗诱导了内存。3Q，4C，扩展数据图。2e，f，3f，5d，j，8c，其中通过CCNA2耗竭诱导内弹。

　　用1 µM palbociclib（CDK4/6抑制剂，SelleckChem S1579）或0.5 µm abemaciclib（CDK4/6抑制剂，SelleckChem S5716）或1 µM K03861（CDK2 iMighitor，selleckChemS81100 and Genchem s81100，selleckchem sychem synconronize and Synectrronize and Synectron），用1 µM palbociclib（CDK4/6抑制剂）或0.5 µm（CDK4/6抑制剂）（CDK4/6抑制剂）（selleckchem s5716）和0.5 µm（CDK4/6收集（在数字中以“ G1逮捕”表示）。或者，然后将细胞用PBS洗涤五次，然后在S期中释放10小时，然后收集。为了延长G1持续时间，用160 nm palbociclib或50 nm abemaciclib或400 nm K03861处理16小时并收集（图中的“ G1延长”表示）。或者，然后将细胞在PBS中洗涤5次，然后在S期释放10小时，然后收集。

　　为了抑制DNA复制，在低剂量的蚜虫蛋白（APH，APH，来自Sigma-Aldrich的APH，A0781）的情况下，DNA复制聚合酶抑制剂或PHA767491或PHA767491的DNA复制聚合酶抑制剂或PZ0178（Sigma-Aldrich的PZ0178），A + airpare + ofer'in +'in +'in +'in +'in +pha’分别在数字中）。选择剂量以显着降低EDU掺入而不影响DNA损伤水平。

　　使用1 µM palbociclib在G1中同步，然后以S相释放（请参见“细胞周期同步和DNA复制抑制”），在以下浓度下核苷的存在：DC 7.3 mg L -1（Sigma Aldrich D0776）；DG 8.5 mg l -1（Sigma Aldrich D0901）;DU 7.3 mg L -1（Sigma Aldrich D5412）;Da 8 mg l -1（Sigma Aldrich D8668）和DT 2.4 mg l -1（Sigma Aldrich T1895）（数字中的+）或DC 14.6 mg l -1;DG 17 mg l -1;DU 14,6 mg l -1;Da 16 mg l -1和Dt 4,8 mg l -1（图中的++）。

　　在以下浓度下使用这些药物：生长素（Sigma I5148），500 µm；强力霉素（Sigma D3447），2 µg ml -1;Asunaprevir（SelleckChem S4935），3 µm；monastrol（Selleckchem S8439），50 µm；MPI-0479605（SelleckChem S7488），1 µm;染料木黄酮（Sigma G6649），10 µm；SP600125（SelleckChem S1460），10 µm;Abemaciclib（SelleckChem S5716），50 nm或0.5 µm；K03861（SelleckChem S8100），400 nm或1 µm;palbociclib（SelleckChem S1579），120 nm或1 µm；蚜虫（Sigma A0781），0,4 µm或1 µm；羟基脲（Selleckchem S1896），2毫米；PHA767491（Sigma PZ0178），1 µm;RO3306（Calbiochem 217699），10 µm;Dihydrocytochalasin d（Sigma D1641），0,75 µm;LATRUNCULIN B（Sigma L5288），5 µm;5'-氯-2'-脱氧尿苷（CIDU）（Sigma C6891），100 µm;5'-iodo-2'-脱氧尿苷（IDU）（Sigma I7125），100 µm。

　　在玉米面培养基（0.75％琼脂，3.5％有机小麦粉，5.0％酵母，5.5％糖，2.5％尼帕辛，1.0％青霉素 - 链霉菌素和0.4％丙酸）上饲养苍蝇。将飞汤保持在18°C。十字在塑料小瓶中进行，并保持在25°C。使用平衡器倒染色体来维持库存，以防止重组。这项研究中使用的股票：SQH1,40，Pavarotti RNAi（PAV RNAi）（Bloomington果蝇股票中心BL＃42573）33，UAS-E2F1（Flyorf F001065）和UAS-RB（Bloomington drosophila drosophila Stock Center Center BL＃50746）。

　　在所有实验中，幼虫都均可获得可比的发育阶段。在25°C进行24小时进行鸡蛋收集。在25°C发育后，使用第三龄幼虫进行解剖。

　　将细胞铺在12孔板中的盖板上，并用指定的药物处理。为了标记细胞，使用4％的多聚甲醛（电子显微镜科学15710） + Triton X-100（2000-C的Euromedex 2000-C）在PBS中固定。然后，使用PBS-T（PBS + 0.1％Triton X-100 + 0.02％叠氮化钠）洗涤细胞3次，并在室温下与PBS-T + BSA（Euromedex 04-100-812-C）1％孵育30分钟。用PBS-T + BSA洗涤3次后，将初级和二级抗体分别在PBS-T + BSA中孵育1％，持续1 h和30分钟，分别在室温下孵育。用PBS洗涤2次后，将细胞与3μgml -1 DAPI（Sigma Aldrich D8417）在室温下孵育15分钟。两次用PBS洗涤后，使用1.25％N-丙酸酯（Sigma P3130），75％甘油（Bidistild，99.5％，VWR 24388-295），23.75％H2O安装载玻片。

　　图像是在配备有电动XY阶段和40倍物镜（HCX PL APO 40×/1.40-0.70的hcx PL APO中，来自Leica中的XY阶段的DM6B，Leica Systems，Germany）中获取图像。使用metamorph 7.10.1软件（分子设备）和SCMOS摄像头（Flash 4v2，Hamamatsu）进行采集。在0.5 µm的Z-距离自动收集常规荧光图像（metamorph 7.10.1软件； Molecular Devices，SCR 002368）。图像表示为使用ImageJ软件生成的最大强度投影（SCR 002285）。

　　在PBS中剖析了第三龄幼虫的大脑或唾液腺，并在PBS中的4％多聚甲醛中固定30分钟。在PBST 0.3％（PBS，0.3％Triton X-100（Sigma T9284），每次洗涤10分钟）中洗涤它们3次，并在室温下搅拌几个小时，在4°C下在PBST 0.3％的适当稀释下与原始抗体在4°C下过夜。将组织在PBST中洗涤3次0.3％（每次洗涤10分钟），并在4°C下与二级抗体在PBST中稀释的0.3％孵育过夜。然后将大脑和唾液腺在PBST中洗涤2次，在PBST 0.3％（每次洗涤30分钟）中，冲洗在PBS中，并与3μgml-1 DAPI（4'，4'，6-Diamidino-2-苯基吲哚； Sigma Aldrich D8417）在房间温度下孵育30分钟。然后将大脑和唾液腺在室温下在0.3％的PBST中洗涤30分钟，并安装在安装介质上。用1.25％N-丙酸酯（Sigma P3130），75％甘油（Bidistilled，99.5％，VWR 24388-295），23.75％H2O制备标准安装介质。

　　图像是在旋转磁盘显微镜（Gataca系统）上获取的。基于CSU-W1（Yokogawa），将旋转头安装在配备有电动XY阶段（Nikon）的倒下Eclipse Ti2显微镜上。通过使用SCMOS摄像机（Prime95b，Photometrics）的40×NA 1.3油目标获取图像。使用压电阶段（MAD City Lab）实现了光学分段。Gataca Systems的激光台配备了405、491和561 nm激光二极管，每个二极管每个均可提供150 MW，并通过单个模式光纤耦合到旋转盘头。使用metamorph 7.10.1软件（分子设备）进行多维采集。以1.5 µm的Z距离自动收集常规荧光图像（metamorph 7.10.1软件；分子设备SCR 002368）。图像表示为使用ImageJ软件生成的最大强度投影（SCR 002285）。

　　在以下浓度下使用一抗和继发抗体：豚鼠抗CEP192抗体41（1：500; R.B.实验室），兔抗β蛋白蛋白（1：250; Sigma-Aldrich C2206，Irrid ab 476831），Irrid AB 476831，小鼠抗γH2A.X.XH2A.Xphose phose ab5 ab5 ab5 ab5 ab5 ab5 ab5 ab5 ab5 ab5 ab5 ab5 ab5 ab5; 447150），鼠标抗XRCC1（1：500; ABCAM AB1838，我想要AB 302636），兔子抗Rad51（1：500; ABCAM AB133534，Irrid AB 2722613），鼠标抗Ku80（Mouse Anti-Ku80） Anti-Fancd2（1：150; Novusbio NB100-182SS，我想要AB 1108397），鼠标抗53BP1（1：250; Millipore Mab3802，Irrid AB 2206767），Rabbit Anti-γH2AV（1：500; Rockland600-401-91-91-91-91-91- I AB-γH2AV） 647（1：250; Thermofisher Scientific A22287，我想要AB 2620155），山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附的中学，Alexa Fluor 647（1：250; Thermofisher a21245，我想要AB 25355813），goig+gog iea+gog iea+guin，跨吸附的二抗，Alexa Fluor 488（1：250; Thermofisher A11073，我想要AB 253411），山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉次级抗体，Alexa Fluor 546（1：250; Thermofisher A11003;我想要AB 25334071，gog ant rabit ant ab ab ab ab 2534071，gog r）交叉吸附的二级抗体，Alexa Fluor 546（1：250; Thermo Fisher Scientific A-111035，我想要AB 2534093）。

　　如先前所述33进行了DNA损伤的定量分析。简而言之，使用γH2AV原代抗体和具有γH2AX抗体的3D球体在果蝇中评估DNA损伤，并用Alexa荧光二抗检测。以1.5 µm的间隔以光学切片获得共聚焦体积。使用Fiji和QuintaCell开发的自定义插件进行了图像分析。手动分割细胞核后，使用阈值操作来确定γH2AV或γH2AX阳性像素（覆盖率）及其平均强度的百分比。将覆盖范围和强度乘以获得γH2AV或γH2AX指数。用于检测和量化多倍体神经细胞中γH2AV指数的阈值不会检测到唾液腺中的任何损害。但是，重要的是要提到，在这些细胞的一部分中，γH2AV点（荧光强度很小，荧光强度较小）。

　　对于DNA损伤定量，在培养细胞中获得的信号与果蝇神经细胞中的信号不同。为了在人类细胞中进行DNA损伤，我们使用了由Quantacell开发的基于ImageJ软件的插件，其中γH2AX信号在阈值后使用Z-Proctoction堆栈测量。对于每个核，获得了核大小，DAPI强度，γH2AX灶的数量，γH2AX荧光强度以及γH2AX信号的核覆盖率。

　　将细胞铺在盘子上（来自Dutscher的627870），并用指定的药物处理。图像是在旋转圆盘显微镜（Gataca系统）上获取的。基于CSU-W1（Yokogawa），将旋转头安装在配备有电动XY阶段（Nikon）的倒下Eclipse Ti2显微镜上。通过使用SCMOS摄像机（Prime95b，Photometrics）的40×NA 1.3油目标获取图像。使用压电阶段（MAD City Lab）实现了光学分段。Gataca Systems的激光台配备了405-，491- nm激光二极管，每个二极管每个均可提供150 mW，并通过单个模式光纤耦合到旋转盘头。选择激光功率以获得信号/背景的最佳比率，同时避免光毒性。使用metamorph 7.10.1软件（分子设备）进行多维采集。以0.5 µm的Z-距离自动收集常规荧光图像（metamorph 7.10.1软件；分子设备，RRID SCR 002368）。图像以ImageJ软件（RRID SCR 002285）生成的最大强度投影表示，并从堆栈进行了反转，并扩展了metamorph 7.10.1软件。

　　为了产生球体，在存在DMSO（Sigma Aldrich D8418）的情况下，将每井500个细胞接种到96个超低连接井中（Corning7007）或50 µM monastrol（Selleckchem S8439）和1 µm MPI-0479605（Selleckchem S8439）和1 µm MPI-0479605（Selleckchem SelleckChem）（Selleckchem SelleckChemChemckchem S744888888888）。板以200克旋转3分钟，以允许球形形成，并在37°C下孵育24小时。

　　在PBS中使用4％多聚甲醛（电子显微镜科学15710）固定前，在固定前将球体固定在固定之前，在PBS固定前快速清洗球体。然后，使用Triton X-100（Euromedex 2000-C）在PBS中透化5分钟，并使用阻断缓冲液（PBS + 0.3％Triton X-100 + 0.02％ + 0.02％Azide钠钠 + 3％BSA）进行阻塞30分钟。将聚集体与稀释到阻塞缓冲液过夜的原代抗体一起孵育。使用阻止缓冲液洗涤3次后，将球体与二抗在阻止缓冲液中孵育3小时。然后将细胞在阻塞缓冲液中洗涤几次2小时，并用Everbrite（Biotium）安装在玻璃上。对于原代和二抗，请参见“免疫荧光显微镜和抗体”。

　　使用配备有100×CFI PLAN APO LAMBDA S SIL目标（NA 1.35）的倒扫描激光共焦（Nikon A1RHD25）对球体进行成像。每0.3μm获取Z堆栈。使用细胞，核大小和中心体数来区分二倍体和四倍体细胞。然后，对DNA损伤进行了定量分析（请参阅“ DNA损伤的定量分析”）。

　　根据制造商的说明，使用Click-IT EDU成像套件（Life Technologies C10338）可视化DNA中的EDU掺入到DNA中。对于人类细胞系，在指定的时间以1 µm的浓度（扩展数据图6E，9H）或10 µM（扩展数据图5G，H）使用EDU。将细胞与Click-It反应鸡尾酒孵育15分钟。如前所述，在固定前的脉冲为2小时，在多倍体神经细胞中掺入EDU。

　　根据制造商的说明，使用单细胞凝胶电泳试剂盒（来自Trevigen的4250-050-Es）进行彗星测定。然后使用配备有40×CFI计划荧光目标的倒置Eclipse Ti-E Nikon Videmicroscope对彗星进行成像。使用斐济的OpenComet插件分析图像。基于DMSO处理细胞的彗星DNA含量，使用手动阈值来鉴定四倍体细胞的二倍体。在处理有丝分裂滑移的细胞上使用相同的阈值。

　　将二倍体和四倍体细胞的混合物（请参阅“人类细胞系中的四倍体的诱导”）与2 µg ml -1 Hoescht 33342（Sigma Aldrich 94403）在37°C时在37°C，5％CO2下孵育1 h。然后，生成一个单元悬架。使用PBS洗涤细胞，除去上清液，并将细胞重悬于每毫升1×107细胞的冷细胞培养基中，并在所有实验中保持在4°C。使用Sony SH800 FACS（BD FACSDIVA软件8.0.1）进行荧光激活的细胞分选（FACS）。使用适当的阴性对照样本进行补偿。然后，使用门控工具记录并对实验样品进行分类，以选择感兴趣的人群。首先选择RFP+GFP-细胞（G1细胞）。然后，在该种群中，DNA含量用于隔离二倍体（2N）和四倍体（4N）G1细胞（扩展数据图8D）。一旦确定了门，将相同数量的二倍体和四倍体G1细胞分类为外部收集管。然后使用细胞计数器检查细胞数量，并收集相同数量的二倍体二倍体细胞进行蛋白质印迹分析。同时，进行后分析以确定分类群体的纯度（扩展数据图8E）。

　　通过用ACCUTASE（SIGMA）处理的细胞分离，立即用PBS洗涤，固定在2 ml 70％乙醇中，并在-20°C下储存过夜。然后将它们洗在PBS和染色缓冲液中（BD Pharmingen 554656）。

　　为了进行细胞周期分析，通过将细胞与2 µg ml -1 Hoescht 33342（Sigma Aldrich 94403）在室温下在染色缓冲液中孵育15分钟，从而可视化DNA含量。另外，为了测量RNA水平，将细胞与2 µg ml-1 Hoescht 33342 +吡咯蛋白4 µg mL-1（Santa Cruz SC-203755A）在室温下20分钟中孵育20分钟。通过分析每个条件的10,000个细胞，使用LSRII（BD Biosciences）进行流式细胞仪分析。然后使用FlowJO 10.6.0软件（Tree Star）分析数据。

　　根据制造商的协议，使用0.25 µg PCMVHA E2F1（Addgene 24225）转染RPE-1细胞，并使用Jet Prime Kit（Polyplus Transfection 114-07）转染RPE细胞。五个小时后，将细胞与DMSO（Sigma Aldrich的D8418）或50 µM monastrol（SelleckChem S8439） + 1 µM MPI-0479605（SelleckChem S7488）孵育。2小时后，将DMSO或1 µM palbociclib（Selleckhem S1579）添加到细胞培养基中16小时。然后将细胞固定在G1（T0）中或使用PBS洗涤五次，并在S相中释放，并在10 h（T10）后固定。免疫荧光方案在相应的部分中描述。

　　PCMVHA E2F1是K. Helin42（addgene质粒24225）的礼物。

　　对于全细胞提取物，将细胞在8 m尿素，50 mM Tris HCl，pH 7.5和150mMβ-苯甲醇（Bio-Rad 161-0710）中裂解，在95°C进行超声处理和加热10分钟。对于染色质结合的分数，根据制造商的说明，使用培养细胞的亚细胞蛋白分级试剂盒（Thermofisher Scientific 78840）制备细胞。然后，将样品（相当于2×105个细胞）在Nupage NOVEX 4–12％BIS-Tris Pre-Cast Pre-Cast Pre-Cast Pre-Cast凝胶中进行电泳（Life Technologies NP0321）。为二倍体和四倍体条件加载了相同数量的细胞（请参阅“二倍体和四倍体细胞的FACS排序”），从而使我们能够将一个二倍体细胞与一个四倍体细胞进行比较。将来自凝胶的蛋白质分数电泳转移到PVDF膜（PVDF转移膜； GE Healthcare RPN303F）。在含有5％干非脂肪牛奶和0.5％Tween 20的PBS中饱和1 h饱和后，将膜与含有5％干非脂肪牛奶的PBS稀释的主要抗体孵育1小时。在含有0.5％tween 20的PBS洗涤3个10分钟后，将膜与45分钟固定在45分钟的PBS后，用含量为45分钟2：2.2.2.2.2500抗体。然后将膜用含有0.5％Tween 20的PBS洗涤3次，并根据制造商的规格使用ECL试剂（SuperSignal West pico pico Chemilumeinimeincencect底物； Thermo Scientific 34080）开发反应。

　　使用Image Lab软件版本6.0.1（Bio-Rad Laborators），使用H2B信号（H2B用作DNA含量的读数）计算背景调整的体积强度。所有原始的未编写印迹（凝胶源数据）均在补充图中列出。 1。

　　在以下浓度下使用了初级和二抗。Anti-α-tubulin mouse (1: 5,000; Sigma T9026, I want AB 477593), Mouse Anti-CDC45 (1: 100; Santa Cruz Biotechnology SC-55569, I want AB 831146), anti-PCNA rabbit (1: 500; Santa Cruz SC56, I want AB 628110), Rabbit Anti-actin (1: 2,000; Sigma-Aldrich A5060，我想要AB 476738），鼠标抗H2B（1：1,000; Santa Cruz Biotechnology SC-515808），鼠标抗ORC1（1：100; Santa Cruz Biotechnologic sc-398734），鼠标sc-398734），鼠标抗MCM2）（Mouse Anti-MCM2）（HIST BIOSCENCES（WIND BIB）610707070707; 1：500; 1：500; 1：500; 398024），鼠标抗E2F1（1：2,000; Santa Cruz SC251，我想要AB 627476），鼠标抗CDC6（1：500; Santa Cruz SC-9964，我想要AB 627236），兔子抗CDT1（1：500; celli signal; celli signal; celible; cellign; cellign; cellign;是否; （1：500; Betyl A303-472a，我想要AB 10953949），山羊抗兔IgG（H+L）跨吸附的二抗二抗，HRP（1：2,500; Thermofisher G21234 Immunoresearch 115-035-003，我想要AB 10015289）。

　　将3D视频（请参阅Imaris软件v.9.6.0（Bitplane，RRID SCR 007370）导入到“延时显微镜”）。对于所选的细胞，使用Imaris v.9.6.0的模块“点跟踪”来检测焦点，作为直径为0.5 µm的XY方向的直径斑点，z方向为1 µm（对PSF延长进行建模）。由于焦点的数量在时间上变化，因此使用了“启用生长区域”的选项。在每个视频中，阈值是在最亮的框架上选择的（以检测正确的位置），然后应用于整个视频。对于每个单元，在每个时间点，都记录了斑点和体积的数量。为了确定DNA复制时机，我们量化了细胞核中PCNA荧光强度的信号。这种复制时机的特征是独立于PCNA的任何特定行为。一旦在细胞核中检测到PCNA荧光强度，t = 0（s相位）被定义，并且当未检测到PCNA荧光强度时，定义了最后一个时间点（S相结束）。对于每种情况，研究了至少十个单元格（补充数据1），并使用MATLAB脚本在每个时间点对Imaris v.9.6.0的统计数据进行平均。

　　使用0.75 µM二氢细胞藻蛋白D（DCD，肌动蛋白聚合抑制剂，Sigma-Aldrich D1641）通过细胞因子抑制作用产生四倍体HCT116。之后，将细胞用PBS洗涤3次，并在补充10％FBS和1％青霉素链霉菌素的DMEM中培养20小时。四倍体RPE-1和BJ细胞是通过有丝分裂滑移或内膜上产生的（请参阅“人类细胞系中四倍体的诱导”）。然后，将细胞用PBS洗涤3次，并在补充10％FBS和1％青霉素 - 激霉素的DMEM中培养20小时。对于每种方法，我们确定治疗种群中四倍体细胞的比例约为40-60％。由于治疗群体中存在二倍体细胞，四倍体化对复制叉速度的后果，叉子不对称和IOD很可能被低估了。

　　然后，用0.1 mM CIDU和0.1 mM IDU将二倍体对照和四倍体富集的种群收集30分钟，每个条件收集100,000–300,000个细胞，以进行进一步分析。从细胞中提取DNA，并使用纤维DNA提取试剂盒（基因组视觉）根据制造商的说明进行准备。随后，通过使用光纤分子梳理系统（基因组视觉），将准备的DNA拉伸到涂层玻璃盖玻片上（梳子覆盖，基因组视觉）。使用复制梳理测定（RCA）（基因组视觉）对针对SSDNA，IDU和CLDU进行标记。通过基因组视觉进行了准备的盖板成像，并使用FiberStudio 2.0.1分析软件通过基因组视觉进行了分析。通过测量CLDU和IDU轨道的组合长度来确定复制速度。通过测量叉子（第一个轨道的长度（CLDU）的长度与第二轨（IDU）的长度（IDU）的长度，通过测量CLDU和IDU掺入的对称性来确定叉子不对称。通过测量相同纤维上两个起源之间的距离来确定IOD。

　　在以下浓度下使用抗体。Rabbit anti-ssDNA (1:5; IBL International 18731, RRID AB 494649), rat anti-CldU (1:10; Abcam Ab6326, RRID AB 2313786), mouse anti-IdU (1:10; BD Biosciences 555627, RRID AB 10015222), mouse Alexa Fluor 647 donkey (1:25;Biozol Jim-715-605-151），Rat Alexa Fluor 594 Donkey（1:25; Biozol Jim-712-585-153），Rabbit Brillial Violet 480 Donkey（1:25; Jackson Immuno Research; Jackson Immuno Research 711-685-152，Rrid AB 2651109）。

　　将细胞铺在用50 µg ml-1纤连蛋白涂有覆盖的玻璃底盘上，并冲洗1小时，并以每毫升的浓度为1.5×106个细胞将胰蛋白酶化的细胞铺板。在实际实验前2天，将用于实验的细胞以每毫升0.7×106细胞的浓度播种在T-25培养皿中。在实验当天，将细胞用EDTA（Versene）拆分，并以每毫升的浓度为1.5×106个细胞。为了诱导四倍体，用2 µg ml -1强力霉素（Sigma Aldrich D3447）处理细胞2小时。然后，将500 µm的生长素（Sigma Aldrich I5148） + 3 µM asunaprevir（SelleckChem S4935）添加到细胞培养基中至少4小时。然后每20分钟将细胞成像35小时，以在整个细胞周期中跟踪它们。

　　细胞周期状态由FUCCI系统指示。G1细胞表达CDT1 – RFP，而S/G2细胞表达Geminin -GFP，有丝分裂由核包膜分解，而Geminin通过细胞出现43。为了量化核中Geminin的荧光，首先在图像上进行了背景减法。感兴趣的区域（ROI）用于定义图像中包含背景荧光的区域。然后从所有帧中减去ROI的平均值。随后，将ROI尽可能靠近单元格，然后在所有框架上测量平均灰度值。这有助于确定细胞周期中的出生框架和G1/s转变。

　　参考文献44,45中提供了使用阶段相机进行质量测量的详细协议。在实验期间，每20分钟，每20分钟，每20分钟就可以获取图像。为了获得参考图像，在盘子上获取了32个空场，并计算了中位图像。通过自定义书面MATLAB脚本从干涉图（由Phasics获取的图像）中减去此参考图像，以测量光路差。然后对它们进行处理以计算相位，强度和相处的图像（背景设置为1,000，场裁剪以删除边缘）。使用GridFit方法进行了背景归一化，并使用流域算法将彼此接触的细胞分离。通过整合整个细胞的强度来计算质量。

　　使用1 µM Palbociclib（SelleckChem S1579）在G1中同步二倍体和四倍体RPE RPE-1 CCNB1AID FUCCI细胞，在S阶段中释放了20小时，或在10 µM RO3306（CalbioChem 217699）中释放20小时。然后，使用细胞分类（请参阅“二倍体和四倍体细胞的FACS排序”），将G1和G2/M二倍体和四倍体细胞分离出来，并收集在96孔板中。

　　使用NextSeq 500（Illumina;最多77个周期；单端）进行测序。随后使用特定于样本的条形码对生成的数据进行了反复列表，并使用BCL2FASTQ（Illumina;版本1.8.4）更改为FASTQ文件。随后，使用Bowtie2（版本2.2.4;参考文献46。用Bamutil标记了读数（版本1.0.3;参考文献47），对人类参考基因组（GRCH38/HG38）对齐，对副本读取数据（BAM文件）进行了分析，并与副本编号呼叫algorithm anefinderm aneufinderm aneufinder48（https：//使用DNACOPY和EDIVISIVE拷贝数呼叫宽度箱的校正和黑列表（对照样品中的极低或高覆盖率），使用DNACOPY和EDIVISIVE拷贝数算法（平均bin尺寸= 1 MB;G2/M样品（用于G2/M二倍体的G1二倍体和G1多倍体的G1多倍体）未用作参考。分析了Aneufinder的开发版本（来自Github； 4N和8N样品）。这些样品的地面拼写均在3.5至4.5（4n样本）之间或7.5和8.5之间（8n样本；参数；参数：min.min.forger.forghoidy和Max。8N样品）在两个算法的结果之间，每个bin的染色体副本平均读取（2 some：20读：30次读物：30个读数等）。G2/m相（8n）中的多倍体基因组的000。对BJ样品的分析表明，畸变（波浪状模式）导致错误地称为段的拷贝数，该拷贝数高于预期状态（Euploid）。这些状态的读数计数（读数）的均值太接近了预期状态的平均值（例如，平均5套手术太接近平均4 some; 4n样本； 4n样本；补充方法1）。当将超过1％的基因组分类为这样（例如，超过1％的5symy）时，使用预期状态的平均值（Euploid样本的倍率）计算了状态的拷贝数的非全面版本作为参考：

　　非全面复制号。

　　示例5 somy（4n样本）：

　　非全面拷贝数。

　　这样做是为了量化两个状态之间的距离。该值通常在所考虑的状态的-0.5和+0.5之间（例如，5some； 4.5和5.5之间），这将导致等于状态的圆形值。畸变的库通常偏差为0.25，与期望值相差更多（补充方法1）。因此，丢弃了显示偏差超过0.25的文库（用于5套；值低于4.75或高于5.25）。通过应用此临界值，我们消除了清楚地表明这种像差的库（补充方法1），同时保留真正的非整倍图库（补充方法1）。该特定方法仅用于BJ样品。

　　使用GSEA软件v.4.2.150,51进行GSEA。PAN癌症研究中的标准化mRNA表达（Illumina Hiseq_rnaseQV2，RSEM）从https://www.cbioportal.org/下载：有关RNA测序实验和使用工具的详细信息，可以在NCI的基因组数据共享CONS（GDC）PORTAL HTTPS:CC./GDC./gdc.c./c.c..c./gdc./gc.c..c..c./ganc./ganc./ganc.c.膀胱尿路上皮癌（156个近二倍体和200个近四倍体样品），肺腺癌（205个近二倍体和240个近四足样本样品）和卵巢浆液性静脉癌（116近二倍体和130近甲基菌群）均为36均为33的卵巢症状（近二倍体样品）。除了排名的基因列表和倍增性状态外，我们还使用从GO生物过程本体学得出的基因集来评估GSEA工具中接近二倍体和近四倍体肿瘤之间的显着途径富集。GSEA是一种计算方法，它确定了一组定义的基因集是否显示了两个生物学状态之间的统计学意义一致差异（例如，两个不同的表型），使用算法基于富集得分的计算（ES）的计算，ES ES（名称P值）的估计（名称P值）和调整多个假设测试（ES归一化量）505050。

　　图像分析和量化使用图像J软件v2.1.0/1.53C，https://imagej.net/software/fiji/downloads进行。为了量化两个信号之间的共定位（扩展数据图3i，m，4g，j），我们使用带有image J v2.1.0/1.53c软件的JACOP插件计算了Manders系数。我们确定γH2AX信号与EDU之间的共集体化，FANCD2或RAD51信号不是随机使用基于自制的基于自制的带有图像J软件核区域的基于自制的成本。对于每种条件，进行了1000个像素位置的随机化（补充数据2）。3D视频（扩展数据图3C，6C，9C，D）使用带有Image J v2.1.0/1.53C软件的3D正确漂移插件进行校正，以使感兴趣的单元格位于感兴趣区域的中心。使用带有图像J V2.1.0/1.53C软件的魔杖工具测量核区域和DAPI强度。对于这些数字，图像是在Image J v2.1.0/1.53C软件上处理的，并使用Affinity Designer（https://affinity.serif.com/fr/designer/）安装。

　　至少进行了两个独立的实验以生成每个数据集，并使用GraphPad Prism（RRID SCR 002798）7.00版（GraphPad Software）计算差异的统计显着性。图图中指示了用于每个实验的统计检验。每个代表性图像（图2a，c，C，3a，e，g，k，n，4a，扩展数据图2a，c，e，e，3a，3a，g，4c，4c，5g，6c，6c，9c，9c，d，10a）源自至少由至少两个（n）独立实验组成的数据集。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。