人MDA-MB-231腺癌（ATCC），MDA-MB-231 BRM218（从脑转移中分离出的MDA-MB-231细胞是J.Massagué），HOS（ATCC），HOS（ATCC），U87（ccc）和HEK293（ATCC）（ATCC）细胞和Dermal fibroell（coriell fibroell（Coriell）（Coriell）（coriell fibroell）（coriell）（coriell fibroell）（Coriell）（coriell fibroell）（coriell）补充了10％热灭活FBS（Gibco）和1％青霉素 - 链霉素（10,000 U ML-1; Gibco）的技术/GIBCO。在平滑肌细胞生长培养基（Promocell）中生长HAOSMC（Promocell）。SUM159细胞获自D. Wirtz（Johns Hopkins University），并在Ham的F-12培养基（Gibco）中种植，其中含有5％FBS，1％青霉素 - 链霉素（10,000 U ML-1; Gibco），1μgMl-1 ML-1氢皮质（Sigma-Aldrich）和5μgmLinin（Sigma-Aldrich）和5μgmLinin（SIGMA-ALDRICH）和5μgmlinin（SIGMA-ALDRICH）。将细胞在37°C和5％CO2的孵化器中维持，并每3至5天以60–90％的汇合度通过。使用以下底漆对应定期检查细胞对PCR的支原体污染：正向，5'-GGGGAGGAAACAGGATTAGAGATACCCT-3'；反向，5'-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3'。

　　In select experiments, cells were treated with the following pharmacological agents (purchased from Sigma-Aldrich unless otherwise stated) and corresponding vehicle controls: 2-APB (Calbiochem, 100 μM), CK666 (100 µM), latrunculin A (2 µM), NSC 668394 (Calbiochem, 10 μM), Y-27632 (10 µM),BLEBBISTATIN（50 µM），BAPTA（50 µM），GSK2193874（15 µM），GSK1016790A（1或15 µM），BAPTA AM（Invitrogen，25 µm），EIPA（40 µm）（40 µM），HC-067047（1 µmmmmmmmmm）和0.1 µmmmmmmmmmmmmmmmmmm。

　　IMDM中的甲基纤维素储备溶液（3％）是从研发系统中购买的，并通过用适量的IMDM（Life Technologies/Gibco）稀释储备溶液来制备所需的粘度介质，其中含有10％热灭活的FBS（GIBCO）（GIBCO）（GIBCO）和1％Penicillin-Stropillin – Stroplylin – Strolpoptycin（10,000 U mml-gibco）。作为提高粘度的另一种方法，右旋烷500 kDa（Spectrum Chemical）和PVP（K-90； Sigma Aldrich; Sigma Aldrich; Molecular Mose，360 kDa）用作适当的基础培养基中的悬浮液。在某些实验中，Detran 6 kDa（Alfa aesar）用作500 kDa的对照，作为相同摩尔的低分子质量（6 kDa）葡萄糖，不会改变粘度。使用Cannon – Fenske毛细管粘度表测量在37°C下所得培养基的粘度。使用3205个单样本渗透压计（高级仪器）使用冰点抑郁症来测量渗透压。为了确保将粘性培养基成功进入微通道，将直径为0.5μm的红色荧光珠（流化的）均匀分散在培养基中，并且通过落叶显微镜成像，它们的流穿过设备。

　　在培养基中，使用高达0.6％或92 µm的65 kDa甲基纤维素。因此，由于添加甲基纤维素而引起的渗透性变化只能高达100μoSM，相对于基础培养基的渗透压范围较小，该培养基的渗透性不重要，该培养基的渗透压范围更高3,000×（〜300 MOSM）。

　　在伤口愈合测定中，使细胞在胶原蛋白涂层（20 µg ml-1;胶原蛋白大鼠尾巴; Thermo Fisher科学）组织培养塑料板（Falcon）上生长至汇合。达到汇合后，使用200 µL移液尖端用塑料尺作为指导创建单层刮擦。在2D单细胞运动测定中，将细胞以5-8％的汇合度将其铺在胶原蛋白涂层（20 µg ML-1）组织培养塑料板（Falcon）上。在细胞扩散或创造伤口后，将培养基替换为适当的粘度，并在培养基变化后30分钟开始获取延时图像。在涉及高分辨率成像的某些2D测定中，将细胞铺在胶原蛋白涂层（20μgml-1）菜肴（Cellvis或Ibidi）上。

　　如先前所述，基于PDMS的微流体设备，这些微流阵列（长度为200 µm，高度为10μm，宽度为3.5μm或10μm）如前所述，如前所述为20,46。使用激光轮廓仪来验证微通道的高度和宽度。在培养和细胞播种之前，将微通道涂在胶原蛋白I（20 µg mL -1）之前。除HAOSMC和人真皮成纤维细胞外，所有细胞类型均在狭窄（3.5×10 µm2）通道内进行测试。在10×10 µm2通道内检查了HAOSMC和人真皮成纤维细胞。

　　通过在添加细胞之前，用15分钟的15分钟的介质填充入口井来加载微流体设备的适当粘度培养基。使用0.05％胰蛋白酶-EDTA（Gibco）从培养瓶或板中分离细胞，然后在300g下离心5分钟，并以指定粘度的培养基重悬于指定的粘度培养基，浓度为5×106个细胞，每毫升5×106个细胞。从设备的入口和出口中去除培养基后，将20μl的细胞悬浮液添加到细胞种子入口中，以形成压力驱动的细胞流入细胞种子播通道。允许细胞粘附并在微通道入口外散布至少20分钟，然后在适当的粘度下用培养基填充所有入口井至100μl。成像之前，将设备在37°C和5％CO2下孵育。在迁移分析过程中，细胞未受到任何趋化刺激或中流。在使用药理学剂的实验中，一旦细胞完全进入微通道，设备中的培养基被含有考虑药物或其各自的媒介物控制的介质代替。通过成像分散在8 CP培养基中的荧光珠的流动，我们证实了它们成功进入微通道（补充视频5）。

　　每2至20分钟将细胞在倒置的Nikon Eclipse Ti显微镜（Nikon）上以自动对照（NIS元素； Nikon）和A×10/0.45 Na PH1物镜使用延时显微镜进行成像，持续12至20 h。在某些实验中，使用异硫氰酸荧光素过滤器对细胞进行成像。对于使用NHE1-GFP转染细胞的实验，使用了具有×20或×60物镜的尼康A1共聚焦显微镜（Nikon）。在实验过程中，将细胞保持在37°C和5％CO2的阶段孵化器（Tokai Hit）上。A1共聚焦系统还具有温度控制的笼子。

　　现场电池视频已导出到ImageJ（美国国立卫生研究院），Mtrackj插件用于细胞运动跟踪。在单细胞2D迁移测定中，选择并手动跟踪与任何邻居接触的细胞。除非相邻的细胞触及了跟踪的单元格，否则进行单元跟踪直到视频结束，在这种情况下停止了跟踪。在微流体实验中，从完全进入微通道的时间到与微通道结束进行接触，记录了细胞路径。使用自定义MATLAB（MATHWORKS）脚本来分析细胞路径的细胞迁移速度和速度。通过手动评估领先边缘进入和尾随边缘进入微通道之间的时间来计算细胞进入时间。在2D和微通道迁移中，将分裂或凋亡细胞排除在分析之外。使用ImageJ分析伤口治疗测定，通过绘制一条线，指示刮擦伤口两侧的迁移前线。当两者都互相触摸时，记录了伤口闭合。

　　对于细胞迁移表型分类，使用Alexa Fluor 488伪动蛋白（1：100; Invitrogen）和Hoechst（1：2,000; Invitrogen）染色的活细胞或使用倒置的Nikon Eclipse Ti Microscope（Nikon）使用×40空气目标4乘通道4 and 8 H染色的活细胞（1：100; Invitrogen）和Hoechst（1：2,000; Invitrogen）观察到。如先前报道，手动列出了限制下的细胞表型47。

　　如先前所述48，生成具有MDA-MB-231细胞的球体。简而言之，将生长因子还原的矩阵（康宁）用1：3稀释，冷DMEM补充了10％热灭活的FBS和1％青霉素 - 链霉素。然后，将50 µL稀释的矩阵转移到96孔板（Falcon）的每个孔中，并在37°C和5％CO2下聚合1小时。从培养烧瓶中收集细胞，重悬于稀释的母质中，并在每个孔中的先前聚合的Matrigel顶部轻轻分配（每50 µL 2,000个细胞）。在37°C和5％CO2孵育1.5小时后，将100 µL的DMEM与10％热灭活的FBS和1％的青霉素 - 链霉素一起孵育后，将其添加到每个孔中。每2天更换一次培养基，直到收集球体进行实验（通常约10-15天）。将基质凝胶溶解在冷DMEM中后，收集球体，并以2,655g离心5分钟。去除上清液后，将球体重悬于0.77或8 cp培养基中，并将其铺板到胶原蛋白涂层（20μgml-1）24孔板上。60分钟后，在倒置的Nikon Eclipse Ti显微镜上，每20分钟对球体进行一次成像至少20小时，其自动对照（NIS元素； Nikon），使用×10/0.45 Na PH1物镜使用延时显微镜物镜。在实验过程中，将球体保持在37°C和5％CO2的阶段孵化器上。使用NIS元素软件（Nikon）获取了第一个细胞分离时间，该手动记录第一个单元格完全从每个完整球体分离所需的时间。

　　为了生成具有ARP3和/或ARPC4或TRPV4稳定敲低的MDA-MB-231细胞，使用了PLKO.1 PURO（质粒8453; Addgene; Addgene; B. Weinberg B. Weinberg）骨干的礼物。将以下序列亚克隆到PLKO中。1普罗骨架：非靶向争夺序列：5'-GCACTACCAGAGCTAACTACTAACTACTACTACAGATAGTACT-3';Sharp3序列1：5'-GTAACCAAACATGATTATA-3';SHARPC4序列1：5'-GCTGAAGAGTTCCTTAAGAAT-3';shitgb1序列1：5'-tgcctacttctgcacgatgt-3';SHTRPV4序列1：5'-TCTTGGTGGTACAAACTTGGT-3';和SHTRPV4序列2：5'-TGCTCCTATGGAGTCACATAA-3'。

　　而SHTRPV4序列-1用于扩展数据图6中，而在手稿的其余部分中，使用了序列2。对于AQP5敲低，将以下靶向序列亚克隆到PLVTHM（质粒12247; Addgene; Addgene;来自D. trono的礼物）骨架：SHAQP5序列1：5'-ACGCGCGCTCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAAA-3'。

　　对于NHE1耗竭，将以下序列亚克隆到PLKO.1 pURO.1 pURO和PLVTHM骨架中，并与SC序列一起使用，该序列被亚克隆到相应的骨架中：SHNHE1序列1：5'-GACAAGCAAGCTCAACCCACCCCCCGGGGGGGGGGGGGTTTAAT-3'';和SHNHE1序列2：5'-CCAATCTTAGTTTTTTTCCAAA-3'。

　　尽管SHNHE1序列在扩展数据中单独使用，但在所有其他实验中，序列1和序列2均使用。用SHMIIA和SHMIIB3稳定转导的MDA-MB-231细胞用于迁移分析。对于肌动蛋白逆行流量分析，将SHMIIA序列克隆到PLKO.1 PURO骨架中。每次克隆后，通过在JHU遗传资源核心设施上进行Sanger测序来验证序列完整性和方向。

　　对于慢病毒的产生，HEK293T/17细胞与PSPAX2，PMD2.G和感兴趣的慢病毒质粒共转染。然后，转染后48小时，使用离心机收集慢病毒并浓缩。将60–80％汇合的野生型MDA-MB-231细胞与100倍病毒悬浮液一起孵育24小时，以及8 µg ml-1的聚紧透感染试剂（Millipore Sigma）。为了维持稳定的敲低，将用PLKO转导的细胞在含有0.5 µg ml -1嘌呤霉素（Gibco）的培养基中培养1 puro骨架。

　　The pGP-CMV-GCaMP6s (40753; a gift from D. Kim and the GENIE Project), FUGW-pHRed (65742; a gift from M. Tantama), pLentiRhoA2G (40179; a gift from O. Pertz), pLenti.PGK.LifeAct-GFP.W and pLenti.PGK.LifeAct-Ruby2.W (51010 and分别从兰斯福德（R. Lansford）获得的礼物分别是从Addgene购买的，用于慢病毒细胞转导。GFP-AHD质粒由M. A. Glotzer49提供，并将使用BAMHI和NOTI的PLV-EF1A-IRES-PURO（质粒85132; Addgene; Addgene; Addgene; Addgene; Addgene; Addgene; Addgene; Addgene; Addgene; aiddgene;t。Meyer的礼物）都克隆到慢病毒主链中。以下序列用于扩增GCAMP6S：5'-CAAATGTGGTGGTGTGCTGATTATG-3'和5'-GTACGCGCGTCACCATGGGTTCTCTCATCATCATC-3'。随后，使用MLUI和NOTI将PCR产物插入PLV-EF1A-IRES-PURO中。将PEYFP-C1（Clontech）2克隆到PLV-EF1A-IRES中，以下序列以及NOTI和HPAI限制性站点：5'-GTGCGGCGCGCGCGCGCGCCACCACCACCATGGTGAGC-3''''''和5'-CTGTTAACTCACTTGTGTGTGTACAGCGTCCGTCCCCATCCATCCATGC-3'上述质粒用于制备慢病毒颗粒以进行稳定的细胞转导。

　　ARP3-PMCHERRYC1（27682; C. Merrifield的礼物）和β-Actin-MRFP-PAGFP（62382; G. Charras和T. Mitchison的礼物）购自Addgene。NHE1-GFP质粒是J. Orlowski的礼物。上述质粒用于瞬态转染。根据制造商的建议，使用Lipofectamine 3000试剂转染约60–80％汇合的MDA-MB-231细胞。为了丰富表达ARP3-PMCHERRYC1，β-肌动蛋白MRFP-PAGFP或NHE1-GFP的细胞群体，选择了0.5 mg ML-1 G418（康宁）并分类的细胞。如前所述3产生表达肌球蛋白IIA-GFP的细胞。

　　为了染色F-肌动蛋白，先前描述的方案50用于将胶原蛋白涂层的玻璃底盘（Cellvis）铺成的细胞。简而言之，当细胞达到约20％的汇合度时，它们的培养基被所需的粘度代替，并在37°C下孵育2-6小时。然后用含有Ca2+/mg2+（Gibco）的PBS洗涤细胞一次，使用0.25％的戊二醛固定并提取1分钟，在细胞骨骼缓冲液中使用0.25％的戊二醛和0.5％Triton X-100（150 mM NaCl，NaCl，10 mm Mes Mes，10 mm Mes buffer，5 mm egta，5 mm egta，5 mm glucose，5 mm glucose，5 mm gcl 2 in in 5 mmmgcl 2 in in 5 mmmgcl 2 in;细胞骨架缓冲液中的2％戊二醛。将样品立即处理，或在4°C下用2％戊二醛储存在细胞骨架缓冲液中，直到随后进行染色。将戊二醛的背景自动荧光用1％NaBH4淬灭15分钟，然后用5％牛血清白蛋白（BSA）阻塞1小时。用若丹明或Alexa Fluor 488鬼笔环肽（1：100; Invitrogen）和Hoechst（1：2,000; Invitrogen）染色细胞。使用Zeiss LSM800共焦与Airyscan超分辨率模块的X，Y分辨率为120 nm，Z分辨率为350 nm，从而获取了高分辨率图像。

　　按照“层状肌动蛋白染色和成像”部分中所述制备样品，固定和提取样品。接下来，用0.2％NaBH4处理固定样品7分钟，在PBS中用0.5％甘氨酸处理10分钟，然后用含有0.1％Triton X-100（Sigma-Aldrich）的5％BSA溶液阻止1小时。随后将样品用Alexa Fluor加647鬼笔环肽（1：400; Invitrogen）在4°C下染色过夜。在成像当天，准备了以下溶液：缓冲液A（含50 mm NaCl的pH 8.0时10 mM Tris），缓冲液B（50 mm Tris（50 mm Tris），含有10 mm NaCl和10％葡萄糖的pH 8.0和Glox（14 mg葡萄糖氧化酶（Millipore Sigma）和0.85 mg Catalase（Millipore Sigma）（Millipore Sigma）（14 mg葡萄糖氧化）（14 mg）50 µL蒸馏H2O）。将样品用含有0.05％Triton X-100的PBS洗涤5次，持续5分钟。在成像之前，准备了新鲜的暴风型缓冲液（7 µL Glox溶液，7 µL 2-甲醇和690 µL缓冲液）并添加到菜肴中。将玻璃盖玻片轻轻放在顶部，以将样品从大气中封闭，并将菜肴安装在范围上。

　　在配备有×100/1.49 Na Plan-Apo物镜的Nikon Eclipse Ti-E（Nikon）显微镜上获取图像，647 nm纤维激光器以500 MW运行，并Evolve 512 EMCCD摄像头（光照相）。在120 fps的NIS元素（Nikon）中捕获了总共50,000次裁剪的图像（128×128 PX2）。使用TIRF将荧光限制在样品的薄区域，尼康完美的聚焦系统用于减少Z型船只。使用Picasso Software重建风暴图像和可视化51。通过点扩散函数宽度（SX = 2）和高度（SY = 2）和X（LPX = 2）和Y（LPY = 2）在相机像素中过滤定位。为了分析肌动蛋白密度，将重建的图像导出到ImageJ，并使用Phansalkar算法使用ImageJ的自动局部阈值将纤维转换为二进制掩码。手动跟踪细胞的边缘，并在总像素上计算出距细胞边缘1.5 µm以内的像素上的像素的百分比百分比。

　　如先前所述，进行了细胞体积测量。使用尼康A1共聚焦显微镜成像稳定表达LIFEACCT-GFP的细胞在培养基替换为所需的粘度的2-6小时内成像具有×60的油性液化物镜。以1,024×1,024的PX分辨率获取图像，共聚焦切片的间隔为0.5 µm。使用488 nm激光来对细胞进行成像，并从LIFEACCT -GFP信号获得边界。在整个实验过程中，将细胞保持在37°C和5％CO2的过程中，并在阶段的孵化器和笼子内（Tokai Hit）保持。

　　使用以前描述的自定义MATLAB脚本从Z-stacks测量细胞体积20。取消了Z-Plane的焦点外。使用MATLAB中的二进制阈值函数处理每个分析的焦平面的图像以消除噪声。使用Canny Edge检测器操作员在每个图像中检测到细胞边界。将边缘扩张并补充，以从每个切片中获得细胞的横截面区域。通过将Z-slice间隔乘以两个相邻切片的平均面积并整合所有值来计算体积。在某些实验中，使用NIS元素V.5.02.01（Nikon）和Imaris v.9.7.0（Bitplane）的NIS元素的体积测量向导分析了细胞体积。

　　除了测量整个细胞的投影区域外，我们还评估了细胞部分的面积高于基板的临界高度。考虑到通常报道的1 µm的lamella厚度后，选择了2 µm的临界高度。值得注意的是，该阈值消除了共共聚焦成像中可能的Z含量。通过从总体预测的细胞区域中减去高于临界高度的电池的投影面积来计算预计的薄片区域。为了使对单元大小的测量值归一化，报道了数据在整个细胞的预计区域上的预测面积。

　　将稳定表达LifeAct-GFP或LifeAct-ruby的细胞铺在约20％汇合的胶原蛋白涂层玻璃底（Cellvis）上。用所需粘度的培养基处理2-6小时的细胞后，使用配备有×60的油浸泡物镜的Nikon A1共聚焦显微镜每5 s或2分钟获取每5 s或2分钟的延时图像。将细胞保持在37°C和5％的二氧化碳和笼子内的5％CO2。

　　将延时图像导入ImageJ，并手动提取细胞的生长前部。随后，使用自定义宏来识别瞬时细胞区域和边缘长度（或周长）。在每种情况下（i）的薄片生长都是使用面积变化比最后一个周长的比例来计算的，使用公式：

　　通过在特定粘度下结合细胞中的所有实例，制备了一个汇总瞬时前沿生长的热图。

　　为了测量肌动蛋白逆行流，将稳定表达β-肌动蛋白MRFP-PAGFP的MDA-MB-231细胞铺在胶原蛋白涂层的玻璃底（Cellvis）上。使用具有×60的油性物镜的Nikon A1共聚焦显微镜（Nikon）的FRAP能力对细胞进行成像。通过直观检查在3分钟内手动识别细胞运动的方向，然后绘制了感兴趣的矩形区域（ROI； 60.75×7.25 µm2），其长度垂直于细胞前缘。细胞质中的一个点以20％的强度暴露于500 ms的紫外线（405 nm），然后在GFP和RFP通道处成像，每100 ms或400 ms紫外线照明后30 s。

　　为了分析逆行流，将延时视频导入到ImageJ中。将RFP和GFP通道单独提取，转换为二进制和平滑两次。接下来，用GFP信号垂直于图像的前缘绘制基因图，并使用光转换的PAGFP分子的逆行流量来估算相对于实验室框架的流量。通过测量发生回收事件之前，基仪中细胞前缘产生的斜率来量化了不间断的前沿生长速率。来自RFP通道的图像用于在光激活之前定位细胞边缘。

　　将表达RhoA2G生物传感器的细胞铺在胶原蛋白涂层的玻璃底菜上。在将细胞暴露于所需粘度的介质的2-6小时内，CFP的图像（激发：430/24，发射：470/24），YFP（激发：500/20，发射：535/30）和fret（激发：430/24，430/24，发射：535/30）设置。对于RhoA-Activity定量，从相应的通道减去背景信号后测量了FRET与CFP的平均像素比20,52。YFP通道中的图像用于追踪细胞边界。使用尼康元素进行成像和定量。对于用FBS（10％）激活的对照实验，将细胞饥饿24小时，然后再添加含有10％FBS的培养基，并在0.5–2 h内获得图像。

　　为了进行膜张力测量，在胶原蛋白I涂层玻璃底菜上镀以细胞，并在没有指定药物的情况下在特异性粘度的培养基中孵育3-4小时，并用活细胞膜张力探针Flipper-TR（螺旋色体，0.5 mm，0.5 mm）染色。如先前所述，使用Zeiss LSM 780显微镜和picoharp 300 picoharp 300次交易的单个photors-pcccccccccccm-pcc a twose（FLIM）分析用脚tr或稳定表达RhoA2G传感器的活细胞分析，如先前所述，使用Zeiss LSM 780显微镜和picoquant系统和picoharp 300 picoharp 300次交易的单个photors-photors-pccss-lssm pcc-ls-pccs-lssm pcc and pcc pccmy（picoharp 300 pcc pccmy）进行了20,47。棕褐色II激光控制模块。对于Flipper-TR成像，使用485 nm激光线用600/50频段探测器单元进行激发。在山核桃环境室内和阶段成像期间，将细胞保持在37°C和5％CO2。

　　使用Synphotime 64（PicoQuant）软件如前所述处理FLIM数据。简而言之，使用自定义脚本来计算100个数据点的内部响应函数，没有平滑。划分数据以确保每个binned像素至少500个光子，应用细胞特异性阈值以消除细胞外荧光。使用三个指数重新vlution缩，将荧光衰减拟合到每个bin的像素中。对于Flipper-TR定量，根据制造商的建议记录每个单元格最长的寿命（τ1）。对于RhoA-FLIM分割定量，使用分子64在细胞的不同区域中测量强度加权荧光寿命平均（τAI）。使用自由形式的ROI在FLIM分割期间排除了来自核区域的数据，因为RhoA FRET传感器被排除在细胞核之外，从而导致细胞中心的低和可变光子计数。没有核的整个细胞被定义为“整体”，而细胞边缘的薄片区域是从DIC图像中鉴定出来的（扩展数据图8D）。细胞的“身体”包括没有薄片和核的细胞的其余部分。

　　将细胞瞬时或稳定表达的GCAMP6在带有PDMS Walls3的胶原蛋白I涂层玻璃盖板上铺板，并将其生长至60–80％的汇合。在添加指定的刺激的5分钟内，每分钟对细胞进行80-120分钟的成像，使用488激光器和GFP滤波器设置在尼康A1共聚焦显微镜上具有×20物镜。随着时间的推移，通过测量细胞内部ROI的平均强度，可以手动地在ImageJ中手动追踪代表细胞的GFP信号。钙尖峰被确定为在基线水平上强度大于2×的实例。

　　为了应用渗透冲击，制备了低音培养基，并如前所述测量其渗透压。用超纯水通过将基底IMDM培养基（292 MOSM）稀释（292 MOSM）或四倍（4×，71 MOSM）来制备培养基。对于FLIM测量，将细胞饥饿24小时，然后在应用渗透冲击后5-30分钟内测量RhoA活性。冲击后50分钟内还完成了细胞体积测量。

　　对于PMLC，KI-67和YAP1染色，用4％多聚甲醛（Thermo Fisher Scientific）固定细胞，在0.1％Triton X-100中通透，并在室温下用5％BSA溶液固定1小时，含有2％（用于YAP1）或5％正常的goat Serim（cellum Signaling Serigning）和0.1％x-1％x-100 x-100 x-100 x-100 x-100 x-100 x-100 x-100。Next, cells were incubated at 4 °C with an anti-pMLC (Ser19) antibody (raised in rabbit; Cell Signaling; 3671; 1:100), anti-YAP antibody (raised in mouse; clone 63.7; Santa Cruz Biotechnology; sc-101199; 1:50) or anti-Ki-67 antibody (raised in mouse; 8D5; Cell Signaling, 9449;1：800）一夜之间。对于NHE1和Ezrin染色，用4％多聚甲醛固定细胞，在0.1％Triton X-100中透化，并在室温下以1％BSA含有0.1％Triton X-100固定1小时。随后，将细胞与抗NHE1抗体（在小鼠中升高； 54; Santa Cruz Biotechnology; SC-136239; 1:50; 1:50）或抗蛋白抗体（在兔子中升高；细胞信号传导； 3145s; 1：200）过夜。用PBS洗涤3次后，将样品与Alexa Fluor 488山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）H+L（Invitrogen; A11034; 1：200），Alexa Fluor 488 goat抗Mouse Immunoglobulobullobulin g（Invitrogeng）H+L（IGG）H+L（IGG）H+L（IGG）H+L（IGG）H+L（IgG）抗体488;Alexa Fluor Plus 647山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）H+L（Invitrogen; A32728; 1：100）。所有抗体均在相应的阻塞缓冲液中制备。还用Hoechst 33342（Invitrogen; 1：2,000）和Rhodamine phalloidin（Invitrogen; Invitrogen; 1：200）染色了细胞核和肌动蛋白。在尼康A1共聚焦系统上使用×60的石油浸泡物镜对样品进行成像。仅用二抗体染色的样品用作阴性对照。

　　通过沿整个单元格的整个长度绘制矩形，并使用imageJ中的绘图函数来评估PMLC和ARP3的空间分布。在Excel中汇编了来自每个单元的原始强度数据，并在将强度相对于电池的最低信号进行标准化后计算了移动平均值。为了定量NHE1和Ezrin极化，手动绘制了细胞前边缘和后边缘的自由形状区域，并记录其平均强度值。从每个单元的平均强度值计算出前后比率。为了评估KI-67阳性细胞百分比，将2,396×1,917 µM2图像导出到ImageJ，并使用在相应的荧光通道上列出了DAPI鉴定的核以及KI-67阳性细胞的数量。为了量化YAP1的核与周质比，将Yap1的平均荧光强度强度除以核内手动绘制的ROI的平均荧光强度，除以放置在核外面的相同ROI的平均强度。

　　根据制造商的建议，使用直接-ZOL RNA分离试剂盒（Zymo Research）将争夺控制，SHTRPV4或SHAQP5细胞生长至95％汇合，并使用直接-Zol RNA分离试剂盒（Zymo Research）分离它们的总RNA。使用以下引物集使用以前的标准技术进行逆转录和QPCR：TRPV4：F，F，5'-CCCGTGAGAACCACAAGTTT-3'和R，5'-GTGTCCTCCTCATCCGTCACCTCCCTC-3';aqp5：f，5'-cagctggcactctgcattt-3'和r，5'-tgaaccgattCatgaccaccc-3';MIIA：F，5'-ATCCTGGGACCAGAACTGCA-3'和R，5'-GGCGAGGCTCTTTAGATTTCTCC-3';MIIB：F，5'-GCTGATGGCAACTCTCCGAAAC-3'）和R，5'-CTTCCAGGACACCATCATACAGCG-3'）;MIIC：F，5'-CAGCCGTCAAATGCAAACCGAG-3'和R，5'-TTGCCTCTGTCGTCACCTTCTC;18S：F，5'-CAGCCCCCCCGAGATGAGCA-3'和R，5'-TAGCGACGGGCGGCGGTGTGTG-3'。

　　如先前所述，使用Nupage 4–12％的凝胶和以下抗体进行了蛋白质印迹。补充图1中提供了未编写的原始印迹。

　　使用了以下主要抗体：抗TRPV4抗体（在鼠标中升高； 1b2.6; Millipore Sigma; mabs466; 1：1,000），抗arp3（鼠标; fms338; abcam; abcam; ab49671; ab49671; 1：5,000; 1：5,000），anti-arpc4（abcam; abcam; abcam; abcam; ab2117065; ab217065; ast 217065；抗体（兔子信号传导； 4706s; 1：1,000）和抗NHE1（在小鼠中升高； 54; Santa Cruz Biotechnology; SC-136239; 1：200）。GAPDH用作负载对照（兔子； 14C10；细胞信号传导； 2118s; 1：5,000）。

　　使用了以下二级抗体：抗小鼠IgG，HRP连接的抗体（细胞信号传导； 7076s; 1：1,000）和抗兔IgG，HRP链接抗体（细胞信号传导，7074s; 1：1,000）。

　　将离子电流记录在全细胞斑块钳模式32中。斑块移液器中充满了含有140 mM N-甲基 - 葡萄瓜氯化物，1 mM MGCL2、5 mM EGTA，10 mM HEPES，4 mM ATP和0.1 mM GTP（300 MOSM L-1，L-1，pH 7.3）的溶液。浴溶液中含有125 mM NaCl，1.5 mm MGCL2、1 mM EGTA，10 mm HEPES，并调整为305 MOSM L -1（带有-mannitol）和pH 7.36。将细胞保持在0 mV，并以0.2 Hz的频率施加从-100 mV到+100 mV（400 ms）的坡道。在10 kHz中获取坡道数据，并使用Axon P-Clamp软件在1 kHz下进行低通滤波。在室温下进行实验。

　　为了测量NHE1活性，使用了两种不同的探针和方法。参考文献中描述的方法。使用了53，它量化了由于短暂暴露于NH4CL而导致细胞内酸中毒后稳定表达pH传感器PHRED28的pH恢复速率。使用的第二种方法是定量用Phrodo Red-AM（分子探针； P35372）加载的SC和SHNHE1细胞中的细胞内pH，以及暴露于NHE1抑制剂EIPA的细胞中Phrodo信号变化的测量。在561 nm和405 nm激光线上激发表达PHRED的MDA-MB-231细胞，并使用600/50检测器收集发射。细胞内pH与405 nm（r = i561/i405）的强度的比率成反比。

　　将表达PHRED的细胞铺在20％汇合处的胶原蛋白涂层玻璃底（Cellvis）上。2–6 h暴露于所需粘度的培养基后，将细胞与补充10％热灭活的FBS和1％青霉素 - 链霉素的DMEM孵育10分钟。接下来，每30秒对细胞进行2分钟的成像，并在尼康A1共聚焦显微镜上具有平面图×60物镜。此后，将培养基轻轻吸入，并用含有10％热灭活FBS，1％青霉素 - 链霉素和15 mM NH4CL的DMEM代替。然后将细胞每30 s成像4分钟，然后用补充10％热灭活的FBS和1％青霉素 - 链霉素的DMEM代替含NH4CL的培养基。每30秒继续进行成像，持续5分钟。为了进行分析，使用NIS元素（Nikon）中的ROI检测函数在每个时间点都自动追踪每个单元周围的边界，并导出了随时间的比例强度值。GraphPad Prism（GraphPad）用于绘制细胞内pH的时间依赖性变化，线性曲线适合每个细胞的pH恢复阶段。拟合线的斜率用于量化pH恢复速率为-dr/dt的质子外排或NHE1活性的速率。

　　根据制造商的说明，使用Phrodo Red AM测量细胞内pH。简而言之，将13毫米覆盖液生长的细胞暴露于1 ml浴溶液中，其中含有1 µl 5 mM Phrodo红色AM在10 µL Powerload 100×浓缩物在37°C下稀释30分钟。用等渗溶液两次洗涤细胞，并在室温下在手工灌注室中固定5分钟。使用具有×20物镜（Olympus）的Olympus IX70倒置显微镜获得了Phrodo红色AM荧光的视频微观测量。GFP阳性细胞的ROI在使用488 nm激发滤波器运行实验之前选择。为了监视phrodo红色信号，使用与计算机控制的滤轮轮（Lambda系列，Sutter仪器）相连的Xenon弧形灯在572 nm上激发细胞。使用HCI软件（Hamamatsu Photonics）通过EGFP/MCHERRY双发射过滤器（Chroma Technology），通过Orca Flash4plus摄像头（Hamamatsu Photonics）收集荧光图像。接触65毫秒后，每5 s获取图像。将基础荧光水平记录在等渗溶液中2分钟，然后将培养基交换为含有10 µm EIPA的同型培养基10分钟。根据制造商的说明，使用市售的细胞内pH校准缓冲套件（Molecular Probes; P35379）进行了探针的探针内校准。简而言之，在每个实验之后，将含有10 µM缬氨霉素和10μM尼古丁的7.5、6.5、5.5和4.5 pH校准标准的2-3 mL轻轻灌注3-5分钟。每个标准测量的最后十个数据点的平均值被绘制并拟合到标准线性曲线中。线性趋势方程用于推断实验pH值。

　　在某些实验中，将细胞铺在各种粘度的培养基中的组织培养瓶/板中。每天替换培养基，并在达到90％汇合后将细胞传递到新鲜的烧瓶/板上。在体外和体内测定中测试之前，将细胞保持在所需粘度的培养基中6天。

　　根据制造商的建议，使用Zymo Research Quick-DNA/RNA Miniprep Plus Kit（Zymogen）提取总RNA并纯化。使用NEBNEXT ULTRA II定向RNA库Prep Kit生成链特异性的mRNA库（新英格兰Biolabs，E7760），并使用poly（a）mRNA磁性隔离模块（新England Biolabs，E7490）分离mRNA。图书馆的准备是根据制造商的协议（新英格兰Biolabs，2.2 05/19）进行的。输入为1 µg，将样品分裂15分钟，RNA插入大小约为200 bp。使用以下PCR循环条件：98°C 30 s；然后是8个循环，为98°C 10 s，65°C持续75 s；并最终延伸为65°C 5分钟。在Illumina Novaseq仪器上测序了滞留的mRNA文库，使用100 bp配对的双端双索引读数和1％的PHIX对照。所有样本都有超过3900万读的读物。

　　我们使用HISAT2软件包54将读取映射到Human Grch38.p13基因组（HG38），使用ensemble104注释每个基因，并使用HTSEQ软件包为每对的外显子读数总数。人Grch38.p13基因组（HG38）是从eNEMBL获得的。使用DESEQ2.R软件包（在R，V.4.0中）来归一化和比较感兴趣的样品之间的每个基因的读数，每个样品的每个基因和每个样品的PCA得分的各个p值（扩展数据图11A）。我们在0.77 CP的SC样品与8 CP的SC样品之间以及在8 CP下的SC与SCP之间选择了差异表达的基因。这些数据在火山图中介绍（扩展数据图11b），并使用Ingenuity途径分析（Qiagen）用于途径分析（扩展数据图11C）。差异表达基因的P值是由DESEQ2.R软件包生成的（假设负二项式模型并校正了FDR）。Fisher的精确方法用于计算Ingenuity途径分析途径富集的重要性，其阈值为P≤0.05。样品制备和RNA-seq分析以盲方式进行。

　　根据国家癌症研究所和美国国立卫生研究院动物护理和使用委员会批准的协议，在K. Tanner的实验室中进行了动物研究。在14 h – 10 h的浅色周期下，将用于育种的性成熟斑马鱼保持在28.5°C。转基因TG（MPX：EGFP/FLK：MCHERRY）斑马鱼55,56是从天然产卵中获得的，保持在28.5°C直至细胞注射时间，并保持在渔水（60 mg速溶海洋盐（瞬间海盐）（速溶海盐（即时海洋）/升水））。为了抑制黑色素的形成并保持光学透明度，将胚胎转移到施肥后18-22 h之间的N-苯基硫脲（PTU; Millipore Sigma）的补充的鱼类水中。通过每40毫升鱼类溶解16 µL的PTU库存（7.5％w/v）来制备PTU水。每天更换水。注射后和浸润成像期间将注射的鱼保持在33°C。

　　注射前，将细胞用PBS洗涤3次，并在37°C下以每毫升2×106细胞的浓度在含有1 µM CellTracker深红色（Thermo Fisher Scientific）的PBS中孵育20分钟。然后用PBS洗涤染色的细胞，并重悬于PBS中每20 µL的1×106细胞浓度进行注射。

　　为了注射循环，在0.4％的三角式三甲酸三甲苯蛋白酶中将斑马鱼术后3天麻醉，并在琼脂糖床上的横向取向中定向。然后，使用循环中的拉动玻璃微板注入2-5 nL的细胞悬浮液，并通过背主动脉朝向尾部。在注射前将来自给定离合器的鱼随机分为实验组，并将实验阻塞，以便将处理和对照细胞从同一离合器中注入幼虫，以进行三个独立的离合器。注射后的注射鱼在注射后1-4小时之间进行筛查，以检查通过循环系统成功传播细胞，然后如下所述成像。在循环中缺乏细胞的鱼被安乐死。这些实验中使用的时间点尚未完成性别分化以确定性别。

　　斑马鱼幼虫被麻醉并固定在1％（w/v）溶解在细胞注射后4小时大约4 h中的1％（w/v）低纤维温度琼脂糖（Millipore Sigma）中。为了实现高分辨率共聚焦成像，将鱼横向定向在Coverglass Bottom腔室载玻片（Nunc Lab-Tek Chambered＃1.0硼硅酸盐Coverglass幻灯片，Thermo Fisher Scientific）。然后将补充有0.4％缓冲三环的PTU水添加到成像室中，以在实验过程中保持幼虫的麻醉。

　　以512×512像素的分辨率获取了一个光子共聚焦2D图像，这些分辨率被堆叠以获取3D图像。图像是在蔡司780或880共聚焦显微镜上获得的。对于每个幼虫，每10分钟以2 µm轴向步骤以〜50帧的速度获取以示分段为中心的1-2个共焦Z堆栈，以对〜100 µm的总深度进行成像。用Zeiss×20 EC Plan-Apochromat（0.8 Na）获得图像。从氩激光器的488 nm光同时激发样品，来自固态激光器的561 nm光和Hene633固态激光器的633 nm光同时激发。斑马鱼幼虫在舞台顶孵化器上的成像过程中保持在33°C。

　　延时显微镜图像被导出到ImageJ进行分析。仅当整个幼虫中视觉上确认血流时，才对图像进行分析。为了调整成像过程中的鱼类生长，首先使用正确的3D漂移插件通过基于相相关的翻译注册进行注册，并使用鱼的脉管系统用作地形参考。在注册过程中，启用了多个时间尺度计算，子像素漂移校正和边缘增强选项。使用TrackMate插件从注册的图像堆栈中，在注册图像中在3D中追踪癌细胞，使用trackmate插件进行ImageJ58。在整个采集期内，对轨道进行了视觉检查的准确性，并进行了手动编辑，以确保在整个细胞通过跨分段容器移动的整个时间内生成点对点轨道。

　　将细胞跟踪（X，Y，T，Z）导出到MATLAB进行分析。对于每个单元格，框架到框架的速度是通过将单元格的位移除以框架之间的时间间隔来计算的。然后，通过平均这些框架到框架的速度来计算该单元格中该单元格的平均速度。迁移的持久性是通过将在跟踪过程中给定单元的净位移除以总点对点距离的净位移来计算的。仅针对在段容器中保留至少4帧的细胞计算速度和持久值，并在最多71帧的情况下计算值。通过平均细胞速度计算出给定幼虫的细胞细胞流量的平均速度。

　　从艾伯塔大学的家禽研究中心获得了受精的白色腿鸡蛋，并保持在38°C。孵育4天后，将胚胎从其壳中分离出来，并保持在无壳条件下的贝壳条件下，在覆盖在38°C和60％湿度的空气孵化器中的覆盖盘中2。先前描述的方案59被用于图像并量化雏鸡胚胎中的肿瘤细胞外渗，在注射前将其随机分为实验组。简而言之，将25–50×103 YFP标记的MDA-MB-231细胞在3 CP或0.77 CP（幼稚的细胞）下进行6天，悬浮在冰冷的PBS中，并静脉注射到CAM脉管系统中。细胞注射后5小时，通过浸没共聚焦成像评估肿瘤细胞的渗出。然后，在浸润成像之前15分钟，将凝集素-649注射到CAM脉管系统中以可视化血管。每种条件至少有16只动物进行3个独立实验。所有程序均由艾伯塔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

　　先前描述了静脉注射MDA-MB-231细胞的方案45。简而言之，从Johns Hopkins Animal Core设施中获得了女性点头SCID伽马（NSG）小鼠（5至7周），并分成组以在条件下获得随机重量分布。注射以盲目的方式进行，没有细胞预处理条件或shRNA介导的修饰的身份。注射前，将小鼠用架空加热灯加热5-10分钟，以扩张尾静脉。注射了在200 µL正常盐水中的MDA-MB-231细胞（5×105）。为了评估肺中的微米和宏观 - 纳图，分别在接种后48小时或3周对小鼠进行安乐死。用最佳切割温度（OCT）化合物（Fisher Healthcare）膨胀肺，并切除图像和QPCR分析。在约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准的方案中概述的所有相关道德法规进行了动物研究。在为期3周的肺定植实验中，根据IACUC批准的方案，观察到任何潜在的人道实验终点体征，包括呼吸窘迫，弯曲姿势，修饰不良和体重减轻，观察到小鼠。在任何实验过程中均未观察到人道的终点标志。动物室的相对湿度为30–70％，温度为18-26°C，每小时至少换10个房间空气。笼子每周更换一次。给小鼠喂养含有低纤维（5％），蛋白质（20％）和脂肪（5-10％）的饮食。

　　用OCT充气的切除的肺固定，在4°C的30％蔗糖中饱和过夜，嵌入OCT化合物中，使用冷冻组CM1100（Leica）裂开液体氮气（15 µm厚）。将切片安装到超冻砂剂加上显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific）上，用1％Triton X-100透化10分钟，并用2％BSA封闭30分钟。对人波形蛋白（在小鼠中升高； O91d3; Biolegend; Alexa Fluor 647结合； 677807; 1：200稀释）染色1.5 h，然后孵育15分钟，然后孵育15分钟，并用抗Fade溶液进行成像（90％glycerol，tris and 0.5％pH 8. 0.5米，pH 8. 0.MM pH 8. 0.mm ph 8.0米，pH 8. 0.MM加拉特）。用0.1％苏丹黑色处理降低背景荧光25分钟。

　　使用具有×10/0.45 Na空气物镜的Nikon A1共聚焦显微镜对组织安装的载玻片进行成像。分别在注射后48小时或3周的样品中随机选择了五个或十个区域。将图像导出到ImageJ，并注释带有波形蛋白的转移位点以进行手动计数。将48小时后的微型转移列举为任何流频蛋白阳性单细胞，而3周后的宏观变体定义为含有> 5核的波形蛋白阳性簇。

　　对Hline19,60的QPCR分析一式三份进行，并报告了每只小鼠的平均值。简而言之，在液氮中切开了两个小裂片的小裂片。对于DNA提取，将肺组织裂解在裂解缓冲液中（1 M Tris，pH 8.0，5 m NaCl，0.5 m EDTA，10％Tween-20，10％NP-40和40 µg蛋白酶K），在55°C下均质化和孵育。2小时后，将蛋白酶K在95°C停用2分钟。然后通过苯酚 - 氯仿提取DNA，用2.5 mM NaCl和100％乙醇（在-20°C下进行预充血）沉淀，并用70％乙醇洗涤。空气干燥后，将DNA样品重悬于纯水中。使用用于Hline的引物对进行QPCR：正向，5'-TCACTCAAAGCCGCTCAACTAC-3'；反向，5'-TCTGCCTTCATTTCGTTATGTACC-3'。在DNA样品中检测小鼠和人β肌动蛋白序列的引物对（向前，5'-Acgaggcccagagcaagaga-3';反向，5'-GCCACACGCAGCTCATCATTGTAG-3'）用作基线，用来将人体DNA的表达水平正常化（通过Hline）和DNA量度（测量DNA intup）（测量DNA input）（测量dNA）。

　　数据代表平均值±S.D.除非另有说明，否则≥3个实验（反映独立的生物复制品），每个条件分析了≥30个细胞，并且数据点表示每个细胞的值，除非另有说明。在数据点数量为3到8之间的情况下，使用shapiro – Wwilk测试进行正态性测试。对于具有> 8个数据点的样品，使用D'Agostino -Pearson综合测试来确定数据是否正态分布。使用两尾学生的t检验和单向方差分析比较具有高斯分布的数据集，然后进行Tukey的事后测试。对于日志正态分布，在数据对数转换之后进行了统计比较，随后是未配对的两尾学生的t检验或单向方差分析，然后进行Tukey的事后测试。对于非高斯分布，使用非参数惠特尼U检验进行比较两种条件，并且使用Kruskal-Wallis测试进行了两组以上的比较，然后进行了Dunn的多种比较测试。使用双向方差分析分析了精选的实验，然后进行šidák或Tukey的多镜头测试。使用GraphPad Prism 7、8或9（GraphPad软件）进行分析。p <0.05被认为具有统计学意义。*p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。补充信息5-19中提供了确切的样本量，重复的数量，P值和统计测试。

　　在图1中，图像代表了3（图1d，h，l）或2（图1F，i）独立的生物复制品。在图2中，图像代表了3（图2b，g）或2（图2O）独立生物复制品。在图3中，图像代表≥3（图3a，d）或2（图3G）独立实验。在图4中，图像代表了3（图4E）或2（图4i）独立实验。

　　在Python v.3.8中构建了基于肌动蛋白的随机2D模型，该模型使用参考资料中建立的框架和公共代码。23。随着细胞前缘的肌动蛋白丝在泊松过程后经历伸长率和封端事件，肌动蛋白网络在质膜张力上生长，并发挥了决定网络前沿凸起速度的力。该模型使用了先前确定的力 - 速度关系，不仅概括了布朗棘轮的聚合模型，还概括了其他模型，例如束缚棘轮或端跟踪电动机。尽管已发表的模型研究了膜张力的瞬时变化对前沿网络组织的影响，但由于定义的粘度的细胞外流体，我们纳入了作用在肌动蛋白网络上的动态力，并将其纳入当前模型。我们使用线性粘合dashpot61将粘性电阻引入模型中，其中前缘上的粘性载荷用细胞外粘度线性地缩放。前沿处的每单位宽度总宽度可以描述为

　　在其中，F0和Fη分别是由于膜张力和粘性外部流体而引起的力。每次迭代的粘性力（i）都可以写成

　　其中，k（= 100,000）是一个无尺度缩放常数，η是细胞外粘度，vi -1是最后一次迭代的边缘速度。

　　使用实验测试的粘度值，对肌动蛋白网络形成中粘性负载的影响进行了建模。

　　两相肌动蛋白 - 水 - 渗透偶联细胞迁移模型26,62用于解释在不同细胞外粘膜下实验观察到的细胞行为。这两个阶段是指F-肌动蛋白网络和细胞质。G-肌动蛋白处于胞质阶段。该模型还包括离子扩散和通量。活性离子通量来自细胞膜上的离子泵。在没有一般性的情况下，我们假设离子是电性的。稳态模型将在下面简要介绍。

　　为了模拟牢固的通道中的单元格迁移，我们使用1D坐标系代表单元格。对于长度为l的单元，我们让x [0，l]表示连接到运动单元格的单元格结构域。具有压力P和速度VC的细胞质相可以被认为是不可压缩的液体，并且应通过细胞质和肌动蛋白网络之间的摩擦来平衡压力梯度。这两个条件可以写为

　　其中η是两个阶段之间界面摩擦的系数；θn和Vn分别是肌动蛋白网络阶段的浓度和速度。在细胞边界，由于细胞内部和外部之间水的化学势差，水横穿细胞膜。如果我们假设水通量jwater在向内方向上是正的，那么细胞质相的边界条件为

　　其中v0是细胞的稳态速度。上标记F和B分别表示与细胞的前后（或背面）相关的数量。水通量是根据

　　其中α是水的渗透系数，C是离子的浓度，RT是理想的气体常数乘以绝对温度。下标0表示细胞外环境。P*是细胞所经历的液压，由于通道中产生的液压电阻，它与通道末端的液压压力不同。通过对通用管流的分析，细胞所经历的压力可以表示为

　　其中DG是外部液压电阻的系数，该系数取决于通道的几何形状和细胞外培养基的粘度。

　　肌动蛋白网络阶段还具有由肌动蛋白肿胀引起的压力σn。如果不丧失一般性，我们可以假设被动膨胀压力与肌动蛋白网络的浓度成正比，即在哪里是常数。焦点粘连的力为肌动蛋白网络提供了有效的身体力。肌动蛋白网络上的力量平衡是

　　其中ηst是局灶性粘连的强度。肌动蛋白聚合通常发生在细胞的前部，而肌动蛋白去聚合发生在细胞质内。我们假设γ是肌动蛋白解聚的恒定速率。正如F-肌动蛋白和G-肌动蛋白互换转化的那样，两种肌动蛋白种的质量保护

　　其中θc和分别是g-肌动蛋白的浓度和扩散系数。在细胞的前端，F-肌动蛋白和G-肌动蛋白的通量边界条件与肌动蛋白聚合，JACTIN的速率和F-肌动蛋白和G-肌动蛋白的边界条件有关

　　在哪里和θc，c是常数。由于肌动蛋白去聚合发生在整个细胞质中，因此F-肌动蛋白和G-肌动蛋白的通量边界条件在细胞的后部为零。在我们感兴趣的时间尺度上，F-肌动蛋白和G-肌动蛋白的总量保持常数，以便θ*是肌动蛋白的平均浓度。

　　离子的扩散 - 传感方程为

　　其中直流是离子的扩散系数。边界上的通量是被动，JC，P和活动JC的组合，有效，磁通。被动通量遵循离子的浓度差异，即ksol是被动离子通量的渗透性。负迹象来自模型惯例，即所有内向通量都被认为是积极的。活动离子通量在模型中规定。

　　细胞的侧膜和通道壁之间存在摩擦力。摩擦力的大小可以表示为ff =ξv0，其中ξ是摩擦系数。这种力朝着细胞迁移的相反方向。通过考虑作用在细胞上的所有外力，细胞水平的力平衡为

　　通过考虑所有方程式来解决该系统。

　　从实验中，我们观察到粘附，肌球蛋白II活性（PMLC）和NHE1的极化分布在升高的粘度下。焦点粘连和PMLC的分布高度相关（扩展数据图4i和8j），这与肌球蛋白II活性促进局灶性粘附成熟的想法是一致的。63,64。因此，我们假设局灶性粘连的分布是由于肌球蛋白II的分布而发生的，该分布未明确包含在模型中。NHE1的极化分布（图2C）也是模型输入的一部分。

　　实验数据表明，局灶性粘连的分布在整个细胞长度上是不均匀的（扩展数据图4i）。对于0.77 CP培养基（低粘度（LV））的细胞，两端两端的局灶性粘连分布都很高，在细胞中间的粘附分布。我们使用二次功能

　　为了描述低粘度培养基中焦点粘连的归一化分布（扩展数据图5E），其中细胞长度的归一化坐标是blv [0,1]是该轮廓的最小值。对于8 CP培养基（高粘度（HV））中的细胞，局灶性粘附的分布在前缘很高，在细胞的后缘处较低。因此，我们使用不同的功能

　　为了描述高粘度培养基的焦点粘附的归一化分布（扩展数据图5E），其中最小值BHV发生在。实验数据表明，在0.77 cp时BLV = 0.3，在8 cp时BHV = 0.25（扩展数据图4i）。

　　局灶性粘连的非平均局部强度表示为I {lv，hv}的位置，是局灶性粘连的系数，随着细胞外粘度的变化。为了近似焦点粘连的强度，我们结合了每组中所有细胞的焦点粘附大小和数量的分布（扩展数据图4J），并将它们除以相应的细胞数，以获得沿细胞长度的归一化焦点粘附强度图。从实验数据（扩展数据图4J）中，8 CP处的最大局部焦点粘附面积约为8倍，比0.77 CP大。因此，我们假设。从文献中估算的值为62,65，考虑到与2d66,67的细胞相比，在限制下的细胞经历了相对较低的局灶性粘连密度。

　　对于在1D通道中的密闭细胞迁移，液压阻力的系数是从管道流68估算为DG =12μL0/W2的，其中μ是细胞外介质的粘度，L0是有效的通道长度，W是该工作3.5μm的横截面几何的最小维度。虽然细胞的长度随粘度而变化，但由于其体积的变化而变化，但通道长度（L0 =200μm）和横截面面积（35μm2）是两个粘度的常数。对于此数学模型，我们假设单元占据了通道的整个横截面，因此可以根据约束中平均细胞体积的度量计算细胞长度（图2A）：对于0.77 CP，细胞长度为L =85μm，对于8 CP，细胞长度为L =125μm。有效的通道长度由L0 = L0 -L计算。根据这些参数，我们可以计算每个给定的粘度μ的液压电阻系数。培养基的粘度不仅增加了细胞所经历的液压阻力，而且还增加了细胞和通道之间的摩擦。因此，我们对8 cp培养基（ξhv= 900 pAsμm -1）使用更高的摩擦系数（ξhv= 900 pasμm -1）（ξlv= 180 pasμm -1）。

　　偏振离子通量由膜离子通道的分布确定。我们分别使用并表示单元的背面（后端）和前边缘（前缘）处的活性离子通量。对于极化细胞，我们让该比率与NHE1的极化比相同。因此，对于0.77 CP培养基，γLV= 1.67，对于8 CP培养基，γHV= 2.84（图2C）。在模型中，我们修复并让您进行。抑制NHE1时。

　　其余参数在两个粘度上都是相同的，并且在补充信息4中列出。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。