没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。

　　All experiments were carried out in either polymix buffer A (50 mM Tris-OAc (pH 7.5), 100 mM KCl, 5 mM NH4OAc, 0.5 mM Ca(OAc)2, 5 mM Mg(OAc)2, 6 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM EDTA, 5 mM putrescine and 1 mM spermidine)45 or polymix buffer B (30 mMHEPES pH 7.5、5毫米MGCL2、50毫米NH4CL，5毫米2-甲醇，2毫米精子和5毫米presscine）46。三胞胎淬灭剂（1毫米Trolox，1毫米硝基苯酒精和1毫米环氯辛烷）的鸡尾酒和一个酶子氧清除系统（Protocatechuic（PCA）/Protocatechute-3,4-二氧酶（PCD））用于Smfret实验。硫酸盐霉素购自MP生物医学。梭酸钠盐，GTP和GTPγs来自Sigma-Aldrich。使用单声道Q 5/50 GL阴离子列（GE Healthcare Life Sciences）进一步纯化GTP。丙酮酸激酶，肌动酶和磷酸烯醇丙酮酸（PEP）购自Sigma-Aldrich。所有其他标准试剂均购自Sigma-Aldrich或VWR。

　　如前所述13,45,47，野生型，US13-和UL1标记的核糖体亚基分别从大肠杆菌BL21和MRE600纯化用于SMFRET和CRYO-EM实验。如前所述纯化EF-TU48和EF-G15。纯化了大肠杆菌trnafmet，trnaphe和trnalys13,16,24，trnaphe在核苷酸U47上的ACP3修饰下标记为LD655，如前所述45。如前所述45,47,49，制备了野生型，US13和UL1标记的起始配合物。

　　苯丙氨酸（2.5毫米），pHOR（0.15μM），丙酮酸激酶（0.4μm），肌动酶（0.5μM），PEP（3.75 mm），GTP（630μm）和LD6555555-labelled trnaphe（250 nm）是Chare（250 nm）的Charcl kcl phris（250 nm）（50 mm）。在添加EF-TU-EF-TS（EF-TS，伸长因子热稳定性）（1μm）之前，NH4CL，10 mM MGCL2、1 mM DTT，2.5 mM ATP和0.5 mM EDTA）（1μm）。将所得的混合物在37°C下孵育10分钟，以使TRNA（aa-tRNA）形成三元络合物（EF-TU – AA-AA-TRNA – GTP）。在将SMFRET成像注入显微镜流动池之前，将三元复合物在含有0.5 mM GTP的成像多晶型缓冲液中稀释40倍（最终浓度为6 nm）。

　　苯丙氨酸（1毫米），pHOR（0.2μM），丙酮酸激酶（0.6μM），肌动酶（0.6μM），PEP（0.4 mm），GTP（1 mm）和TRNAPHE（1 mm）和TRNAPHE（1.6μm）在添加EF-TU – FU-TU-TU-TS（8μmm）之前将其结合在充电中。将所得的混合物在37°C下孵育10分钟，以使tRNA并形成三元络合物。通过快速蛋白质液相色谱（FPLC）证实了成功的氨基酰化。

　　将赖氨酸（1毫米），LYSR（0.6μM），丙酮酸激酶（0.6μM），肌动酶（0.6μm），PEP（0.4 mm），GTP（1 mm）和TRNALYS（1 mm）和TRNALYS（3μm）组合在充电缓冲液中，并在37°C amino上孵育15分钟。将EF-TU-FEF-TS（15μM）添加到混合物中，并在37°C下孵育5分钟以形成三元络合物。FPLC证实了成功的氨基酰化。

　　所有反应均在GTP再生系统的存在下进行。用MFK mRNA（Biotin-5'-CAA CCU AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CCC UUA GAG GAG CAA UCG AUC AAA GUC AAA GUC AAA GUC AAA GUC AUC-3''）和p位点中的fmet-Trnafmet制备了大约3μM的起始复合物。mRNA核苷酸位置40对应于+1位置。将起始复合物与含有phe-trnaphe（约1.6μm）的三元络合物在37°C下孵育5分钟，以形成前易位复合物。将PRE络合物与GTP结合的EF-G（300 nm）的亚化学计量浓度在37°C下孵育10分钟，以形成延伸器后的转运后复合物（p位点FMET-PHE-TRNAPHE）。将其他试剂添加到混合物中，以使溶液中的无氨基酰胺无tRNA。在TLA-100.3转子（Beckman）中，在437,000g的37％蔗糖垫上将伸长量的配合物在4°C的37％蔗糖垫上打沉淀，以去除EF-G和Deacyl-TRNA。将沉淀的伸长膜复合物重悬于缓冲液A中，最终浓度为9μm，并进行闪光。

　　将含有FMET-PHE-TRNAPHE的延伸器后复合物用1 mM GTP融化，并在缓冲液B中稀释，最终浓度为2μM核糖体。为了制备易位中间样品，将SPC（INT1）或梭酸（INT2）添加到稀释缓冲液中。SPC以最大最大抑制浓度（IC50）用于易位抑制作用（3 mM）51。以近饱和浓度（400μm）13,52使用镰刀二酸。将延伸器柱配合物与Lys-Trnalys三元络合物（最终2μm）在25°C下孵育约30 s，以填充一个位置。将所得的伸长量的Pre pre络合物（p site trnaphe； a site fmet-phe-lys-trnalys）直接添加到冷冻EM网格（pre）中，或在没有SPC（INT1）或夫妻酸（INT2）或夫妻酸（INT2）的情况下与EF-G（最终）或f菌酸（INT2）的存在在5 – 10的情况下与EF-G（最终）或cride cried cried cried cried大约在crie cried off cried（pre）。

　　使用Vitrobot Mark IV IV烟冻式装置（Thermo Fisher Scientific）制备冷冻EM网格。对于每个实验，将3μl样品应用于量子R 1.2/1.3孔碳CU 300元（INT1和INT2）或AU 300元网格（预后和后）网格，该网格使用Solarus II Plasma II清洗系统（GATAN）进行了20 s。将网格在湿度（6 s; blot Force -5）之前在95％的湿度下在10°C的玻璃体室中孵育10 s，并将冻结在液态乙烷中。

　　如前所述13,45，用5'-Biotinylated mRNA底物编程的核糖体在A位置中显示Pos-bond-beT-tRNAfmet并在A位置显示密码子UUC的核糖体被固定在钝化的盖玻片上，如前所述13,45。然后将核糖体与三元复合物一起孵育2分钟包含A位置FMET-PHE-TRNAPHE，P-SITE tRNAFMET和LD550标签的US13和LD650标签的UL1。为了启动易位，通过停止流量注射，将具有1 mM GTP或1 mMGTPγS的EF-G传递到流量细胞中。所有SMFRET实验均在25°C下进行。然后，使用家居建造的总内内部反射显微镜53记录FRET信号的时间进化，并在0.1 kW cm-2下以40或400毫秒的时间分辨率在0.1 kW cm-2下使用激光（532 nm）照明。从录制的电影中提取供体和受体荧光强度，并使用MATLAB R2015B中实现的自定义软件计算了FRET效率轨迹。根据以下标准选择FRET痕迹进行进一步分析：一个灾难性的光漂白事件；至少8：1信噪比噪声比率和6：1信噪比/噪声比；少于四个捐助者 - 荧光团闪烁事件；供体和受体之间的相关系数<0.5。使用隐藏的马尔可夫模型理想化方法（v.3.7.0）53中实现的隐藏马尔可夫模型理想化方法分析了所得的SMFRET痕迹。在所有理想化中，都允许所有州之间的过渡。US13用于肽基TRNA FRET的模型具有四个状态（FRET值：0.14±0.04; 0.30±0.03; 0.50±0.05; 0.75±0.06）;US1至UL1 FRET的模型具有三个FRET状态（FRET值：0.73±0.05; 0.48±0.08; 0.27±0.04）。为了比较从理想化的FRET痕迹的不同条件下的易位动力学，我们在到达后的到达时间内构建了归一化累积分布，该分布定义为13的0.50 fret状态，用于peptidyl-tRNA信号，并将US13至UL1信号的0.27 fret状态和0.27 FRET状态。

　　使用配备有K3直接电子检测器的Titan Krios G3i（Thermo Fisher Scientific）透射电子显微镜收集冷冻EM数据，并使用后柱GIF（能量过滤器）。K3增益参考是在数据收集之前获得的。使用Serialem软件（v.3.7.1）54使用图像移位协议（每九个孔中的一个散焦测量）进行数据收集。电影以105,000×的放大倍率为10.5μm至-1.5μm的偶焦值记录，对应于APO PE，POST，POST，POST和INT1结构的样品水平上的像素大小为0.826Å（超级分辨率0.413Å）。在2.4 s暴露期间，收集60帧（每帧0.04 s，每帧1.4596 E- E 1.4596 E-），总剂量约为每Å287 e-2。第一帧被丢弃。运动校正是在原始的超分辨率电影堆栈上进行的，并使用MotionCor2 Software进行了双重校准。55。以82 kX的放大倍数（每个像素1.06Å；超分辨率为0.53Å），总剂量约为70 e-每Å2。使用CTFFIND456确定CTF参数，并在Relion57（v.3.1）和CryoSparc58（v.3）中进行完善。在采摘粒子之前，良好的显微照片是通过功率谱进行资格的。使用CISTEM59挑选颗粒，并将坐标转移到属性（有关分类和细化的详细信息，请参见下文）。锐化和局部过滤的图用于帮助建造模型。使用VOP量表函数将电子密度图值标准化为UCSF嵌合体中的平均值= 0和标准偏差（σ）= 1。有关数据收集参数和模型构建统计信息的详细信息，请参见图2和补充表1。

　　在绘制粒子之前，良好的显微照片由功率谱（7,183个电影堆栈）进行资格。在CISTEM（659,777个颗粒）中挑选颗粒。在依据中提取（四倍binned）后，在CryoSparc中进行了几轮2D分类。在CryoSparc中构建了一个初始结构，然后用作Relion的3D分类的参考。然后重新提取了来自良好类（534,348个颗粒）的颗粒（534,348个颗粒）（双重bin），并在依赖中进行了完善，然后将ctfrefine和3D分类分为10个类。第4类具有无息的SSU（225,423个颗粒），而9类具有旋转的SSU（160，291个颗粒）。无息的SSU和旋转的SSU类分别进行3D细化，并使用3D分类进一步分为5个类。从无座的粒子的3D分类中，两个类包含经典的A和P位点TRNA，它们合并（109,769个颗粒），并通过3D细化（未添加）运行，得出前C结构。从旋转颗粒的3D分类中，一个类别显示了杂交P位置tRNA和经典A位点tRNA（前H2*; 33,330颗粒）的证据。来自无息3D分类的两个类别包含A位置tRNA的弱密度，它们合并（126,699个颗粒），并用A位掩膜进一步分类以提高配体密度。从A个位点tRNA的这种集中分类中，一个类别包含杂化脱酰基-TRNA和肽基-TRNA（PRE-H1； 51,685个颗粒）。经过3D分类后，将PRE-C，PRE-H2*和PER-H1类别的粒子重新提取，并根据金色标准标准重新提取，并根据金标准进行精制。

　　在采摘粒子之前，良好的显微照片由功率谱（2,834个电影堆栈）进行资格。在CISTEM（439,422个颗粒）中挑选颗粒。在收藏中提取（四倍）之后，将粒子在相关中进行了完善，然后将ctfrefine和3D分类分为10个类。五个类具有无息的SSU，这些SSU被合并（120,513个颗粒），在Relion中重新提取并精制（双重二重）。为了提高电子站点tRNA的密度，我们使用电子站点掩模进行了聚焦的3D分类。这产生了两个具有固体E位置tRNA密度的类，它们合并为（34,688个颗粒），并根据完整的像素大小重新提取，并根据Apo后复杂结构的金标准标准进行精制。

　　在采摘粒子之前，良好的显微照片由功率谱（11,916个电影堆栈）进行资格。在CISTEM（1,001,439个颗粒）中挑选颗粒。在依据中提取（四倍）之后，在CryoSparc中进行了几轮2D分类。然后将来自良好2D类（652,128个颗粒）的粒子进行改进，并使用3D分类分为6类。一个类具有旋转的SSU（184,857个颗粒），该SSU被完善并进一步分为8个类。这些类别之一包含EF-G（33,688个颗粒）。将这些颗粒用完整的像素大小重新提取，并根据INT1复合结构的金标准标准进行精制。

　　在采摘粒子之前，良好的显微照片由功率谱（6,651个电影堆栈）限定。在CISTEM（1,259,307个颗粒）中挑选颗粒。在依据中提取（四倍）之后，在CryoSparc中进行了几轮2D分类。然后将来自良好2D类（639,984个颗粒）的粒子进行完善，并将3D分类分类为6个类。一个类具有具有EF-G结合的旋转的SSU（113,540个颗粒），该SSU与此相关。为了提高TRNA和EF-G的占用率，我们使用配体掩码进行了重点的3D分类，分为三个类别。一类包含两个TRNA和EF-G（33,008个颗粒）。将这些颗粒用完整的像素大小重新提取，并根据INT2复合结构的金标准标准进行精制。

　　50S（启动模型PDB ID：4YBB60），30s（启动模型PDB ID：4YBB60），TRNALYS（启动模型PDB ID：5E8161），TRNAPHE（启动模型PDB ID：4WRO62），EF-G（ef-g-g），EF-G（启动模型PDB ID：4V9O32）和启动型号PDB/ribos p. ribos pet l7/l7/l7 l7 l7 l7 l7 l7 l7 l7;将1CTF63）安装到EM图中，并通过COOT（V.0.9.4.1）64中的手动模型构建的迭代回合进行完善，使用Erraser65和使用Phanix（V.1.1.19-4092）的RNA进行了改进和真实空间的细化66。mRNA核苷酸40对应于+1位置。新生的肽和mRNA是在Coot中从头建造的。ATP分子在23（1）U369和A404和（2）U40和U441之间进行建模。在LSU E网站上还为ATP建模了Pre-C。将多胺建模为管状的未分配密度，以显示适当的周围电化学环境。值得注意的是，腐烂分子是在前H2*的E位点建模的，而前H1近端为16S A790。如下所示，对Trnaphe和Trnalys U47的ACP3修改也对：将3-氨基-3-羧基丙酰基部分添加到尿液单磷酸的嘧啶环的位置3位，保存为新型修饰的RNA核苷酸ACP3U，该核苷酸ACP3带有3AU。使用phenix.elbow67产生了改进的约束。使用phenix.validation_cryoem68验证模型，并具有内置的MolproBity69评分。有关更多信息，请参见补充表1。在每个复合物中，我们还观察到了Shine – Dalgarno样/抗新的 - dalgarno Minihelix的碎片电子密度，该微型是在Pre-C中建模的，以及核糖体蛋白US1。

　　分子图形和分析是用UCSF Chimera70或Chimerax进行的，该资源是在NIH P41-GM103311的支持下，在加利福尼亚大学旧金山的生物计算，可视化和信息学资源开发。除非另有说明，否则使用Relion Refine3d的未共看图用于图像图像，阈值σ= 6。使用MAP中的拟合和距离工具在UCSF嵌合体中进行角度和距离测量。除非另有说明，否则使用在LSU核心上对齐的结构和模型制备所有数字。The LSU core used was simulated 3 Å density of high-resolution ribosome crystal structure PDB ID: 4YBB60 in UCSF Chimera (molmap) with the following mobile elements omitted: uL5, uL6, uL9, uL10, uL11, uL120, uL31, H34 (709–723), A-site finger (ASF; H38; 866–906), theL11茎（1045–1112），H69（1908–1925），L1茎（2093–2198），H83/84（2297–2318），SRL（2651–2667）和5s。使用蛋白质和核酸的媒人工具在UCSF嵌合体中制备了均方根偏差（R.M.S.D.）的热图。使用UCSF嵌合体中的测量旋转工具生成旋转角度和轴图。使用带有3Å半径的色带工具对电子密度进行着色。数字是在Adobe Illustrator（Adobe）中编译的。补充表2中的mRNA扭结在mRNA位置+3（decyl-tRNA密码子的最后一个核苷酸的C1'和+4（肽基-TRNA密码子的第一核苷酸的C1'）之间测量。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。