如先前所述57表示人类组蛋白表达并纯化。在20 mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液中以等摩尔比以等摩尔比的比率混合冻干的组蛋白，其中含有7 M盐酸鸟嘌呤盐酸盐和20 mM 2-羟基乙醇。将样品与10 mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液透析，其中含有2 M NaCl，1 mM EDTA和2 mM 2 mM 2-甲醇。通过尺寸排斥色谱法（SuperDex 200; GE Healthcare）纯化所得组蛋白复合物。对于Myc-Max TR-FRET实验，使用位于位置的诱变，使用引入H2B中的T122C突变体制备H2B-Biotinyl化的八聚体。纯化的H2A-H2B（T122C）复合物（46μM）与Biotin使用558μMEZ-link MEALIMIDE-PEG2-生物素（Thermo Fisher Scientific）在10 mM Tris-HCl（pH 7.5）中（pH 7.5）缓冲，包含2 M Nacl，1 mm Edta和1 mm Tecep，在室内温度下，通过添加2-甲醇，将反应停止，然后将样品与含有2 M NaCl，1 mM EDTA和5 mM 2-MM cercapto乙醇的10 mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液透析。如先前所述58进行了H2A -H2B（T122C – BIOTIN）复合物，H3.1 – H4复合物和组蛋白八聚体的重构。

　　通过渗入（Thermo Fisher Scientific）PCR扩增产生了中型至大规模单个核小体净化的DNA。通过Mono Q柱（GE Healthcare）纯化所得的DNA片段。将所有纯化的DNA浓缩，并在10 mM Tris-HCl pH 7.5中储存在-20°C下，直至使用。还使用PCR和荧​​光标记的引物（Sigma Aldrich，请参见补充表1）生成用于SMTIRF实验的DNA。

　　在2 m kCl的情况下，将DNA和组蛋白八聚体复合物以1：1.5摩尔比混合。通过以1：1.5：3摩尔比（DNA：H2A – H2B：H3.1 – H4）孵育组件来进行H2A -H2B（T122C – BIOTIN）–H3.1 – H4复合物的重构。将样品与重折叠缓冲液（RB）高（10 mM Tris-HCl pH 7.5，2 M KCl，1 mM EDTA和1 mM DTT）透析。使用RB低（10 mM Tris-HCl（pH 7.5），250 mM KCl，1 mM EDTA和1 mM DTT）的蠕动泵在4°C下，KCL浓度逐渐从2 m降低到0.25 m。将重构的核小体在55°C（或LIN28-E和POR内源性核小体序列）下孵育2 h，然后在单声道Q 5/50 ION-EXCHANGE梯度（GE Healthcare）上纯化，并将其透射到20 mm Tris-Hcl pH 7.5和500 mm tce中，并透析至20 mm Tris-Hcl pH 7.5和500 mm tce。将核小体浓缩并在4°C下储存。

　　遵循先前建立的方案59制备核小体。通常，将1 µg标记的生物素化DNA与重组的重组，重组的人组蛋白八聚体以等摩尔比在30 µl TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mm EDTA）中补充，并补充了2 M KCl。然后，将样品用Tris-HCl pH 7.5，1 mm EDTA在透析按钮中透析从2 m kCl到10 mm kcl。收集样品并在4°C下以20,000克离心10分钟，并将上清液放在冰上。为了确定NCP组件的质量，在90 V时在90 V时以0.5×TBE运行5％的丙烯酰胺本地页面90分钟。使用Chemidoc MP（Biorad）拍摄图像。

　　将人类全长OCT4（残基1-360）亚克隆到包含N末端链球菌II标签的PAC衍生的矢量中。将其他N末端EGFP标签和C-末端分类酶-6×His TAG（LPETGGHHHHHH）融合在框架中以改善纯化。GFP – OCT4在使用BAC-TO-BAC系统（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific）的4-L培养物中表达了4-L培养物。在感染后两天在27°C培养细胞，重悬于裂解缓冲液中（50 mM Tris-HCl pH 8.0，1 M NaCl，100μM苯基甲基磺酰基氟化物，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）和250μmTCEP）和250μmTCEP）和lysication。收集上清液，并通过在N末端用链球链球链球菌色谱（IBA）纯化蛋白质，然后在N末端纯化蛋白质，然后通过肝素离子 - 交换色谱（GE Healthcare）纯化。GFP – OCT4通过GF缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4，150 mM NaCl，5％甘油，500μMTCEP）中的尺寸排斥色谱（SuperDex 200; GE Healthcare）进一步纯化。浓缩纯化的蛋白质并在-80°C下储存。

　　人MYC（UniprotkB P01106，残基351-437）和人Max（UniprotkB P61244，22–102）均被亚克隆为Escherichia Coli中的共表达PET28衍生的载体。MYC包含一个N末端6×他的标签，Max仍然没有标记。在4 L lb培养基和各自的抗生素中有氧细胞生长。将培养物以1：100（v/v）的比例接种，并在隔夜培养物中接种，并在37°C下孵育。在600 nm（OD600 nm）为0.6-1的光密度下，基因表达用0.5 mM IPTG（最终浓度）诱导。将培养物进一步在18°C，200 rpm过夜或37°C，200 rpm孵育3小时。通过在4°C离心10分钟通过离心收集细胞，并在液体氮气在-80°C下进行休克冻结后储存。将颗粒重悬于裂解缓冲液中（50 mM Tris-HCl pH 8，500 mM NaCl，3 mM咪唑，10％（V/V）甘油和1倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）和细胞通过超声层破坏。将上清液（5 mL，GE Healthcare）进行Histrap HP柱（5 mL，GE Healthcare），然后通过SEC缓冲液（50 mM HEPES PH 8，500 mM NaCl，10％（V/V）甘油醇）中的尺寸 - 排斥色谱法（SuperDex 200增加10/300 GL; GE Healthcare）进一步纯化。浓缩纯化的蛋白质并在-80°C下储存。对于SMTIRFM实验，在Max的C末端设计了一个SpyTag，并将其亚克隆到PET28载体中（Twist Biosciences）。通过位置的诱变产生了间谍标记的Myc-Max突变体（请参见补充表1），并按照相同的方案纯化了野生型和突变蛋白。

　　将人类最大（残基2–160）亚克隆到具有链球菌II标签的PET28衍生的载体中，用于在大肠杆菌中表达。如MyC-Max所述进行蛋白质表达。将同二聚体在50 mM Tris-HCl pH 8、500 mM NaCl，3 mM咪唑，10％（v/v）甘油和1倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）中进行重新悬浮，并通过超碳化而破坏细胞。将上清液进行链球肌蛋白表蛋白sepharose色谱柱（5 mL，GE Healthcare），然后在SEC缓冲液（50 mM HEPES pH 8，500 mm NACL和10％（V/V/v）glycerol中进一步纯化尺寸 - 排斥色谱（SuperDex 200增加10/300 GL; GE Healthcare）。

　　小鼠时钟（Uniprotkb O087850）BHLH PAS-AB（残基26-395）和BMAL1（Uniprotkb Q9WTL8）BHLH PAS-AB（残基62-441）被克隆到单独的PfastBac vectors中，如前所述。通常，将1-2升的时钟-BMAL1 BHLH-PAS表达昆虫细胞（Spodoptera frugiperda或Hi5）沉淀，并重悬于其缓冲液A（20 mm磷酸钠缓冲液（20 mm磷酸钠缓冲液）pH 8，200 mm nacl，15 mm imidazole，10％（v/v/v/v/v/v/v），v/v/v/v/v/v/v/v/v/v/v/v/v/v/v/v/v/v），1％（v/v）x.1％（1％）（奈克斯奈克;β-马er乙醇）。细胞通过细胞中断和随后的超声处理3分钟（15 s开，30 s关）裂解。通过以45,000 rpm离心45分钟来阐明裂解物。Ni-NTA亲和力纯化是在5 mL Histrap FF（GE Healthcare）上进行的。在缓冲液A中洗涤14列后，该色谱柱用6.5％的缓冲液B（20 mM磷酸钠缓冲液pH 7.5，200 mm NaCl，300 mM咪唑，10％（V/V）甘油和5 mmβ-甲醇）的3列量为3列量，在3列量中，均为Bufferunt in Buffere bluffunt Broupfunt Broupfunt byfore in 10-Coldect in 10-COLSER BOFFORD B。合并相关的馏分并在4°C下至少4小时。然后将络合物浓缩至5-10 mL，并用肝素缓冲液A（20 mM磷酸钠缓冲液pH 7.5、50 mM NaCl，2 mM Dithiothreitol和10％（v/v）甘油）重新降低至50 mL，并加载到HITRAP HITRAP HEMAP HP亲和力（GE Healthcare）上。用上述缓冲液的5 cV洗涤后，将圆柱用另外3 CV洗涤25％肝素缓冲液B（20 mM磷酸钠缓冲液pH 7.5、2 m NaCl，2 mM dithiothreitol ABD和10％（v/v）甘油），然后用BufferB by在8 cV梯度上洗脱，然后用缓冲液洗脱。通过SuperDex 200凝胶过滤色谱法（GE Healthcare）纯化相关的馏分中20 mM HEPES缓冲液pH 7.5、125 mM NaCl，5％（V/V）甘油和2 mM TCEP。Clock-BMAL1突变体是通过定点诱变产生的，并按照所述方案进行纯化。对于DREX实验，BMAL1 BHLH-PAS-AB基因块（Twist Biosciences） 用C末端的间谍合成，并用N端的标签克隆到PAC8表达载体中，并与上述他的Clock BHLH PAS-AB纯化，如上所述。

　　如前所述61，对时钟和BMAL1 BHLH构建体的纯化进行了。简而言之，将小鼠BMAL1 BHLH残基73-135和小鼠时钟BHLH残基克隆到PET28衍生的载体（Twist Biosciences）中，每个载体都有在C末端进行的额外的色氨酸，以允许紫外线检测。使用Histrap HP柱（5 mL，GE Healthcare）分别表达蛋白质并分别纯化。亲和力纯化后，将时钟BHLH和BMAL1 BHL的等摩尔比在冰上混合大约一小时。使用S75 10/300 GL柱在纯化后收集异二聚体峰。

　　为了表达和纯化人类规范BAF（CBAF），将野生型全长dpf2/baf45d（Uniprot ID：Q92785）克隆在病毒转移质粒phr-cmv-cmv-cmv-teto2_3c-twin-strep_ires-emgfp（添加bair bair bair n.1184）中综合体的内源性亚基。通过慢性病毒转导expi293tm哺乳动物细胞（Thermo Fisher Scientific）62并成功感染细胞（通过与控制内部核糖体进入位点（IRES）控制的转基因相同的mRNA（通过荧光激活细胞分类（面部），从相同的mRNA表达GFP），产生稳定的细胞系。然后，当细胞密度达到每毫升6×106细胞和每毫升8×106细胞之间的值时，将细胞缩放并收集。基于先前建立的内源性CBAF纯化方案进行核提取33，并进行了一些修改。首先，将细胞颗粒重悬于低渗性缓冲液（10 mM HEPES pH 8，10 mM KCl，1.5 mM MGCL2，1 mM DTT和Sigmafast蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中，并均质化。然后将匀浆离心（30分钟，4,000g，4°C），并确定填充的核体积（PNV）。将沉淀物重悬于2 PNV的萃取前缓冲液（20 mm HEPES pH 8，100 mm kcl，1.5 mm mgcl2，0.2 mm EDTA，0.1％NP-40，1 mm DTT和1 mm DTT和Sigmafast Fast Fast Fast蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中，悬浮液中心为中心（10分钟（10分钟）（10分钟）。然后将沉淀重悬于0.5 PNV的低盐缓冲液中（20 mM HEPES pH 8，20 mm KCl，10％甘油，1.5 mM MGCL2，0.2 mM EDTA，1 mM DTT和1 mm DTT和Sigmafast Fastease蛋白酶抑制剂鸡尾酒），随后是0.5 phrt phrt Fuffer（20 MMMMMMMMMMMMMMMMMMM MOLM MOLM MOLM MOLT Heper（MOLM MOLT）。KCl，10％甘油，1.5 mM MGCL2，0.2 mm EDTA，1 mm DTT和Sigmafast蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。将溶液在旋转下在4°C下孵育1小时，然后在25,000 rpm下离心1小时。上清液依次过滤1.2-， 0.45和0.2毫米过滤器，并在5 ml链球菌 - tactin XT 4Flow高容量柱（IBA Lifesciences）上加载。使用1 ml单声道Q 5/50 GL色谱柱（GE Healthcare）进一步纯化蛋白质，然后使用超级糖6升高10/300 GL柱（GE Healthcare），并在20 mM HEPES pH 8，100 mM KCl，0.5 mM MGCl 2中洗脱，0.5 mM MGCL2，5％甘油和0.5 mm TCEP。

　　截短的人CGA（155-522）野生型蛋白被表达并从大肠杆菌菌株BL21（DE3）纯化为先前的降低34。

　　在先前建立的方案63,64之后，纯化了间谍蛋白（Spycatchers50c）的突变版本。SpyCatchers50c在4°C下与DTT（8 mm）孵育1小时。使用S200 16/60凝胶过滤柱（GE Healthcare）除去DTT，其中包含50 mm Tris-HCl pH 7.3和150 mm NaCl的缓冲液。将JF549-Maleimide（Tocris）溶解在100％DMSO中，并与间谍捕获器混合，以达到JF549-Maleimide的四倍过量。在真空干燥器中将间谍捕获器在室温下标记3小时，并在4°C下储存过夜。在50 mm Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl，250μmTCEP和10％（V/V）甘油，浓缩的，浓缩的，液态氮气中的液氮气中，在S200 16/60凝胶过滤柱上与自由染料分离出标记的spycatcher。纯化的野生型MYC-MAX-SPY，MYC-MAXY73A-R76A – SPY和MYCS405Y-A408R-MAX-SPY与JF549-SPYCATCHER混合，以5：1摩尔比为5：1摩尔比，在室温下在液体温度下孵育1小时，在液态氮中冷冻。

　　如前所述进行测量65。简而言之，使用配备CFI APO TIRF 100×油浸入物镜（NA 1.49），Andor IXON EM-CCD摄像头和TIRF IMLUMINATOR臂的Nikon Ti-E倒荧光显微镜进行了客观型SMTIRF。使用连贯的OBIS 640LX激光（640 nm，40 mW）和相干OBIS 532LS激光（532 nm，50 MW）实现激光激发。对于所有SMTIRF实验，如前所述，制备流动通道，用500 µl脱气的超纯水（Romil）洗涤，然后用500 µL 1×T50（10 mM Tris pH 8，50 mm NaCl）洗涤，并记录了532 Nm和640 Nm兴奋的背景荧光。然后注入50微升0.2 mg ml -1中性素，并孵育5分钟，并使用500 µL 1×T50洗涤。然后，将50 pm的Alexa647标记的DNA或NCPS在T50中，用2 mg ml-1牛血清白蛋白（BSA，Carlroth）流到通道中以进行固定。使用成像缓冲液（20毫米Tris-HCl PH 7.5，150 mm NaCl，10％（V/V）甘油，0.005％（V/V/V/V/V/V/v），五百个1×T50用于洗涤未结合的DNA，使用成像缓冲液（20 mm Tris-HCl pH 7.5，150 mm NaCl，10％（V/V）甘油，0.005％（V/V/V/V/v）tween-20，1 mm trolox，w 3.2％，3.2％，w luce gluce glox glox，w 3.2％，w luce gluce glox glox glox glox，w.2米（v/v），1-2 nm JF549标记的myc-max。葡萄糖氧化酶/过氧化酶氧气清除系统和1 mg ml-1 bsa），电影在TIRF照明中以2-5 Hz的形式记录，在远红和绿色的照明之间交替（1：200帧）。

　　如先前所述65进行了一些调整，进行了单分子痕量提取和痕量分析。电影是使用ImageJ中的滚球算法对背景进行校正的。使用自定义的MATLAB（MATHWORKS）脚本检测到DNA位置。将图像对齐以补偿阶段漂移。在鉴定出的DNA峰的2像素半径内提取荧光强度（在橙色通道中）。单个检测拟合了2D高斯功能，以确定与固定的DNA共定位。从进一步分析中排除了超过PSF宽度为400 nm的PSF宽度，与DNA位置的250 nm偏移或强度大于5,000个计数。通过逐步找到算法66分析单个痕迹，然后分析阈值。重叠的多个结合事件被排除在分析之外。对于每部电影，累积直方图是从检测到的明亮时期（TBRIGHT）构建的，这些明亮时期（Tbright）对应于绑定的myc-max分子，以获得居住时间和黑暗时代和黑暗时代（TDARK）以获得速率常数，通常包括来自大约100个单独痕迹的数据。与单个DNA相对应的痕迹的累积直方图拟合了di-oper指数函数。

　　按照先前描述的一般协议，使用具有HIS标签的MYC-MAX（受体，ULIGHTα-6×His抗体）和供体生物素化核小体（Lance EU-W8044链霉亲和）用His标记的MYC-MAX（受体，ULIGHTα-6×他的抗体）进行Lance Tr-Fret分析。为了分析他与NCPSHL+5.1核小体的结合，使用MaleImide化学将生物素掺入H2B（残基T122）中（另请参见“人类八聚体组蛋白的表达，纯化和重构”方法。对于所有其他TR-FRET实验，将生物素掺入核小体中，使用PCR期间的E-Box基序近端的生物素化引物以产生DNA片段（microsynth）。在MYC-MAX的正向滴定中，将其浓度的浓度增加（将1:20与Ulightα-6×His抗体混合）被添加到1 nm生物素化核小体的混合物中，在含有20 mm Tris-Hcl，pH 7.5，125或75 mm 75 mm 75 mm gly gryse eu-streptavidin，2 nm lance eu-stretpavidin中NP-40，0.01％CHAPS，5 mM DTT和100μgml-1 BSA（T75）。在TR-FRET测量之前，将反应在室温下孵育5分钟。对于Clock-BMAL1进行的竞争实验，将量增加的无标记的Clock-BMAL1 BHLH PAS-AB野生型和突变蛋白与预先形成的– MYC-MAX-核小体的复合物（625 nm His-MyC-Max：31.25 nm ulight：31.25 nm ulight）在T75中孵育。在337 nm处激发Europium荧光后，以75μs的延迟延迟了620 nm（Europium）和665 nm（Ulight）的排放，以减少背景荧光，然后使用Pherastar FS Micropoplate读取器（BMG Labtech）记录30分钟的30分钟数据点。通过计算620：665 nm的比率提取每个数据点的TR-FRET信号。通过减去在没有核小体的情况下观察到的信号来校正直接受体激发的信号。将所得的原始信号拟合到Prism 7（GraphPad）中1的BMAX值。 假设使用一个位点特异性结合曲线对TF-核小体底物进行等摩尔结合。

　　为了测量核小体或核小体复合物，将显微镜盖板用10 ul的聚赖氨酸处理30 s，用milli-Q冲洗并在空气流下干燥。在质量光度法测量之前，在MP缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM KCl和0.5 mM TCEP）中进行蛋白质稀释，并以1：6的比例将核小体– TF复合物混合，并在室温下孵育30分钟。数据是在Refeyn Onemp质量光度计上获取的。首先，将18μL的MP缓冲液引入流动室，并确定焦点。然后将2μl的蛋白质溶液添加到室内，并记录60或90 s的电影。核小体（NCPSHL+5.8，NCPSHL −6.2，NCPPOR1和NCPSHL+5.8-TANDEM）和Clock-BMAL1 BHLH PAS-AB在20 nm（最终浓度）分别测量，然后分别在10和60 nm的复合物中测量。每个样品至少独立测量两次（n = 2）。根据使用BSA和甲状腺球蛋白创建的标准曲线，使用Refeyn Discover 2.3对所有获得的电影进行处理，并使用Refeyn Discover 2.3分析分子质量。

　　将Cy5标记的核小体（30 nm）与Clock-BMAL1 BHLH PAS-AB野生型或突变体（0-500 nm），Clock-BMAL1 BHLH PAS-AB（250 nm）混合，在存在和不存在增加浓度的CGA（18.75-150 nm）或CGAS（仅CGAS）或CGAS（75 nm）的情况下（75 nm）（75 nm）。

　　对于BAF竞争测定，在升高的时钟-BMAL1（125 nm，250 nm和500 nm和500 nm和500 nm）或COLCH-BMAL1仅在Clock-BMAL1（125 nm，2500 nm和500 nm）的情况下，将含有E-BAF（100 nm），BAF（100 nm）的未定分核小组（30 nm）与BAF（100 nm），BAF（100 nm）混合在一起，将其与BAF（100 nm），BAF（100 nm）混合在一起。（20 mM Tris-HCl pH 7.5，75 mM NaCl，10 mM KCl，1 mM MGCL2，0.1 mg ML-1 BSA和1 mM DTT），并在室温下孵育约一个小时。孵育后，通过0.5×tge缓冲液（12.5 mm Tris碱基，96 mm甘氨酸和500μmEdta）和带有litysssy的liety（litysssey the the the of Cositantion oty anty the otyssse contraima）在0.5×tge缓冲液中通过6％的非定性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：BIS = 37.5：1）对样品进行分析在SYBR金核酸凝胶染色（Invitrogen）中染色后的9500。使用Empiria Studio v.2.3软件分析了荧光标记的核小体和DNA结合曲线。

　　通过在整个修改的W601中以1-bp的间隔，用规范共识Jaspar E-Botif（GGCACGTGTC，MA0819.1，MA0059.1）代替Widom 601序列（GGCACGTGTC，MA0819.1，MA0059.1）来生成DNA序列。将SHL+5.1处的原始Widom 601定位序列中存在的E-Box基序被突变（请参见补充表1）。W601-E-e-box变体DNA序列由ECORV位点和适配器序列两侧，并从扭曲生物科学中排序为基因片段。将单个基因片段悬浮，平均合并并用Ecorv-HF（NEB）切割，并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN）从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段（153 bp）。W601-E-e-box DNA池用过量的W601 DNA（1:30摩尔比；池：601）升高。如上所述，将核小体池组装并纯化。

　　Sige-seq是在25之前进行的，并进行了一些修改。For SeEN-seq EMSAs, nucleosomes (100 nM) were incubated with a 62.5 nM final concentration of MYC-MAX bHLH LZ (human MYC residues 351–437, human MAX residues 22–102) or 250 nM of CLOCK-BMAL1 bHLH PAS-AB (mouse CLOCK residues 26–395, mouse BMAL1 residues 62–441) in 20-μl reactions包含20 mM Tris-HCl pH 7.5、75 mM NaCl，10 mM KCl，1 mM MGCL2、0.1 mg ML-1 BSA和1 mM DTT。为了补偿Clock-BMAL1 BHLH构建体中DNA结合亲和力的损失，与含PAS构建体的浓度相比，Clock-BMAL BHLH SEED seq进行了浓度高约五倍（1,250 nm）。将反应在室温下孵育约1小时，并在0.5×TGE凝胶中加载到6％的非换性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：BIS = 37.5：1）中，并运行1 h（150 V，室温，室温）。然后用SYBR金核酸染色（大约10分钟，Invitrogen）将凝胶染色。使用C300凝胶doc uv-transilluminator（Azure Biosystems）对对应于TF结合和未结合的核小体复合物大小的DNA带进行成像并切除。将凝胶切片与丙烯酰胺凝胶提取缓冲液（100μL，500 mM乙酸铵，10 mm乙酸镁，1 mM EDTA和0.1％SDS）孵育，并加热（50°C，30分钟）。加入H2O（50μL）和Qiaquick凝胶提取套件QG缓冲液（450μL，Qiagen），并加热样品（50°C，30分钟）。短暂旋转样品，并将含有DNA片段的上清液转移到Qiaquick凝胶提取自旋柱中。根据制造商的说明纯化样品，并在H2O（22μL）中洗脱，并通过Qubit试剂（Thermo Fisher Scientific）对DNA进行定量。纯化的DNA（20μL，约2-20 ng DNA）用于NGS文库制备（Nebnext芯片– Seq，E6240S），具有双索引（E7600S），不超过10个循环PCR扩增。纯化的测序库是通过量子试剂定量的 （Thermo Fisher Scientific）和图书馆的大小在Bioanalyser平台（Agilent）上检查，然后在Illumina Miseq或NextSeq平台（300 bp配对）上进行测序。测序片段使用默认设置的BioConductor package Quasr映射到W601序列和含E-Box-Motif的变体（153 bp），它们内部使用Bowtie进行bowtie进行读取Mapping68。与所代表的每个构建体量子qcount量化了与每个构造对齐的序列读数的数量。通过确定TF结合和未结合的核小体馏分中每个601-E-box变体之间的折叠变化来计算可见序列富集。这些折叠变化代表所有位置之间的相对亲和力差异。在所有重复中，我们都能够捕获每个基序位置，这表明电子盒基序不会显着影响核小体稳定性。

　　将TF和核小体在MS样品缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl和500μMTCEP）中以1.5：1的比率混合，并在室温下孵育约1小时。同时，将二核苷二酰亚胺磺酸（DSSO）XL试剂（Thermo Fisher Scientific，A33545）的等分试样变热至室温，并通过摇动5分钟，400 rpm稀释至无水DMSO中的100 mm储备浓度。孵育后，将样品转移到浓度器（Amicon Ultra，Merck Millipore，10,000 MWCO）中，加入DSSO，并在10°C下在10°C下孵育1小时，同时在400 rpm发抖。通过添加1 M TRIS pH 6.8（50 mm终浓度），在室温（400 rpm）下再孵育一个小时，从而淬灭多余的交联链链接器。将样品离心（5分钟，14,000克），以除去50 mM HEPES中的XL试剂和400 µL新鲜8 M尿素，pH 8.5用于涂抹和洗涤。此步骤被重复两次。接下来，添加还原/烷基化缓冲液（分别为50 mM TCEP，100 mM 2-氯乙酰胺）（分别为5 mm和10 mm终浓度），并在400 rpm摇动时将样品孵育30分钟。将其在14,000g处离心5分钟，并添加400 µL新鲜8 M尿素进行变性和洗涤。样品以14,000克再次离心5分钟。将此步骤重复两次，最后离心步骤为15分钟，而不是5分钟，将样品集中到约30 µL左右。添加LYS-C（0.2 µg µl-1汤，1：100酶与蛋白质比），并在室温下在室温下消化样品1.5 h。将样品用50 mM HEPES稀释四倍，pH 8.5。然后，加入胰蛋白酶（0.2 mg ml -1汤，1：100酶与蛋白质比），并在400 rpm摇动时将样品在37°C下过夜过夜。第二天加入了胰蛋白酶和乙腈的其他等分试样，最终浓度为5％，并将样品在37°C下再孵育4小时，在37°C，再孵育4小时。 摇动400 rpm时。将样品转移到Eppendorf管中，加入TFA（最终浓度为1％），并将样品短暂超声，并在20,000 g时旋转5分钟。使用Preomics IST-NHS试剂盒对上清液进行脱盐，并集中在SpeedVac中。在2％乙腈中用0.1％TFA重构样品。

　　通过LC -MS通过两种方式分析样品：

　　对于每个实验，以60k分辨率在Orbitrap中测量了肽MS1前体离子。在任何一种情况下，都启用了MS高级峰值测定（APD）特征，并且那些具有3至8之间指定电荷状态的肽进行了CID-MS2片段化（25％CID碰撞能），并以30-K分辨率在Orbitrap中检测到片段。如果在离子TRAP中检测到的CID – MS2扫描中发现了唯一的质量差（ΔM）31.9721 DA（35％HCD碰撞能），则进行数据依赖性的HCD-MS3扫描。

　　使用sequest70数据库搜索线性肽（包括交联修改）和XlinkX69搜索以识别交联肽，对MS原始数据进行了蛋白质发现器v.2.5（Thermo Fisher Scientific）进行分析。MS2 fragment ion spectra not indicative of the DSSO cross-link delta mass were searched with the Sequest search engine against a custom protein database containing the expected protein components, as well as a database built of contaminants commonly identified during in-house analyses, from MaxQuant71, and cRAP (ftp://ftp.thegpm.org/fasta/cRAP), using the target-decoy search策略72。考虑了以下可变的交联修改：DSSO水解/+176.014 da（k）;DSSO TRIS/+279.078 DA（K），DSSO烯烃片段/+54.011 Da（k）;DSSO硫酸片段/+103.993 DA（K）以及氧化/+15.995 DA（M）。氨基甲米甲基/+57.021 DA（C）设置为静态修饰。选择胰蛋白酶作为裂解试剂，最多允许两个丢失的切割位点，肽长度在4或6和150之间，10 ppm前体质量耐受性和0.02 da碎片质量耐受性。使用PD中的Percolator节点进行PSM验证，目标FDR为1％。

　　Xlinkx V.2.0用于针对包含预期的复杂组件的自定义蛋白质数据库进行数据库搜索，以识别DSSO-CROSS连接肽和以下可变修改：DSSO HydroLysed/+176.014 DA（K）;氧化/+15.995 DA（M）。在Xlinkx得分高于40的Xlinkx评分以上接受交联链接到光谱匹配（CSM）。通过序列和链接位置分组的交联链接，并导出到XINET73格式中，以生成交联网络图。

　　将交联的链接映射到结构模型，其中包括Pymol和Chimerax插件XMAS74的内部脚本。XWALK用于计算溶剂可访问的表面距离75。

　　数据可通过具有标识符PXD033181的ProteOmeXchange76获得。

　　将核小体与摩尔过量的TF混合约100μl约100μl，并在室温下孵育30分钟（摩尔比：1：3：3，NCPSHL+5.1：OCT4：MYC-MAX：MYC-MAX; 1：1.5，NCPSHL，NCPSHL+5.8：MYC-MAX; MYC-MAX; MYC-MAX; MYC-MAX; 1：1.5，NCPSHL+5.8：1：3.8：3：3：1：3.8：3.8：3.8：3.8：3.8：compspsssl+5.8：compss;NCPSHL – 6.2：clock-bmal1; 1：3，NCPSHL+5.1：Max-Max;每个用于每个TF的TF基序的数量，TF过多，并且每个TF对核小体底物的相对亲和力。然后使用Grafix Method77对样品进行交联。对于Grafix交叉链接，将TF – NCP复合物分层为10％–30％（w/v）蔗糖梯度（20 mm HEPES pH 7.4，50 mm NaCl，1 mm MGCL2，10 mM KCl，10 mm KCl，0.5 mm TCEP），浓度增加（0 – 0.34％W/V）超速离心（Beckman SW40TI转子，30,000 rpm，18 h，4°C）。离心后，通过天然页面分析了从梯度的顶部收集100μl级分，并分析了峰分数。将峰分数组合在一起，并通过透析将蔗糖除去Grafix缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4、50 mM NaCl，1 mM MGCL2、10 mM KCl和0.5 mM TCEP）。通过测量260 nm的吸光度下的DNA浓度确定，将所得的样品用Amicon Ultra Ultra Ultra Ultra离心过滤器浓缩至约2-7μM核小体。浓度后，将3.5μl样品应用于Quantifoil孔碳网格（R 1.2/1.3 200英寸，量化微型工具）。在H2/O2环境中，在Solarus等离子体清洁剂（Gatan）中进行15 s的发光排放。将网格在玻璃体标记IV（FEI）的100％湿度下在4°C的4°C下打格网格，然后立即浸入液态乙烷中。

　　使用CS校正（CEO）Titan Krios（Thermo Fisher Scientific）电子显微镜自动收集数据，以300 kV或glacios（Thermo Fisher Scientific）电子显微镜在200 kV（NCPSHL+5.1-MAX-MAX-MAX-MAX-MAX-MAX-MAX-MAX-CPPPOR-CLOCKLOCL1仅在glacios（Thermo Fisher Scientific）电子显微镜下运行，该数据是在300 kV（Thermo Fisher Scientific）电子显微镜上运行的。对于OCT4 – MYC-MAX结合的核小体结构，使用Gatan K2 summit直接电子检测器（GATAN）以位于Biioquantum-LS Energy Filter（slit slit width of 20 ev）的计数模式以130,000×的标称放大倍数记录零能量损坏显微照片。对于其他组件，采集以75,000–96,000×的名义放大量，使用Falcon 4直接电子检测器（Thermo Fisher Scientific）进行。记录所有数据集的总剂量为50 E –/Å2，并将暴露量分级为50帧。靶向的散焦值范围为-0.25至-2.5μm。

　　用Cryoflare1.10（参考文献78）进行了实时评估以及用EPU 3.0（Thermo Fisher Scientific）获得的获得。使用关系3 MotionCorr实施79进行漂移校正，其中有或不使用剂量加权方案生成所有帧的运动校正总和。使用GCTF 1.06（参考文献80）或CryoSparc v.3中的补丁CTF实现拟合CTF。使用Cryolo（1.8.0）81，Cistem（1.0.0 beta）82，自动驾驶仪（在Relion中实现）83或CryoSparc v.3 Blob Picker84挑选颗粒。

　　如每个扩展数据图所示，在Relion 3.0（参考文献79），CryoSparc v.3或CryoSparc V.4中进一步处理所有数据集。所有重建报告的分辨率值均基于0.143 Criterion83,85的金标准傅立叶壳相关曲线（FSC），并且使用高分辨率噪声取代的软掩模的效果校正了所有相关的FSC曲线。相应的扩展数据图中指示了用于每个地图的最终细化的软件。对于NCPSHL – 6.2-Clock-Bmal1映射，使用phenix87中的Combine_focus_maps实现生成了两个改进的复合图。CCPEM（v.1.5）88,89中实现的LOCSCALE用于锐化和模糊以下地图：NCPSHL+5.8-CLOCK-BMAL1，NCPSHL+5.8-MYC-MAX和NCPSHL+5.1-MAX-MAX-MAX-OCT4。NCPSHL – 6.2-CLOCK-BMAL1映射根据CryoSparc v.3进行局部分辨率过滤。在CryoSparc v.3（参考文献90）中，估计所有局部分辨率估计使用MONORORES（XMIPP）实现。

　　For modelling of MYC-MAX bound to the NCP in the presence of OCT4, PDB 6T90 (ref. 25) was used as a template for the OCT4-bound NCP, and coordinates extracted from PDB 1NKP (ref. 2) were used to obtain a template for DNA-bound MYC-MAX.使用Chimerax（适合图中的工具；参考文献56）将两个模型安装到冷冻EM图中。NCP DNA和MYC-MAX DNA之间的差距使用COOT中的理想B形DNA封闭（V.0.9.6）91，并相应地调整了DNA序列。使用DNA约束（碱基对，堆叠）在Phenix92中精制了ROS的DNA。MYC-MAX与分离的DNA端以及OCT4以及其他DNA端一起使用Chimerax/Isolde93与自适应距离约束相结合，进一步放松到密度。如有必要，在Coot和Chimerax/Isolde（V.1.2 – V.1.5）中校正侧链。使用Rosetta Fastrelax和B因子协议（V.3.13）94结合使用自我约束（Torsions）（Torsions）和侧链重新包装残疾，对模型坐标和B因子进行了完善。通过将NCP模板（PDB：6T93）25停靠到地图中，并将DNA端与Isolde拟合（结合自适应距离约束），可以获得与SHL+5.8结合的MYC-MAX的模型。调整DNA序列，并通过E-Box基序上的叠加来对接MYC-MAX模型（PDB：1NKP；Ref。58）。如上所述，使用自适应距离限制（MYC-MAX与释放的DNA，组蛋白）以及苯金（V.1.1.19 – V.1.20.1）和Rosetta，使用自适应距离限制进一步完善该模型。推定的侧链密度不允许在准二氨基二聚体整体结构中的MYC-MAX之间明确差异。因此，将两个方向（Myc-Max二聚体相对于核小体都翻转）分别以50％的占用率进行建模，侧链截断了。

　　对于两种NCP结合的时钟BMAL1模型，PDB 6T93（参考25）被用作NCP模板，PDB 4H10（参考文献61）作为Clock-BMAL1的DNA结合BHLH域的模板，PDB 4F3L（Ref 3）（Ref。3）作为Clock Bmal1 for Clock-Bmal1 pas domains domains domains domains1 pomains domains domains domains domains。NCP模板（6T93）的DNA序列在两端延伸，并在COOT中产生理想的B形DNA，并将序列调整为本研究中使用的构建体。使用Chimerax（合适的地图工具）将NCP模型拟合到冷冻EM密度中56，而分离的DNA末端将ISOLDE93半灵活地拟合到密度中，并结合自适应距离约束。如MYC-MAX结构所述，用phenix92和rosetta94精制了DNA。来自4F3LWERE的PAS域停靠，并用phenix.dock_in_map将其固定。同样，在伊索尔德（Isolde）中生成了自适应距离约束，包括BHLH结构域以及分离的DNA段，相反的DNA端和PAS域。这使得组可以半灵活地放松到密度，同时保持原始几何形状。

　　如果Clock-BMAL1结合到位置SHL – 6.2，将DNA/BHLH模型（4H10）和NCP模板（6T93）拟合到密度中，并将DNA与COOT中产生的理想的B形DNA连接到密度中。将DNA序列适应了位置SHL-6.2构建体，并按照针对NCP结合的MYC-MAX结构进行了精制。从4F3L的PAS结构域手动停靠在BMAL1 K212和H3 K57之间的交联引导下。由于由于局部分辨率的局限性和弥漫地图密度，因此无法进行准确的拟合，因此使用Rosetta局部对接协议95与组蛋白相抵触组蛋白，并与Rosetta密度评分（8°，3Å扰动）和一个滤波器的最大交叉链接在Cα之间的最大交叉链接（bmal1 K21 K21 K2121 K212和H3 k21 K212和H3）。通过界面能量和密度得分对所得的姿势进行排名，并且选择了最佳界面能量得分的姿势，因为它与其他大部分姿势分开，同时也具有良好的密度评分。如上所述，对B因子进行了完善。由于本地分辨率不足，因此从Clock-BMAL1模型中除去了侧链以进行沉积。

　　在与POR的Clock-BMAL1结合的情况下，将E-Box 1原始物和E-Box 2原始物的BHLH结构域解析为促进模型构建的分辨率。来自SHL+5.8结构的模型用作模板，很容易拟合核小体和内部Clock-BMAL1异二聚体的密度。调整DNA序列，并根据交联数据，MAP拟合和PAS域的连接段的方向在Chimerax中对接外部BMAL1异二聚体。使用距离和扭转约束将模型与Isolde进行半柔性拟合，并使用坐标约束进一步改进。观察到的链球间-BMAL1交联可以发生在异二聚体内或异二聚体之间。在异二聚体内发生某些交联在空间上是不可思议的，并且可能反映了潜在的杂化二聚体交联。这些假定的杂种二聚体交联的交联（外部时钟K205和H3 K56）共同提出了一个整体方向，外部时钟PAS域将面对内部BMAL1 PAS域。无法找到共识模型，其中所有交联距离将低于30Å的阈值。这可能是由于c-lock-bmal1交叉链接的分配歧义或PAS域的灵活性。由于这些歧义和有限的本地地图分辨率，因此最终模型中不包括外部PAS域。如上所述，对B因子进行了完善。由于本地分辨率不足，因此从时钟-BMAL1和组蛋白模型中除去了侧链以进行沉积。

　　Rosetta Cryo-Em精炼协议是使用内部开发的管道（ROSEM，https://github.com/fmi-basel/rosem）运行的。用phenix96和Molprobity（v.4.5.2）97对所有模型进行验证。

　　用UCSF Chimerax（V.1.3）生成结构图和冷冻EM分割图。

　　Clash scores for MYC-MAX–nucleosome and CLOCK-BMAL1–nucleosome models were calculated using a PyMOL script (scanFactor.py) as described previously45,98 In brief, a MYC-MAX probe (1NKP) or a CLOCK-BMAL1 probe (4F3L, 4H10) containing an appropriately positioned DNA fragment for superimposing on a nucleosome template model was placed in all可能的结合位置，每个视为TF中原子总原子的冲突得分比可调节阈值距离（1Å默认值）与核小体原子更接近。

　　NCP与含有E盒基序的Widom 601 DNA在shl -6.9和shl +5.1和Shl -6.0时的OCT4基序重新构成，与全长的人类Oct4和/或人类Myc-Max BHLH LZ混合（人Myc残留351-437，Human Human Max Max 22-102-2-102-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2）HEPES pH 7.4、1 mM MGCL2、10 mM KCl和0.5 mm TCEP）在冰上孵育约30分钟。在MGCL2（2.5 mm）和CaCl2（2.5 mm）和CACL2（0.5 mm）的存在下，在存在或不存在OCT4和/或MYC-MAX的情况下核小组在37°C下用滴定（0.1 U，0.5 U）处理。通过添加相同体积的停止缓冲液（200 mM NaCl，30 mM EDTA，1％SDS）并在冰上孵育10分钟，从而停止了反应。用蛋白酶K（10μg）处理样品2 h，并使用Ampure珠（A63881）检索DNA。DNA用于序列文库制备（Nebnext芯片塞克，E6240S），并带有双索引，并在Illumina Miseq（300 bp配对端）上进行了测序。将序列映射到使用带有默认设置的BioConductor package Quasr的Widom 601序列（147 bp），该序列包含TF基序，该序列在内部使用Bowtie进行读取Mapping68。提取了映射读数的开始位置，即DNasei切割位点，并将计数纳入W601序列的长度上的1 bp箱中。图和比较使用每次重复的100,000个读数进行。

　　通过添加15 µL 10×MCNAP缓冲液（0.3 M肌酸磷酸盐，30 mM ATP，3 mM MGCL2，3 mM MGCL2，1 mm DTT和10 ng µL-1蛋白酶磷酸磷酸激酶），35 mm phosphokinase/355 µheh 355 µ HeeOH（35 mm MM MGCL2，35 mmmmmmmmgcl2，35 mmmmmmmgCl2，355 phuffp heoH），将从黑色素d. melanogaster BG-3细胞中提取的一微克基因组DNA组装成染色质。50 mM KCI，1.5 mM MGCL2，50 µm ZnCl，10％甘油，1 mM DTT，1×蛋白酶抑制剂复合物和100 µL果蝇果蝇胚胎提取物（DREX提取物（DREX）（如先前所述）在300°C上进行5 h shex head ins shake in s shex head。添加蛋白质，并结合1小时，将样品与甲醛交叉（0.1％的最终浓度），然后通过添加125 mm的甘氨酸淬灭。在旋转的轮子上，在4°C下，每1 µg染色质1小时，将两个µL Higg1-fcspycatcher3（Biorad tzc009）添加。在4°C下持续过夜，将珠子洗涤4次，持续5分钟，1×RIPA缓冲液（在20 µl珠子上进行1 µg染色质）。将样品消化并在65°C下旋转过夜，同时在1,000g的珠子中颗粒1分钟。Tris/NaCl，pH 8。使用Qubit（Thermo Fisher Scientific）确定浓度。

　　使用Nebnext Ultra II DNA库（新英格兰Biolabs）根据制造商的说明制备了NGS库，并在Illumina NextSeq1000 Sequencer上进行了测序。每个样品对每个芯片重复的每个样品进行了约2000万个配对读数。使用单独的纯化蛋白质和DREX提取物进行重复。基本通话是由Illumina的RTA软件V.1.18.66.3执行的。

　　使用Illumina Index读取文件中的条形码通过JE Demultiplexer99对序列读取。使用Bowtie2（Ref。100）v.2.2.9.2.9.2.2.9对D. Melanogaster版本6参考基因组（BDG​​P6）进行对齐。（参数“ - 端到端 - 非常敏感的 - 无 - 否 - 不混合-no-discordant -x 400”），使用SamTools 1.6（参考文献101）过滤质量，其MAPQ得分临界值为-Q 2。

　　通过首先搜索FIMO102的CACGTG E-Box基序中的5,000个最佳命中的DM6基因组来确定复制相关性。然后，对每个重复进行采样，以接收每个重复的读数相同数量的读数，并且每个图案的读数被计数并相互绘制。如果复制足够相似，则将采样读数合并并用于进一步分析。这使我们能够避免针对输入并保留单个读取信息的归一化。

　　使用HOMER103 v.4.9.1调用峰调用函数maketAgdirectory（参数-single -single -fraglength 150）和findpeaks（参数 - 示例 - 式因子-size 150 -f 6），使用相应的控制样品，其中在添加的目标TF中消失了芯片。

　　使用MEME102（v.5.0.2，参数-mod zoops -dna -dna -revcomp -nmotifs 3）发现了峰区域中富集的基序。与峰值中心相反，发现的图案的位置用于将随后的V块置于该图案。

　　使用BioConductor104的VPLOTR库进行V曲线。简而言之，每个读取的片段大小相对于每个峰内的结合基序的位置绘制。这是针对每个样品在其自身集的峰值集中完成的，因此仅显示绑定位点。然后合并每个样品的所有峰的碎片分布。MSL2芯片seq的数据取自先前的研究38，该研究由GEO编号GSE169222存放在地理上。

　　“ V”形状是由绑定TF对基序免受消化的保护而产生的，如果两个DNA链上的基序是累积的，或者基序是腔室，则通常是对称的。V中的所有读取都包括主题，而在外面的所有读取都没有。

　　涉及小鼠组织收集的实验已获得德克萨斯州A＆M大学机构动物护理和使用委员会的批准。成年雄性小鼠保持在22–23°C的恒温下，相对湿度为50–60％，光照为12小时：12小时的黑暗周期。野生型（Charles River菌株027）和BMAL1 - / - （BMKO; Jackson Laboratory Laboratory菌株009100）小鼠均在C57BL/6CRL背景中，并在一天中的ZT6中被异氟烷麻醉后的ZT6安乐死。收集肝脏，在冰冷的1×PBS中短暂洗涤，在液氮中迅速冻结，并保存在-80°C下，直到进一步使用。如前所述提取核105。简而言之，将冷冻小鼠肝脏在液氮下将粉末粘在砂浆中，并在4毫升冰冷的1×PBS中匀浆。将肝匀浆与25 ml冰冷的蔗糖匀浆溶液（2.2 m蔗糖，10 mM HEPES pH 7.6，15 mm KCl，2 mM EDTA，1 mM PMSF，0.15 mm的甲壳，0.15 mm的甲壳，0.5 mm的甲壳虫，0.5 mm的弹性定和0.5 mm DTT）。After incubation on ice for 10 min, the liver homogenate sucrose solution was carefully poured on the top of a sucrose cushion solution (2.05 M sucrose, 10% glycerol, 10 mM HEPES pH 7.6, 15 mM KCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.15 mM spermine, 0.5 spermidine and 0.5 mM DTT) and centrifuged for 45 min at使用Beckman SW32TI转子在4°C下24,000 rpm（100,000g）。将核重悬于SMF洗涤缓冲液（10 mM Tris pH 7.5、10 mM NaCl，2 mM MGCL2和0.1 mM EDTA）中，并用相同的缓冲液洗一次。

　　SMF协议改编自参考。106并针对小鼠肝脏进行优化。对于每个样品，将250,000个核用M.CVIPI洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 8.5、50 mM NaCl和10 mM DTT）洗涤，并重悬于1 mL的1×M.CVIPI反应缓冲液（50 mM Tris pH 8.5，50 mm Nacl，Nacl，300 mm Nacl，300 mm soccose and 300 mm soscose and 300 mm soccose和10 mm dtttttttt）中。然后，加入18.75 µl 32 mM SAM和200 U的M.CVIPI（NEB-M0227L; 50 µL），并在水浴中在37°C下在37°C下孵育7.5分钟。该反应在37°C下用100 U的M.CVIPI（25 µL）和128 µmol的SAM（4 µL）补充了7.5分钟的第二个孵育弹。通过添加350 µL含SDS的缓冲液（20 mM Tris，600 mM NaCl和1％SDS 10 mM EDTA）和20 µL蛋白酶K（20 mg ML-1）来停止甲基化反应，并将混合物在55°C下孵育过夜。通过苯酚 - 氯仿纯化和异丙醇沉淀分离基因组DNA，重悬于10 mM TRIS pH 7.5中，并在37°C下用RNase A AT AT 1 h处理1小时。使用Epatect Bisulfite转化试剂盒（Qiagen 59124），将两个微克基因组DNA的基因组DNA用于亚硫酸盐转化率。使用Kapa Hifi Hifi hifi uracil+ kit（roracil+ kit（roacil+ beit）），使用Kapa Hifi hifi hifi uracil+ Kit（Roche（Roche）（Roche），使用了十到十二纳图（Chr。5：135,674,788-135,675,224; Mus Musculus MM10基因组版本），使用十到十二个纳米图（Chr。5：135,674,788-135,675,224; Mus hifi hifi hifi hifi hifi uracil+ beit（roacil+ dod）。106（正向引物：GGTTTTTTTGAGYATAGAATTTTTTTTTTT;反向引物：CCATCTTCTCTCACTTCTRCCCAAT）。用1.5×Spri珠纯化PCR产物，并使用Nebnext Ultra II套件来生成测序文库。将三种生物学重复的库元素ZT6和BMKO ZT6的三个生物学重复的库合并在一起，并用Miseq v.2 nano试剂盒（配对端250 bp）进行测序。

　　Bio.Align Python包中的PairWisealigner函数用于序列比对。匹配，错配和间隙的对准条件的得分分别为1.0，-0.2和-0.5。每个位置的对齐得分总和除以总比对长度的总和定义为最终对齐得分。配对端FASTQ文件中的序列是通过将25-NT查询序列对准向前和反向引物序列的第一个序列。选择了底漆最终排列评分高于0.8的读数，并将全长配对 - 端查询序列比对与甲硫酸含量转换的靶序序（由HTH代替HTH，GC替换为GY，CG被YG替换为YG，用YG代替YG，用Y =吡啶胺和H = G）。选择了最终比对得分高于0.7的配对末端序列，以基于比对结果（在重叠区域，使用具有更高质量评分的核苷酸）来重建全长增强子序列。接下来，删除了PCR重复项，并在每个样本中随机选择等量的读取以进行下游分析（n = 1,052个读取，以匹配样品的最低读数的样本）。提取所有GCH位置的甲基化信息（不遵循G的GPC位置，以避免与内源性CpG甲基化发生冲突），分别使用0或1来表示分别表示未受保护或受保护的细胞壳。然后，使用二进制矩阵分解聚类算法107将所有六个样品的读取量进行聚类，然后根据其相对簇和基因型进行解析。原始数据（FASTQ）读取可从Mendeley数据提供：https：//doi.org/10.17632/t7xj4rc62t.1。

　　将野生型小鼠BMAL1或突变体（Uniprot：Q9WTL8）克隆到哺乳动物的慢病毒表达主链（Addgene质粒，73320）中，并进行了修改，以包括终止密码子与架子内与EGFP结合使用，以防止EGFP表达融合蛋白（Twist Bioscience）。使用PAX2和PMD2.5包装质粒在HEK293T细胞（ATCC）中产生重组慢病毒颗粒。所得的上清液用于传递BMAL1 - / - PER2 :: LUC成纤维细胞为先前108。为了选择，将1μgml -1紫霉素施用一周，每48小时中等变化。

　　在高葡萄糖（27.8 mm）的12孔菜肴中，成功转导的细胞在融合中，含有谷氨酸的DMEM（Gibco），含有10％血清（Hyclone Fitalclone III，Thermo Fisher Scientific）和青霉素 - 链霉素。重构线还具有0.5μgml -1紫杉素以保持选择。每7-10天刷新一次，融合培养物长达4周。Before the start of recording, cells were synchronized by the addition of 100 nM dexamethasome for 1 h and then changed to MOPS-buffered ‘air medium’ (bicarbonate-free DMEM, 5 mg ml−1 glucose, 0.35 mg ml−1 sodium bicarbonate, 0.02 M MOPS, 100 μg ml−1 penicillin–streptomycin, 1% Glutamax,1 mM荧光素，pH 7.4，325 MOSM（参考文献109）。

　　使用以下方程式将生物发光的细胞痕迹与阻尼的余弦波拟合：

　　如果y是信号，则m是脱键线的梯度，c是该下降线的y截距，x是相应的时间，振幅是波形高于趋势线的峰值的高度，k是衰减常数（这样1/k是半寿命），相位是cos波和cos波的移位，并且是cos波的移位，并且是cos wave的偏移，则是cos wave的时间，并且是cos wave的时间。

　　使用Tris-Glycine SDS缓冲系统的制造商协议，在Anykd Mini-Protean TGX凝胶（Biorad）上运行样品。使用Trans-blot Turbo转移系统（Biorad）进行蛋白质转移至硝酸纤维素，并具有标准或高分子重量方案。短暂洗涤硝酸纤维素，然后在室温下以5％W/W非脂肪干牛奶（Marvel）在Tris缓冲盐水/0.05％Tween-20（TBST）中阻塞30分钟。Membranes were then incubated, rocking, with 1:4,000 primary antibody (M2 anti-Flag, Sigma F3165) to detect CLOCK-BMAL1 and anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnologies sc-365062) was used as a loading control at a dilution of 1:3,000 in blocking buffer (5% milk, TBST) overnight at 4 °C.第二天，将膜在TBST中再洗涤3×10分钟，并与抗小鼠HRP二级抗体再次孵育一小时（Sigma，A9917，1：5,000）。在使用Chemidoc XRS+ Imager（Biorad）成像的Immobilon试剂（Millipore）之前，在化学发光检测前进行了另外3×10分钟的TBST洗涤。使用Image Lab Software 6.0（Biorad）进行定量。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。