标准分子生物学技术，包括PCR，限制克隆，Gibson组装，金门组装和Quik-Crange诱变，用于组装质粒。为了在大肠杆菌中生成质粒的质粒，将编码人类HTRA2（134–458）的DNA片段合成为双链DNA（Integrated DNA Technologies（IDT））和UL36USP（UL36（UL36）（UL36-（39–285）），RBBP9或SCOV2-PLPRO合成含有质粒的UL36USP48。将编码序列克隆到PNHD vector2中，使用HTRA2和RBBP9的C端HA – Strep-TAG，以及用于UL36USP和SCOV2-PLPRO的C端Twin-strep-TAG。为了将催化丝氨酸/半胱氨酸转换为丙氨酸或琥珀色终止密码子，使用Quik-Crange Primers（Agilent Primer Design）完成了定向诱变的位置诱变。为了生成哺乳动物细胞中蛋白质表达的向量，将DAPRST2，TEV2，Human Rhbdl4（参考文献49）或RBBP9编码序列进行扩增，并将其引入先前报道的PCDNA3.1质粒backbone50中，该质粒backbone50具有4×[U6-Pytrnacua]。引入了TEV的C末端HA – Strep-Tag，并在RHBDL4，RBBP9，UL36USP或SCOV2-PLPRO的C-末端引入了Twin-Strep-Tag。The DNA fragments encoding ER-resident proteins—human CCDC47, PDIA6, CALR, GANAB, ERP44, CALU, PRKCSH, FKBP9, DNAJC3 and CANX—were amplified from HEK293T cDNA and cloned into a previously reported pcDNA3.1-based BiP expressing plasmid51, in which an ER leader peptide was followed by aV5-TAG和BIP编码序列。在CCDC47的C端或ER保留基序序列之前，引入了一个额外的HA-TAG。从HEK293T cDNA扩增了编码MFN2，LEMD2，EMD，HNRNPH1和HNRNPM的DNA片段，并将其克隆到PCDNA3.1质粒中。将HA-TAG放置在MFN2，LEMD2或HNRNPM的C端，而GFP-TAG则在Emerin或Hnrnph1的C端引入GFP-TAG，以更好地检测蛋白水解片段。导向RNA（GRNA） 对于Rhbdl4敲除，通过金门组件将优化的脚手架带入PX330-PURO质粒中。

　　Samples were separated by SDS–PAGE (note that NuPAGE 4–12%, 10% Bis-Tris or 3–8% Tris-Acetate gels running in MES or MOPS buffer were applied to achieve the optimal separation of proteins (protein fragments) of interest) and transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane by iBlot 2 dry blotting system (Thermo Fisher Scientific).在PBS（目录（Cat。）No。927-40000，Li-Cor）中，膜阻塞缓冲液在室温下堵塞了膜。将膜在4°C的原代抗体溶液中孵育（根据制造商的Odyssey T20（PBS）抗体稀释剂（927-75001，LI-COR）的稀释）在4°C过夜。所有孵育均在平台振动板上进行。将膜用PBST（补充了0.1％Tween-20（v/v））洗涤三次，并与二级抗体溶液（1：15,000（v/v）在PBS阻塞缓冲液中补充了0.2％Tween-20-20（V/V），在室温下为0.2％Tween-20（V/V），并在室温下为0.2％Tween-20（v/v）。用PBST洗涤3次，一次用PBS洗涤后，通过在700 nm和/或800 nm通道进行扫描，通过Odyssey CLX成像系统（LI-COR）可视化免疫反应性蛋白。将700个总蛋白质染色（926–11015，LI-COR）恢复为总蛋白质染色。通过Image Studio Lite（版本5.2.5）分析数据。有关本研究中使用的原始和二级抗体，请参见补充方法中的“抗体”。

　　为了激活蛋白酶（PC-DAP），在Tris缓冲液（5 mM DTT，pH 8.0）中照亮蛋白质（365 nm，4 MW cm-2），在4°C或37°C孵育过夜，过夜以生成蛋白酶（DAP）。MIC LED-365（500 MA，Prizmatix准直的模块化光源，补充图2）用于在溶液中照亮蛋白质。该设备还用于阐明组织培养引擎盖中的悬浮细胞（expi293细胞）。

　　将30微克HTRA2 – HA -STREP变体（野生型，ALA或DAP）添加到1 mL的Expi293细胞裂解物（3μgμl -1）中，并在30°C下孵育3小时。反应每10分钟摇动10 s。将五十微升的抗HA琼脂糖浆液（A2095，Merck）添加到反应中，并在4°C的末端摇杆上混合2小时。将混合物转移到生物旋转柱中。用真空泵将树脂用RIPA缓冲液洗涤3次，PBST缓冲液3次，然后以5,000克离心1分钟，以去除残留缓冲液。然后，将珠子在100μL1×LDS加载缓冲液中孵育，并在95°C煮沸5分钟。通过SDS -PAGE或Western印迹分析了二十微米的洗脱体。在200 V时，将20微透明的洗脱液分离在10％Bis-Tris加凝胶中3分钟。含有所有蛋白质的凝胶切片，通过LC-MS/MS切割和分析，如“电雾电离串联量质谱法”中所述。

　　将野生型HTRA2或HTRA2（S306A）（1μM）添加到1.2 mL Expi293细胞裂解物中。在指示的时间点，通过与100μL4×LDS载荷缓冲液混合，在95°C煮沸5分钟，将300μl反应淬灭。通过蛋白质印迹分析样品，并用补充表2，3中列出的一抗。GAPDH用作负载对照。

　　HEK293T细胞购自欧洲细胞培养物的收集（通过STR DNA分析验证），并对支原体污染进行了阴性测试。

　　将HEK293T细胞培养在Dulbecco的修改后的Eagle培养基（DMEM）（GIBCO）中，该培养基（GIBCO）补充了10％胎牛血清（FBS）（Gibco）（Gibco）和青霉素 - 链霉素（Pen/Strep，Pen/strep，100 IU ML-1 Penicillin and 100 iu ml-1 penicillin and100μgml-1 strator intator intator intator intator contried andried in trantor）在377°C in 37.5％CO2。通过用胰蛋白酶-EDTA溶液脱离每2-3天，将细胞转移一次，并以10％FBS重悬于DMEM中，并播种成细胞培养瓶中。

　　为了在24孔板中转染：将0.75μl的Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）稀释在25μlOpti-Mem（Gibco）中，并短暂涡旋。通过将500 ng DNA混合物混合（底物：DAPRST：蛋白酶，1：1：3或空载体：DAPRST：DAPRST：蛋白酶，1：1：3）在25μLOpti-MEM中制备DNA溶液，然后加入1μLP3000试剂。然后，将稀释的Lipofectamine添加到DNA溶液中（1：1 V/V）。将混合物在室温下孵育10分钟，并将DNA-脂质复合物添加到细胞中。转染后30分钟，将图谱传说中的指示浓度（或0.5 mm）添加到培养基中，以实现PC-DAP掺入。在进一步分析之前，将细胞在37°C下孵育40-48小时。

　　从Thermo Fisher（通过STR DNA分析身份验证）购买了Expi293细胞，并对支原体污染进行了阴性测试。

　　在37°C下以8％CO2在37°C的孵化器中培养了Expi293细胞，并在37°C的孵化器中以125 rpm的速度培养。每2-3天一次通过每毫升0.5×106细胞的细胞密度开始一次单元。转染以每毫升2.5×106个细胞约2.5×106的细胞密度进行。

　　转染100 mL指示细胞：在3.3 mL Expi293培养基中稀释了300μL聚乙烯分子质量40,000（PEI，1 mg ML -1，PolySciences）。100μgDNA混合物（底物：DAPRST：蛋白酶，1：1：3或空载体：DAPRST：蛋白酶，1：1：3）在3.3 mL Expi293培养基中稀释。将稀释的DNA和PEI溶液混合并在室温下孵育15分钟，然后再添加到细胞培养物中。转染PC-DAP掺入30分钟后，在PC-DAP中增加了0.5 mm（或指示的浓度）。转染后40至48个小时，收集细胞并将其光活化以进行进一步分析。

　　转染后40至48小时，将细胞培养基替换为新鲜培养基，并将细胞照亮2分钟。内部建造了用于照明粘附的哺乳动物细胞的设备（补充图7）。Luxigen 365 NM UV LED发射极（LZ4-04UV0R-0000，Mouser Electronics）用于照明。井板处的UV强度设置为4 mW cm -2。照明后，将细胞在37°C孵育指示的时间（如果需要时添加蛋白酶体抑制剂MG132（2μM））。对于粘附细胞，在每个时间点，用PBS洗涤6孔板中的细胞，并在400μlRipa裂解缓冲液（89900，Thermo）中裂解，并补充了Halt Protease抑制剂鸡尾酒（78429，Thermo Fisher）和通用核酸酶（88702，Thermo Fisher）。通过以21,000克离心5分钟来清除裂解液，然后将上清液闪烁并储存在-80°C下。对于悬浮细胞，在每个指示的时间点，将5 ml细胞培养在650g下离心5分钟，然后将细胞沉淀闪烁并保持在-80°C。然后，将细胞颗粒在补充有蛋白酶抑制剂和4°C的通用核酸酶的1 ml RIPA裂解缓冲液中裂解。将细胞裂解物以21,000克离心5分钟。被清除的裂解物用于SDS-PAGE和WESTERS BLOT分析或MAGSTREP TYPE3 XT XT珠（2-4090-002，IBA）的亲和力富集。

　　如“ Expi293细胞中的PC-DAP的掺入”中所述，RHBDL4变体在EXPI293细胞中表达。转染40小时后，将50 mL细胞培养物重悬于新鲜的培养基中，并发光（365 nm，4 mW cm -2）持续2分钟。在收集前2μMMG132的情况下，将细胞在37°C下孵育4小时。沉淀后，将细胞重悬于HEPES缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM MGCL2，5％甘油，1 mM DTT）中，含有蛋白酶抑制剂和通用核酸酶。悬浮液通过两次通过3,000–5,000 psi的Avestin乳液C3均质器（ATA科学）裂解。将裂解液以1,000克离心5分钟两次，然后将上清液以100,000克离心1小时。将沉淀在4°C下用Na2co3（100 mm，pH 11.3）洗涤20分钟，然后以140,000g离心1小时。将膜馏分溶解在2％SDS缓冲液中（50 mM Tris，pH 8，150 mM NaCl，1 mM DTT和蛋白酶抑制剂）。将溶液用10％NP40稀释，以产生0.1％SDS和1％NP40的终浓度。将一百微米的magstrep type3 XT X X X添加到溶液中，并在室温下孵育1小时。将珠子用RIPA和PBST洗涤三次。通过在65°C加热15分钟，将附着在珠子上的蛋白质在1×LDS加载缓冲液中洗脱。将洗脱液分离在螺栓10％的螺栓中，加凝胶3分钟。切割含有蛋白质的凝胶切片和通过LC -MS/MS分析。

　　空载体，野生型（WT）RHBDL4或RHBDL4（S144A）质粒与含有质粒或空载体（对于内源性底物）的候选底物共转染HEK293T或EXPI293细胞。优化了含底物质粒的候选质粒的量以表达水平。转染后40至48小时，收集细胞并在补充蛋白酶抑制剂和通用核酸酶的RIPA缓冲液中裂解。裂解物被清除并通过蛋白质印迹分析。

　　为了分析细胞外培养基中的蛋白质，收集前24小时，将含FBS的HEK293T细胞的含FBS培养基替换为无杂交瘤血清培养基（12045076，Thermo Fisher）。可以直接收集无血清且无蛋白质的Expi293培养基，以进行进一步分析。收集培养基并通过0.22μm聚乙烯膜膜过滤。为了在培养基中获得总蛋白质，在4°C下添加1/10体积的100％冰冷TCA溶液（T0699，Sigma）以进行蛋白质沉淀。为了获得上清液中的蛋白质，将培养基以200,000克离心1小时，以将上清液与微泡分离。收集SN并添加1/10卷冰冷的TCA以沉淀蛋白质。以21,000g离心10分钟后，将沉淀物用丙酮洗涤一次，并溶解在1×LDS的加载缓冲液中。超中心后，用PBS洗涤一次微泡颗粒，并溶解为1×LDS加载缓冲液。

　　通过将10％NP40和PNGase（P0704S，NEB）或Deglycosylation Mix II（P6044S，NEB）添加1/10体积（P6044S，NEB）来进行脱糖基化。在分析之前，将反应在37°C下孵育1小时。

　　转染后二十四小时，将expi293细胞分为两半用DMSO或BFA（5μgml-1）分别处理。BFA处理以两种方式进行：（1）BFA直接添加到中培养中；（2）将培养基替换为补充BFA的新鲜培养基。BFA处理后16小时，收集细胞和细胞外培养基，并如“ RHBDL4裂解测定”中所述进行分析。

　　HCT116细胞购自美国型培养物收容（通过STR DNA分析验证），并对支原体污染进行了阴性测试。

　　将HCT116细胞培养在补充了10％胎牛血清（FBS）（GIBCO）（GIBCO）的McCoy的5A（修饰）培养基（Gibco）中，并在37°C的Pen/strep中使用5％CO2的加湿孵化器中的Pen/strep培养。每2-3天传递一次细胞。

　　通过Lipofectamine LTX（15338100，Thermo Fisher）转染6孔板中的HCT116细胞，其中含有2.5μg的PX330-PURO质粒含有GRNA（5'-TCCAGTAAGTACAGAGAAAAATG-3'）和CAS9，用于RHBDL4敲除。转染后二十四小时，将细胞胰蛋白酶素化并在10 cm培养皿中铺板。24小时后，将细胞用嘌呤霉素（1μgml -1）处理。48小时后，紫霉素的选择停止。将细胞化为胰蛋白酶并进行有限的稀释以产生单个克隆，并通过Western印迹（抗RHBDL4）扩展和分析，并通过对GRNA靶向的基因组DNA区域进行测序进行基因分型。

　　为了检测由内源性RHBDL4产生的内源性底物的蛋白水解片段，将1000万个野生型或RHBDL4基因敲除HCT116细胞在无杂交瘤血清培养基中培养40小时。通过30 kDa截止浓度器收集，过滤并浓缩培养基。通过TCA沉淀蛋白质并溶解在1×LDS加载缓冲液中，以进行免疫印迹分析。

　　为了识别与PEPT（DAP）相关的X，RBBP9变体在HEK293T细胞中表达，如“ HEK293T细胞中的PC-DAP掺入”中所述。将PC-DAP（0.1 mm）添加到细胞中以产生RBBP9（S75pc-DAP）。为了表征RBBP9变体的整个质量，如“ Expi293细胞中的PC-DAP掺入PC-DAP”所述，在100 mL Expi293细胞中产生了RBBP9变体。RBBP9（S75PC-DAP）在存在0.5 mm PC-DAP的情况下表达。转染后40小时，将细胞照亮（365 nm，4 mW cm -2），持续2分钟，并在37°C下孵育3小时。然后通过超声处理收集细胞并在Tris缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0，150 mM NaCl，1 mM EDTA和通用核酸酶）中裂解。请注意，在裂解缓冲液中未添加蛋白酶抑制剂。通过以21,000克离心20分钟来清除裂解液。使用Magstrep type3 XT珠富集上清液中的RBBP9物种。将附着在珠子的蛋白质在Tris缓冲液中的50 mM生物素中洗脱，以进行质量表征。

　　在TRIS缓冲液（100 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.3）中，将两个微摩尔RBBP9与每个AA -AMC在不同底物浓度的范围内孵育。荧光强度（由于AA-AMC通过RBBP9的水解释放AMC荧光团，每20秒在10分钟内测量一次（火星数据分析软件（版本3.20 R2））。对于每个底物，使用标准曲线将荧光增加的速率转化为产品形成速率。在大于10μM的底物浓度下，发现通过AA -AMC对AMC荧光进行分子淬灭是显着的。因此，对于除了PHE-AMC和Tyr-AMC以外的所有底物，使用了0至4μM之间的AA-AMC浓度，并采用伪优先的动力学来计算特异性常数。对于Phe-AMC和Tyr-AMC，与其他底物相比，水解速率明显更快，使用0至160μm的浓度范围为0至160μM，并将转换的速率安装到Michaelis-Menteren动力学中，以获得特异性常数。

　　将肽（100μm）溶解在Tris缓冲液（100 mM Tris pH 7.4，150 mm NaCl，1 mM EDTA）中。添加了两个微摩尔野生型RBBP9或RBBP9（S75A）以开始水解反应。通过用乙酸淬灭并通过质谱法监测反应。应用选定的离子质量（SIM）模式用于检测肽底物和所需产物。

　　在BL21（DE3）细胞中表达了具有C末端His-Tag40（Lehhhhh）的人RBBP9，并通过由Histrap富集和凝胶过滤（SuperDex 75）色谱法组成的两步​​方案进行纯化。将RBBP9的纯级分（> 98％由SDS -PAGE确定的纯度）用10 kD Mwco vivaspin 20浓缩剂（Sartorius）（sartorius）至10 mg ml -1，含有10 mM Tris（pH 7.5），100 mM NaCl，5 mm DTT和5 mM DTT和5 mM PHE。在结晶之前，通过离心15分钟以10,000克清除样品。在18°C的96孔坐落式蒸气扩散板（分子尺寸）中，在18°C的96孔坐落式蒸气扩散板（分子尺寸）中进行了结晶试验，并使用蚊子HTS机器人（TTP LabTech）进行。0.2μl蛋白质溶液加上0.2μl储液溶液的下降比用于粗筛和细筛。初始命中是在多种条件下获得的，不需要进一步的优化。从以下条件收集的晶体中收集数据：30％w/v PEG 4K，0.1 m Mes钠盐，pH 6.5。

　　为了确保冷冻保护，在液氮中采摘和闪烁之前，将含晶体的液滴与25％甘油混合在储层溶液中。衍射数据是在梁线I04上的钻石光源（DLS，英国）收集的。使用XIA2拨号（版本0.7.90）自动处理数据集，并在程序的CCP4 Suite（版本7.0.078）中使用AimNaless and RefMac5（版本5.8.0258）进行缩放。使用RefMac5和Coot（版本0.8.9.2）进行结构改进和手动模型构建。用Pymol（2.5版）制备颜色数字。

　　所有蛋白质样品的质谱均在配备6130个四极光谱仪的安捷伦1200 LC-MS系统上采集。木星现象C4柱（150×2 mm，5μm）用于洗脱蛋白质。缓冲液A（H2O中的0.2％甲酸）和缓冲液B（乙腈中的0.2％甲酸）用于RP-HPLC。质谱是在正模式下获取的，并通过MS ChemStation软件（Rev.C.01.06 [61]，Agilent Technologies）进行了分析。软件中提供的反卷积程序用于获得整个质谱。通过校正野生型蛋白的分子质量（http://www.peptidesynthetics.co.uk/tools/），用非官方氨基酸的蛋白质的理论分子质量计算出来。

　　在聚丙烯酰胺凝胶切片中（1-2 mm）中的蛋白质（包括被困在HTRA2或RHBDL4的底物）的蛋白质被酶促消化以进行LC-MS/MS分析。简而言之，将切除的蛋白质凝胶片放在96孔微滴定板上，并用50％V/V乙腈和50 mm碳酸氢苯铵脱落，然后用10 mM DTT和55 mm iodoacetamide还原。溶液中的rbbp9脱位以两种方式处理：（1）在没有烷基化的10 mM DTT的情况下，在室温下孵育过夜；（2）用10 mM DTT还原30分钟，并用55毫米碘乙酰胺烷基化。然后，将蛋白质用胰蛋白酶/LYSC（Promega）在37°C下过夜消化。将所得的肽在2％V/V甲酸，2％V/V乙腈中提取，并通过纳米级毛细管LC-MS/MS进行分析，该纳米级毛细管LC-MS/MS使用最终的U3000 HPLC（热能科学Dionex），流速率为300 nl min-1。A C18好评的PEPMAP1005μM，100μM×20 mm纳米燃料（热科学二酮）用于在C18 Apraim PepMap1003μm，75μm×150 mm Nanoviper（热摩西型Dionex）上分离之前将肽捕获。用乙腈梯度洗脱肽。将洗脱器直接引入带有混合双压线性离子陷阱质谱仪（Orbitrap Velos，热科学）的修饰纳米流ESI源。对于完整的MS频谱，使用30,000的分辨率进行了数据依赖性分析，然后在线性离子陷阱中进行了10 ms/ms光谱。MS光谱在100–2,000的M/z范围内收集。

　　使用吉祥物搜索引擎程序（Matrix Science，2.4版），使用包含瑞士 - 蛋白质的内部蛋白质序列数据库和实验特定的蛋白质构建体进行了LC – MS/MS数据。将数据库搜索参数设置为前体公差为5 p.p.m。碎片离子质量耐受性为0.8 da。包括可变修饰的氧化蛋氨酸，氨基氨基甲基半胱氨酸，焦谷氨酸和谷氨酰胺/天冬氨酰胺脱氨酸的可变修饰。MS/MS数据使用脚手架程序（版本5，Proteome Software Inc.）验证。

　　为了进行定量分析，MASQUANT软件（版本1.6.3.4）处理MS RAW文件，并使用嵌入式仙女座搜索引擎搜索相应的数据库（UNIPROT）。在肽和蛋白质水平上，所需的FDR设置为1％或5％。允许错过的切割的最大数量设置为两个。蛋白质定量是通过LFQ使用默认设置完成的。最大蛋白酶输出文件用Perseus进一步处理（1.6.2.3）53。通过过滤去除污染物和反向命中。剩余的蛋白质定量被log2转换。

　　首先使用ProteOwizard（版本3.0.11252）55将LC – MS/MS文件（以原始格式）转换为MZML格式。然后使用使用Pyopenms软件包（版本2.4.0）56编写的自定义Python（版本3.8.1）脚本进行数据准备和处理。简而言之，将收集的光谱进行质心，所有MS2光谱的前体质量低于RBBP9（PEPT（DAP））的未结合DAP的胰蛋白酶肽的光谱。对于每个过滤的MS2频谱，提取每100次质量间隔中的十个最丰富的峰。

　　基于每种MS2光谱的PEPT（DAP）和前体质量的肽序列，计算了理论离子质量的列表。这些对应于底物偶联的PEPT（DAP）（PEPT（DAP-X））的MS2碎片。该列表包含单元和Y型离子，双子体B和Y离子，以及与B-或Y离子侧链相对应的与水或铵损失相对应的离子。MS2频谱中的峰与此列表匹配，并且该匹配的分数按照先前所述57进行计算。这个分数是近似n群体中至少k匹配的近似概率的负数的十倍，其中k是匹配的数量，n是列表中质量的数量。

　　为了提取最高得分的光谱，使用Bonferroni校正以0.05控制概率值的家庭错误率。计算每种PEPT（DAP-X）光谱的PEPT（DAP）和前体离子之间的质量差，以确定每个结合物的分子质量。对于每个质量变化，对代表性得分的光谱进行了询问以验证分配。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。