给药小分子药物通常会导致系统性药理作用，从而有助于疗效和毒性，并定义其治疗指数。尽管可以通过改善药物特异性的化学修饰来减轻靶向效应，但在目标上 - foff组织的毒性代表了一个独特的挑战，需要精确控制组织分配。在靶向 - 组织毒性会影响常用药物，例如他汀类药物（由骨骼肌中HMG COA还原酶抑制引起的肌病）1和第一代抗组胺药（由大脑中的H1受体阻断引起的嗜睡）2，有时可以抑制其他有效的治疗方法。MTOR的化学抑制剂提供了一个例子。尽管已经在许多中枢神经系统（CNS）（包括结核菌硬化症复合物）中研究了变构和直角MTOR抑制剂3,4,5，胶质母细胞瘤6,7,8,9和酒精使用障碍10,11，111,12儿童13,14。如果这些MTOR抑制剂的药理作用可能局限于中枢神经系统，则可以大大扩大其治疗窗口。在这里，我们提出了一种化学策略，该策略可以通过两种药理剂的组合来允许大脑特异性MTOR抑制：一种可渗透的MTOR抑制剂（Rapalink-1），其功能需要细胞内蛋白FK506结合蛋白12（FKBP12）和Brain-Impermememant ligant ligand ligand ligand ligand ligand ligand ligand ligand ligand ligand ligand ligand ligand。当在胶质母细胞瘤异种移植模型中使用时，这种药物组合会导致肿瘤回归，而无需检测到的全身毒性。我们进一步证明，可以通过开发一种将已知的激酶抑制剂转化为FKBP12依赖性格式的方法来适应该策略以实现对其他激酶靶标的抑制。

　　MTOR激酶的治疗靶向既可以变构和直角实现。第一代MTOR抑制剂雷帕霉素及其类似物（Rapalogues）与MTOR的FK506雷帕霉素结合（FRB）结构结合，作为与细胞内蛋白FKBP12的复合物，导致了MTOR依赖性依赖MTOR COMPCECER的底物抑制作用1（Refs.15,17）。第二代MTOR激酶抑制剂（TORKI）直接在MTOR的ATP袋中结合，并抑制MTOR复合物1和复合物2的活性（参考文献18,19,20）。第三代MTOR抑制剂RAPAlink-1是一种比特的配体，同时与MTOR的ATP口袋和变构小口袋（FRB结构域）相同，可实现其激酶活性的有效和持久的抑制作用21。尽管Rapalink-1具有较大的分子量（1,784 DA），但与早期的MTOR抑制剂相比，Rapalink-1是细胞和脑部的渗透性，在驱动胶质母细胞瘤回归方面的体内功效增强了。

　　因为Rapalink-1包含一个TOR激酶抑制剂（TORKI）部分（图1A，灰色阴影），在ATP袋中结合，我们想知道Rapalink-1与FKBP12的相互作用对于抑制MTOR是否至关重要。我们用纯化的MTOR蛋白进行了体外激酶测定，发现Rapalink-1表现出与MLN0128（Rapalink-1的Torki部分）相同的半末端抑制浓度（IC50）值（IC50）值是否存在FKBP12（图1B）（图1B）（图1B），表明RapAlink-1可以使RAPAlink-1与MTOR的活跃设置相关。但是，当我们在细胞中测试Rapalink-1时，我们观察到对FKBP12的强烈依赖性mTOR抑制作用。在表达DCAS9-KRAB的K562细胞中，CRISPRI介导的敲低编码FKBP12的基因用两个不同的单个指导RNA（SGRNA）极大地阻碍了其细胞活性（图1C）。当我们使用FK506（FKBP12的高亲和力天然配体）来阻止FKBP12的配体结合位点时，这种效果更加明显。当我们通过Western blot监测MTOR信号传导时，观察到Rapalink-1的类似FKBP12（图1D；另请参见参考文献21）。虽然10 nm Rapalink-1降低了磷酸-S6（S240/244）和磷酸-4EBP（T37/46）至几乎无法检测到的水平，但10 nm Rapalink-1和10 µm FK506的组合均对任何标记均无影响。

　　这些结果表明，尽管FKBP12对于Rapalink-1在体外结合并抑制了MTOR的活性位点并不是必需的，但它是细胞活性所必需的，可能是Rapalink-1的细胞内水槽，以使Rapalink-1积聚在细胞中。我们使用Rapalink-1的结构类似物探索了这种可能性，其中Torki部分被四甲基二胺代替（Rapatamra；扩展数据图1）。Rapalink-1的荧光类似物使我们能够通过流式细胞仪来量化细胞内化合物的浓度。与先前的Rapalink-1（参考文献21）和其他FKBP结合化合物22,23的发现一致，Rapatamra即使在广泛的洗涤后也显示出高细胞保留率（中位荧光强度的增长），但这种效果通过编码FKBP12的基因敲低而降低，但这种效果降低了。尽管其他因素可能会导致其他因素，但我们的数据表明FKBP12介导的细胞分配在Rapalink-1的出色效力中起着很大的作用。

　　接下来，我们考虑是否可以利用Rapalink-1对FKBP12的依赖性来实现CNS限制的MTOR抑制。具体而言，在外周组织中对FKBP12的选择性阻断具有有效的，脑部覆盖的小分子配体，可以使Rapalink积聚在大脑中，但不能在外周组织中积聚，从而导致脑特异性抑制作用（图2A）。为了识别具有合适渗透率曲线的候选FKBP12配体（即可渗透但血脑屏障（BBB）不可渗透），我们考虑了已知的自然和合成高亲和力FKBP12配体（例如，FK506（例如，FK506）（Refs。24,25），Rapamycin26,26,27和SLFFS（Refs）（Refs）28,1（Refs）。化合物很容易穿越BBB。因此，我们合成了SLF和FK506的一组衍生物，其中极性取代基（尤其是氢键供体和受体）已连接到这两个分子的溶剂暴露部分，直接与设计BBB可渗透的药物的经验规则直接相反。此外，FK506的C21烯丙基的修饰具有额外的优势，即它废除了与钙调神经素32的结合，钙调神经素32是FK506的自然靶标，FK506的自然靶标会导致活化T细胞（NFAT）信号的核因子（NFAT）信号传导抑制和免疫抑制（图2B）。我们合成的大多数SHIELD-1和FK506衍生物维持有效的FKBP12结合（扩展数据图2），如竞争荧光极化测定法测量。然后，我们在基于细胞的测定中筛选了这些化合物（10 µM），评估它们是否可以通过通过Western Blot监测磷酸-S6的水平来保护MTOR免受Rapalink-1（10 nm）的抑制作用。尽管某些SLF衍生物减弱了雷帕霉素的效力（营救磷酸S6水平），但它们未能阻止Rapalink-1（扩展数据图2A）。同时，大多数FK506类似物都是有效的，其中一些完全阻止Rapalink-1抑制mTOR （扩展数据图2B）。这可能是由于SLF衍生物的亲和力低于FKBP12，这与我们的计算建模结果一致（有关详细信息，请参见补充注释1）。我们对四种具有不同侧链化学型的化合物进行了一个额外的体内筛选，其中用Rapalink-1和候选化合物组合（分别为1和40 mg / kg）在大脑和骨骼肌组织中分别分析了MTOR信号传导。FK506（06-041）的吡啶N-氧化物衍生物保护外周组织免受Rapalink-1的影响，但可以在大脑中对MTOR有效抑制（扩展数据图3）。因此，我们选择了该化合物进行进一步研究，并将其称为“ Rapablock”（图2C）。

　　Rapablock和Fk506与具有可比亲和力的FKBP12结合（图2D；抑制常数（Ki）：3.1 nm和1.7 nm），但与FK506不同，Rapablock没有表现出钙钙蛋白酶的任何抑制活性（图2E）。在培养的细胞中，Rapablock不会自身影响MTOR信号传导（高达10 µM），而要以剂量依赖性方式减弱Rapalink-1的药理作用（图3A）。Rapablock在阻断雷帕霉素方面似乎更有效，将磷酸-S6信号恢复到与未处理的细胞相同的水平，在100：1化学计量时（图3D）。Rapablock对FKBP12的高亲和力对于其阻断活性至关重要 - apababrock的结构类似物，其与FKBP12的结合100倍，无法通过Rapalink-1挽救MTOR抑制作用（扩展数据图4）。

　　由于MTOR信号在驱动细胞生长中的重要作用34，我们询问Rapablock是否可以防止Rapalink-1介导的体外抑制T细胞增殖。我们在存在不同浓度的Rapalink-1和Rapablock的情况下，用抗CD3和抗CD28抗体刺激了人外周单核血细胞（PBMC），并在5天后评估了细胞增殖。而Rapalink-1在纳摩尔浓度下有效抑制PBMC的增殖，而Rapablock的添加消除了这种效果，将IC50转移了超过100倍以上（图3B）。我们还观察到与单独用Rapalink-1治疗的细胞共同处理的与Rapalink-1和Rapablock共处的细胞中累积IL-2释放高（图3C）。与我们对MTOR信号传导的观察一致，Rapablock似乎更有效地保护PBMC免受雷帕霉素介导的生长抑制作用（图3E，F）。总之，这些数据表明，通过竞争性结合细胞内FKBP12，Rapablock使Rapalink-1和雷帕霉素无法抑制MTOR。

　　要检查Rapalink-1和Rapablock的组合是否允许大脑特异性抑制体内MTOR的抑制作用，我们将健康的BALB/CNU/NU小鼠与Rapalink-1（每千克1 mg）（每公斤1 mg）或Rapalink-1（每千克1毫克）（每千克1 mg）和Rapablock（每千克）和24 iNsuped MTOR（40 mg）（40 mg）（40 mg）（40 mg）（40 mg）（40 mg）（40 mg）（40 mg）（40 mg）（40 mg）（40 mg）（40 mg）（40 mg）（40 mg）（40 mg）（25）通过免疫印迹解剖组织（图4A和扩展数据图5）。Rapalink-1当用作单一药物时，有效抑制骨骼肌和脑组织中的MTOR信号传导，如S6和4EBP1的磷酸化降低所示。但是，Rapalink-1和Rapablock的组合表现出显着的组织特异性作用。尽管仅与仅用Rapalink-1治疗的小鼠相当地抑制大脑中的MTOR活性，但骨骼肌中MTOR活性并未抑制。这种组织特异性使我们能够在慢性治疗中抑制小鼠脑中的MTOR活性，而没有MTOR抑制剂的常见靶向副作用，例如体重减轻，葡萄糖代谢受损和肝脏毒性35。

　　Rapalink-1已显示在胶质母细胞瘤的原位小鼠模型中有效，但是外围MTOR抑制并不有助于功效。我们询问我们的组合方案是否缺乏抑制周围组织中MTOR活性的能力，可以保留Rapalink-1在治疗胶质母细胞瘤中的疗效。我们建立了在裸鼠中表达萤火虫荧光素酶的U87MG细胞的颅内异种移植物，并用腹膜内注射Rapalink-1（每公斤1 mg），Rapablock（每公斤40 mg）或每5天的组合对这些小鼠进行处理。所有处理均可耐受性良好，并且没有观察到体重的显着变化（图4B和扩展数据图6a）。Rapalink-1是单一药物或与Rapablock结合使用的，可显着抑制肿瘤的生长和提高的生存率，而仅Rapablock对此也没有显着影响。接下来，我们用GBM43的颅内异种移植物（一种高度侵略性的患者衍生的胶质母细胞瘤模型36）测试了我们的治疗策略。尽管没有任何条件抑制肿瘤的快速生长，但Rapalink-1（每公斤1.2 mg）和Rapablock（每公斤60 mg）的组合赋予了生存益处（图4C和扩展数据图6B）。

　　在建立了一种实现大脑特异性抑制MTOR的二元治疗方法之后，我们想知道是否可以将相同的策略适应其他脑限制药理学的药物。一个关键的挑战是，要采用这种方法，“主动”组件（例如，Rapalink-1）必须取决于FKBP12的可用性。具有该特性的毒品很少见；除了雷帕霉素和FK506以外，很少有人知道。我们先前对Rapalink-1（图1）和Rapatamra（图1的扩展数据）进行了研究，这使我们假设由FKBP12结合部分组成的其他双功能分子和激酶抑制剂部分可能是有条件的，并且可以有条件地有效，并且可以通过Rapapablock进行调节。

　　我们首先用GNE7915（一种富含亮氨酸的重复激酶2（LRRK2））GNE7915测试了我们的假设，该假设在临床前研究中用于治疗帕金森病37。由于LRRK2的功能收益突变与帕金森氏病的遗传和零星形式密切相关，因此LRRK2激酶抑制作用已被作为一种潜在的治疗策略38,39。然而，最近的研究表明，使用小分子抑制剂诱导的II型肺炎细胞的细胞质液泡抑制了全身性LRK2抑制作用，提出了这些化合物的潜在安全责任40,41。我们通过化学将FK506和GNE7915的药算归与哌嗪组合成FK-GNE7915（图5A）。在体外LRRK2激酶测定中，FK-GNE7915是GNE7915的下抑制剂（图5C；分别为107 nm和3.0 nm的IC50； IC50），尽管其活性通过在测定中包括10 µM FKBP12（IC50 nm的IC50）来增强。然而，在我们将磷酸化磷酸-LRK2（S935）水平定量为LRRK2抑制的标记的细胞测定中，FK-GNE7915比母体化合物GNE7915更有效，超过十倍以上（图5d; IC50; IC50; IC50; IC50 nm和81 nm和81 nm）。这两个结果的并置表明FK506部分在FK-GNE7915的细胞效力中起作用。我们认为，高亲和力FK506-FKBP12相互作用可以促进与Rapalink-1相似的FK-GNE7915的细胞内积累，并使用双功能荧光探针：FK-TAMRA（扩展数据图7）证实了这一点。此功能使我们能够通过控制FKBP12的可用性来编程LRRK2抑制。用100 nm FK-GNE7915处理的磷酸-LRRK2（S935）水平降低至基础水平的15％，而100 nm FK-GNE7915和1 µM Rapablock的组合对LRRK2活性没有影响（图5E）。

　　GNE7915成功地转换为依赖FKBP的LRRK2抑制剂，只需将其链接到FK506片段，就促使我们评估了该策略的通用性。我们探索了正在研究中CNS疾病的几种激酶抑制剂：dasatinib（SRC家族激酶抑制剂的胶质母细胞瘤）42,43，lapatinib（胶质母细胞瘤的EGFR/HER2抑制剂）44,45和prostetin（MAP4K4 K4 K4抑制剂）和Alz Al抑制作用46。在所有三种情况下，将激酶抑制剂与FK506进行化学联系起来产生的双功能分子，这些分子保留了亲本分子的激酶抑制活性（扩展数据图8-10）。对于FK-Dasatinib，我们还使用生化（Invitrogen Selectscreen激酶分析；补充表1）和活细胞激酶分析47检查了其靶标特异性。47。在据报道的达舍尼靶标中，dasatinib和fk-dasatinib均受到SRC家族激酶的有效抑制，而一些酪氨酸激酶（例如，DDR2）对这两个抑制剂均表现出不同的敏感性（扩展数据图8C）。尽管它们具有较大的分子量，但这些双功能分子在具有与母体化合物相当的效力的细胞中活跃，并且对Rapablock失活的敏感。尽管这些示例代表了具有潜在的CNS疾病适应症的一组有限的激酶抑制剂，但可以想象，可以通过可编程药理学类似地配置更多的药物而不会失去细胞效力。