如前所述25，制备了左旋左心室小鼠肌原纤维。通过在4°C下以3,000克离心2分钟来收集肌原纤维，然后用两次洗涤前弹性缓冲液洗涤（100 mm TES pH 7.1，70 mm kcl，10 mm gluthatione，降低胶状，7毫米MGCL2，7毫米mgcl2，25 mm Egta，Egta，20μmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm，，5％dextran，5％dextran t500 00）。为了准备下跌，将预省的缓冲液替换为最终放松缓冲液（预省缓冲液加5.5毫米ATP）。然后使用Vitrobot（Thermo Fisher Scientific）将松弛的肌原原纤维冷冻到量化的Au R2/2 Sio2 200网格网格中。将肌原纤维悬浮液在25°C的网格上孵育，湿度100％孵育30 s，从碳层的另一侧孵育30 s，然后浸入液态乙烷 - 丙烷混合物中。

　　根据先前描述的协议16,24,25，使用AquiLos 2 Cryo-Fib扫描电子显微镜系统，使用AquiLos 2冷冻FIB扫描电子显微镜系统的制备用于冷冻数据获取的薄片进行制备，该协议的范围为16,24,25，目的是以180 nm（90 nm）为250 nm（范围为250 nm）。数据采集​​是使用Titan Krios透射电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）进行的，该电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）配备了K3检测器和能量过滤器（GATAN）。以标称放大倍数为×6,700，以识别薄片中的肌原纤维概述图像，以识别C区区域。

　　以×81,000名称放大倍数为目标的倾斜系列。在最终厚细丝重建的快速傅立叶变换中，使用143.3Å峰校准了像素尺寸（从M频带到C区域；扩展数据图4A，C）。在采集期间，以2.5°的增量相对于lamella平面，倾斜范围为-50°至50°。样品的总剂量为每平方Ångström的总剂量为120至160个电子。使用-3至-6 µm之间的散焦获取倾斜系列。使用SeriaLem53获取所有图像和总共89个断层图。

　　在WARP54中进行了运动校正和对比度传递函数估计；在IMOD55中进行了倾斜系列对齐。最终的断层图重建和小图提取是在经线中进行的。将断层图划入0.92 nm的像素大小并以60Å的速度过滤它们后，我们使用sphire-cryolo56拾取和追踪厚的丝和薄丝（扩展数据图1A，b）。数据集的平均肌节长度为2.326 µm（S.D. = 0.11 µm，n = 45），表明肉瘤没有超额合同。在我们分割的两个断层图中，1.95：1（102个细丝，53厚的细丝）也支持这一点。

　　将跟踪的细丝以18Å的段距离重新采样，导致提取365,971个子图的盒子大小为293.5Å（128像素，binning 2）。使用自定义的脚本，将每个子图形图旋转以使用跟踪中的先前角度平行于X – Y平面的细丝。然后，通过ISAC57,58,59投影并将100片的中央平板作为2D分类的输入。丢弃了未显示细丝的明显存在的类，其余部分被重新提取为亚图图，并通过金标准数据集拆分在Relion 3.1（参考文献60,61）中进行处理。最初的螺旋重建导致了14.3-Å分辨率图（0.143 FSC标准），升高为27.4Å，扭曲-167.2°（扩展数据图1）。使用自定义脚本删除重复的颗粒后，用两个不同的掩模进一步完善了100,447个子图，以覆盖薄丝的整个密度，或者仅包括F-肌动蛋白密度。完整的细丝（F-肌动蛋白和肌球蛋白）通过螺旋重建进行了完善，并达到8.2Å的分辨率，而单独的F-肌动蛋白的细化产生了8.3-Å分辨率的图。对于细丝图和F-肌动蛋白图，我们分别应用了-200和-100的B因子。在Chimerax62中对齐两个地图，并将蛋白质数据库模型6KN7（参考文献63）的单个链放在密度下，并用刚体拟合。使用自动分子动态柔性拟合64，用NAMDINATOR改善了肌球蛋白的盘绕线圈的模型。最终的复合图（扩展数据图3A）是通过使用颜色区域和Chimerax中的Splitbyzone功能从单独的F-肌动蛋白重建的F-肌动蛋白和完全薄丝重建的Tropomyosin创建的。

　　将跟踪的厚的细丝用130Å的段距离重新采样，导致提取67,492个亚图的插图，盒子尺寸为1,280Å（160像素，像素尺寸为8Å）。使用400Å的中央板进行了类似于薄丝处理的2D分类，导致37,118个高质量的颗粒被重新提取为亚图形图。3D分类和细化和螺旋重建（430Å，0°扭曲）解决了四个类别，这些类别显示了Crown 2的不同取向。A类显示了“投影” IHMS，B类具有构象的混合物，使Crown 2 IHMS的模糊密度与CROWN 2 IHMS，C级C级，C级C级显示“ retractivated” crounted c retactation c retancted'ihms iHMS（Extended'ihms（Extended Dagation）。精制坐标用于使用144像素的盒子大小和4Å的像素大小单独重新提取三类。通过使用无特征缸作为初始参考的金标准数据集分裂，将单个类通过3.1进行了完善，并使用Artiax65将其坐标映射到横向图中。B类显示在细丝中组织的颗粒，但随机分布在M线上。A类后来作为从皇冠A8到A12的段解决（CMYBP-C条纹2；扩展数据图1G），显示出肌节内的独特分布，将其定位为与M线相似的一系列粒子，与M线相似，大约200 nm。后来，我们了解到，冠冕2是A级螺旋平均水平的冠状A5和A8。事实证明，尽管所有冠2的β角度约为 +30°，但牙冠A5和A8的β角度约为-25°，解释了为什么在施加的螺旋形的对称性的细化过程中“投影”类别脱颖而出（扩展数据图7b，c）。由于我们可以确定沿厚细丝A类的位置，因此我们编写了一个定制脚本来计算“轴向移动的坐标”：从已知的锚点开始， 我们计算了下一个厚细丝段的3D坐标，转移A类坐标43 nm z-wards和43 nm m-wards（扩展数据图1F，H）。这使我们能够为每个厚的细丝部分解决不同的重建。通过这种策略，我们逐渐解决了厚丝的八个结构，从M频段到titin C型超级重复2，在C区域中（扩展数据图1）。由此产生的3D地图显示出在同一地图的不同区域内的分辨率差异很大，导致更灵活的区域过度分离。因此，我们使用locspiral66来提高地图可解释性。所有重建均显示出三倍的旋转轴，因此用C3对称性进行了完善。M频段的重建进一步揭示了两个正交的两倍旋转对称轴，它们以60°的角度在三倍的轴上相交，后来涂上D3对称性。

　　为了构建最终的复合图，将重建的功率谱使用Relion_image_handler61标准化，并将15 px（约60Å）的软圆柱掩模应用于所有地图。使用每个Voxel处的最大值（colume Add，最大值最大值），在Chimerax中对准过滤后的重建（拟合在地图中），并通过合并不同段的密度来创建最终地图。为了获得可以用来追踪肌球蛋白尾巴的连续且均匀的密度，我们对CMYBP-C的最后五个条纹进行了18-Å的重建，并用Relion_image_handler（430Å，0°扭曲）外推了200 nm长的螺旋。

　　厚丝的模型是使用先前可用的模型和Alphafold2预测的组合建立的。28。对于肌球蛋白II的模型，我们从人类β-核心重霉素的IHM（蛋白质数据库条目5TBY;参考文献27）开始，而使用Mus Musculus的MyH7的Alphafold2预测尾巴（约50个氨基酸的氨基酸序列（约250个氨基酸，约有20个氨基酸，具有20个氨基酸）。同样，使用M.Musculus的MyBPC3的最后590个氨基酸预测CMYBP-C的C末端结构域。从结构域A101到M3（氨基酸24,760–32,350）的Titin区域被提交，以预测为多个条目（每个条目（每个≈950氨基酸）），并具有重叠的末端结构域。TITIN的AlphaFold2预测导致了独特的结构动机（例如，TK-M1，C型超级重复域1至3，C型超级重复域7至9和CMYBP-C C8 – C8）和CMYBP-C C8 – C9）明确地决定了Titin域的寄存器和位置。该模型在TITIN结构域和9个CMYBP-C条纹中达到顶峰，与M线的距离距离距离，这与先前发表的免疫电子显微镜数据一致（例如，Titin域A77-78，A77-78，A80-82，A153，A153，A165，A165和CMYBP-C C7域）15,18。这些模型最初是使用刚体拟合在地图中构建的，后来在NAMDINATOR64中使用多个回合的分子动态柔性拟合进行了调整，从40-Å低通滤波的密度开始，并使用高分辨率图逐渐使用。通过克隆从皇冠A15到A17的型号获得了从冠A18到A28的模型。对于图2A中的可视化，我们使用了标准偏差= 3的Chimerax函数ColorbyZone，SplitbyZone和Gaussian滤波器。Chimerax照明设置为如下：软强度0.1；方向0.577，-0.577， -0.577;颜色100、100、100;填充强度0.5;填充 - 0.81，-1,1;填充100,100,100;环境强度1.4;AmbientColor 100,100,100;阴影1;优质的质量；DepthBias 0.01;Multishadow 64;MSMAPSIZE 2000;msdepthbias 0.004;WithCamera 1;Depthcue0。Chimerax卡通风格的设置如下：宽度2.5；厚1;Xsection椭圆形链宽3.2;Xsection Rect线圈宽3.2;厚度1.2。Chimerax调色板如下：厚细丝芯＃707EC1；皇冠1＃7ED5DC;皇冠2＃7EA6DC;皇冠3＃7EDCB4;基本轻链＃E154D8;监管轻链＃9A41DE;肌球蛋白堵塞头＃55667E;无肌球蛋白的头＃ace2ff;titin-α＃D95D87;titin-β＃dc7ea6;TK＃844B63;M1-9＃EAB1C9;M波段蛋白质-A＃546845;M频段蛋白B＃A8D18A;cmybp-c＃dec98f;f-actin＃a8d18a;Tropomyosin A＃D1A8A8;Tropomyosin B＃D1A8BD;Troponin＃A8A8D1。

　　为了定量描述每个冠的3D排列，将厚的细丝建模为圆柱体，并将肌球蛋白IHM表示为三角形。三角形的顶点由三个点的坐标确定：自由头部的ATP结合位点，封闭的头部的同一位置和头 - 尾连接位点。对于每个IHM，在3D欧几里得空间中计算出Euler角度，其原点在三角形的质心上，X轴平行于切向圆柱体，Y轴平行于半径，Z轴平行于与圆柱体的轴平行。计算每个IHM的坐标系，以获得每个冠的特定于欧拉角（α，β和γ）（扩展数据图7a）。为了获得方位角，半径和z轴高度，我们使用了每个IHM的质心，分别计算了圆柱坐标和推断的扭曲，径向距离和上升（扩展数据图7D）。

　　为了量化肌球蛋白尾巴的弯曲度，对于每个尾巴，我们首先获得了盘绕线圈中两个氨基酸链的α-碳碳的原子坐标。然后，我们追踪了一条新的3D曲线，穿过每对α-碳夫妇之间的中心点。对于每个曲线段，我们通过曲线C的长度与末端之间的欧几里得距离的比例计算出尖曲度s。

　　然后，正弦压缩百分比（SCP）由：

　　为了描述肌膜组件的3D组织，我们选择了两个代表性的断层图（图1A和4A以及补充视频1和2），并使用Cryo-Care67将它们剥落。使用自定义的脚本，我们使用其相应结构的二进制掩码映射了每个子图，与从3D改进获得的坐标和方向匹配。由此产生的二进制MRC文件是在Dragonfly68中导入的，并用作断层图的伪分段的模板。通过检查每个断层扫描的未分配密度，并进一步追踪在细化过程中平均的柔性组件（即CMYBP-C链接从厚细丝到细丝），从而手动验证了所得的标签层。在清晰地识别和分割了我们的断层图中的76个CMYBP-C链路之后，我们使用C7域的位置作为枢轴点，测量了该链接相对于厚细丝Z轴的角度。角度分布绘制在GraphPad Prism中。

　　TK结构域的片段包含人类TTN转录物变体-IC（NM_001267550.1），残基33812–34076，在带有N末端HIS6标签的融合中的大肠杆菌BL21 [De3]细胞中表达。从包含物体中提取不溶性片段，该碎片由8 m尿素，50 mM磷酸钾pH 8.0，0.5％Tween 20（缓冲液B）通过Sonication，用Branson Sonifier Microtip在冰上进行超声处理。在15,000 R.P.M.在SA 600转子（Sorvall）中持续20分钟，并将可溶性上清液应用于缓冲液中平衡的Ni-NTA色谱柱。在缓冲液B中洗涤以上的柱子后，用250 mm咪唑在缓冲液B中用250 mm咪唑在6、4、4、4、4、4、4、2和0 MMMMMMMMM HEPER中逐步进行了平衡，并平衡二硫代醇和0.1％Tween 20（缓冲液C）。向下旋转不溶性沉淀物，并通过在缓冲液C中平衡的Pharmacia Superose 12色谱柱上进一步纯化可溶性蛋白。将纯化的激酶片段用于商业兔免疫，并在三个助球注射后收集血清。

　　对于亲和力纯化，使用了可溶性TK构建体A170-激酶。将大鼠替汀A170（FN3）和激酶结构域（XM_0087775521.1残基31897–32344）的序列克隆到经过修改的PCDFDUET载体中，该载体使用E. coli菌株BL21 [DE3]中表达的N-末端His-TAG，该端子含有N-ensinal His-TAG，并使用标准的尺寸[DE3] - DE3] - DE3] - DE3] - DE3] - DE3] -参考。69。

　　将1毫克纯化的A170-激酶透析透析为偶联缓冲液（100 mm磷酸钠pH 8，250 mm NaCl，1 mm二硫代醇），然后偶联至2 mL NHS NHS活化的Sepharose 4快速流动slurry，遵循制造商的指示（Cytiva life）（cytiva life）（cytiva life）。使用先前描述的标准程序进行抗体亲和力纯化70。Following equilibration with 10 ml PBS with 0.05% Tween 20, 5 ml of the rabbit anti-kinase serum was applied to the A170-kinase–Sepharose column, which was then washed with 20 ml PBS containing 0.05% Tween 20, 4 ml PBS and finally 4 ml 50 mM NaH2PO4 pH 7.4, 500 mM NaCl to remove nonspecifically bound proteins.然后将结合的抗体用0.5 ml 0.1 m甘氨酸HCl pH 3的馏分洗脱至1 ml 1 ml 1 M tris HCl pH 9，其中含有蛋白质的蛋白质，透析成5 mM NAN3，浓度为5 mM NAN3，浓缩至50 µmg ml-1，在50 µml-ll-ll Aliquots中闪光下，并在50 µml aLiquots和Store courdec中cous couss od-80°C。通过对包含激酶和对照片段的各种钛片的蛋白质印迹证实了纯化的免疫球蛋白的比反应性。

　　如前所述，使用亲和纯化的TK抗体在1 µg mL-1和Atto647N标记的抗兔IgG IgG二级抗体以可视化的情况下，在小鼠和兔PSOAS肌原纤维上进行了免疫荧光标记。刺激的发射耗尽显微镜在附着在Leica TCS SP5 LL共聚焦显微镜上的StedyCon（Abberior）上进行。图像以15 nm的像素大小记录。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。